楊克凡，范麗霞，彭悅霞，王 琴，陶 亮

(中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，廣東 廣州 510080)

◇論 著◇

漆黃素通過(guò)縫隙連接影響順鉑細(xì)胞毒性

楊克凡，范麗霞，彭悅霞，王 琴，陶 亮

(中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，廣東 廣州 510080)

目的 體外觀察漆黃素對(duì)順鉑細(xì)胞毒性作用影響及其機(jī)制。方法 CCK-8法觀察不同濃度漆黃素對(duì)人膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的毒性；用細(xì)胞接種熒光示蹤法測(cè)定不同濃度漆黃素對(duì)U87細(xì)胞縫隙連接(GJ)功能的影響；標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞集落形成分析法觀察順鉑的毒性及漆黃素對(duì)順鉑毒性的影響；用Western blot法研究漆黃素在影響GJIC(GJ intercellular communication)功能濃度范圍內(nèi)對(duì)Cx43表達(dá)的影響。結(jié)果 CCK-8法顯示漆黃素在小于1 μmol·L-1的濃度范圍內(nèi)無(wú)細(xì)胞毒性；細(xì)胞接種熒光示蹤法顯示漆黃素濃度越高，U87細(xì)胞GJ通訊的熒光傳遞功能越強(qiáng)；標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞集落形成分析法顯示，20 μmol·L-1順鉑能夠抑制U87細(xì)胞的集落形成，而且在有GJ形成的細(xì)胞順鉑對(duì)細(xì)胞集落形成的抑制作用顯著高于無(wú)GJ形成的細(xì)胞；Western blot結(jié)果顯示漆黃素對(duì)Cx43蛋白表達(dá)量無(wú)明顯影響。結(jié)論 漆黃素可以增強(qiáng)順鉑的細(xì)胞毒性，該作用可能與漆黃素增強(qiáng)U87細(xì)胞的GJ通訊功能有關(guān)，與Cx43蛋白表達(dá)水平變化無(wú)關(guān)。

漆黃素；黃酮類；順鉑；縫隙連接；縫隙連接通訊；縫隙連接蛋白Cx43；U87

細(xì)胞縫隙連接(gap junction, GJ)是細(xì)胞之間的一種蛋白質(zhì)連接通道，由2個(gè)半通道，也叫連接子(connexons)組成，6個(gè)連接蛋白(connexin)可以組成1個(gè)連接子。GJ作為一種重要的連接通道，在相鄰細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中分子量<1 ku的物質(zhì)(如離子、細(xì)胞信號(hào)分子和代謝物質(zhì)等)的交換中起到重要作用。根據(jù)分子量的不同可區(qū)分不同的連接蛋白，其中Cx43作為人體分布最廣泛的一種連接蛋白，在人體的多種組織細(xì)胞中都有表達(dá)[1]。已有的研究證明，GJ能夠增敏順鉑等化療藥物的抗腫瘤作用[2-3]。提示順鉑的細(xì)胞毒性可以由對(duì)GJ功能有增強(qiáng)作用的藥物來(lái)提高。廣泛分布于植物界的黃酮類化合物，具有消炎、抗腫瘤、抗菌等多種生物活性[4-5]。常見(jiàn)的黃酮類化合物有芫花中的芹菜素(apigenin)、金銀花中的木犀草素(luteolin)、銀杏中的山奈素(kaempferide)和槲皮素(quercetin)、桔子中的桔皮素(tangeritin)等。其中有研究表明，芹菜素和桔皮素具有消炎、抗腫瘤等多種作用[6]。漆黃素(fisetin)又稱非瑟素、非瑟酮，屬于天然的黃酮類化合物，天然存在于漆科植物木蠟樹的木材。文獻(xiàn)報(bào)道其具有抗菌、抗炎、抗腫瘤等多種藥理作用[7]。但漆黃素對(duì)GJ功能及Cx蛋白表達(dá)的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。因此可以研究這種藥物對(duì)順鉑的細(xì)胞毒性及GJ功能的影響，并探討其機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 試劑漆黃素購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢驗(yàn)所；Tris、抗HA抗體購(gòu)自Sigma-Aldrich公司；HRP標(biāo)記的羊抗小鼠二抗、硝酸纖維素膜(NC膜)購(gòu)自Amersham； ECL-plus化學(xué)發(fā)光劑購(gòu)自GE公司、BSA蛋白定量試劑盒、丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺購(gòu)自Bio-rad；DMEM干粉、胰酶(typsin)、青、鏈霉素(penicillin-steptomycin)購(gòu)自Gibco；CCK-8試劑盒(WST-8)購(gòu)自日本Dojindo公司；Calcein-AM購(gòu)自Molecular Probes；順鉑(cisplatin)、二甲亞砜(DMSO)購(gòu)于Sigma-Aldrich公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87[8]培養(yǎng)于高糖DMEM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清，1%青霉素、鏈霉素)中，在37℃、5% CO2及飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)。

1.3 CCK-8法測(cè)定藥物的細(xì)胞毒性U87細(xì)胞計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞密度為1×109cells·L-1，按每孔100 μL加入96孔板中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后加入不同濃度藥物作用4 h后，每孔加入10 μL CCK-8[9]溶液，繼續(xù)置于37℃、5% CO2及飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)3 h后用酶標(biāo)儀在450 nm處檢測(cè)OD值。所有實(shí)驗(yàn)孔、空白孔、對(duì)照孔均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每個(gè)實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

細(xì)胞存活率/%=(實(shí)驗(yàn)組OD-空白組OD)/(對(duì)照組OD-空白組OD)×100%

1.4 細(xì)胞接種熒光示蹤法檢測(cè)縫隙連接功能將熒光指示劑Calcine-AM與表達(dá)Cx的U87細(xì)胞共同孵育，Calcine-AM可進(jìn)入細(xì)胞，即供體細(xì)胞，將該細(xì)胞接種到不同濃度藥物處理并已生長(zhǎng)融合的細(xì)胞中，4 h后，待形成穩(wěn)定GJ后用熒光顯微鏡觀察。計(jì)數(shù)一個(gè)供體細(xì)胞周圍含有Calcine綠色熒光的受體細(xì)胞作為GJ功能指標(biāo)[10]，統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)組平均每個(gè)供體細(xì)胞周圍發(fā)綠色熒光的受體細(xì)胞個(gè)數(shù)與對(duì)照組進(jìn)行比較得出相對(duì)數(shù)。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞集落形成分析法測(cè)定U87細(xì)胞的細(xì)胞集落形成順鉑的毒性指標(biāo)可以通過(guò)細(xì)胞集落形成率[2]的降低來(lái)測(cè)定。有GJ形成的細(xì)胞和無(wú)GJ形成的細(xì)胞可由不同密度接種細(xì)胞的方法獲得，按每孔1×106cells加入6孔板中培養(yǎng)至生長(zhǎng)融合，作為有GJ形成的實(shí)驗(yàn)組；而無(wú)GJ形成的細(xì)胞可由每孔1×103cells加入6孔板中培養(yǎng)形成，此時(shí)細(xì)胞未生長(zhǎng)融合。以上細(xì)胞中加入藥物預(yù)處理4 h，再聯(lián)合20 μmol·L-1順鉑共同作用1 h后用PBS洗細(xì)胞，每組取1×103個(gè)細(xì)胞重新接種于6孔板7 d后測(cè)定細(xì)胞集落形成率。

存活比=處理組的細(xì)胞集落數(shù)/對(duì)照組的細(xì)胞集落數(shù)

1.6 Western blot檢測(cè)Cx43蛋白表達(dá)用不同濃度藥物作用于表達(dá)Cx43的U87細(xì)胞4 h后，用Western blot方法檢測(cè)Cx43蛋白的表達(dá)。細(xì)胞融合至90%時(shí)棄掉培養(yǎng)液，經(jīng)冷PBS洗3遍后加入適量細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，用細(xì)胞刮匙將細(xì)胞刮下后超聲破碎細(xì)胞，再于4℃、12 000 r·min-1離心30 min，取上清，采用Bio-rad DC assay法進(jìn)行蛋白定量。取定量后的蛋白25 μg上樣至10% SDS-PAGE凝膠中進(jìn)行電泳分離，轉(zhuǎn)膜至NC膜，5%脫脂奶粉/TBST封閉40 min，一抗為Cx43抗體(1 ∶3 000)，二抗為羊抗鼠抗體(1 ∶6 000)，使用凝膠成像系統(tǒng)照像記錄，然后用ImageJ軟件分析條帶灰度[3]。

2 結(jié)果

2.1 藥物的細(xì)胞毒性為了研究漆黃素自身的細(xì)胞毒性或細(xì)胞增殖作用對(duì)GJ功能影響，首先用CCK-8法檢測(cè)不同濃度藥物對(duì)U87細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，然后選擇對(duì)該細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)影響的藥物濃度做進(jìn)一步研究。Fig 1中結(jié)果顯示，漆黃素在0～1 μmol·L-1時(shí)對(duì)U87細(xì)胞生長(zhǎng)均無(wú)抑制作用(P>0.05)；10、100 μmol·L-1時(shí)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有明顯抑制作用(P<0.05)。

Fig 1 Cytotoxic effect of fisetin on U87 cells expressing ±s)

Surviving fraction of U87 cells after treatment with 0.1，1，10 and 100 μmol·L-1fisetin for 4 hours.*P<0.05vscontrol group.

2.2 漆黃素增強(qiáng)細(xì)胞縫隙連接功能結(jié)果顯示隨著漆黃素(0.001～1 μmol·L-1)濃度的增加，細(xì)胞間熒光傳遞作用增強(qiáng)。結(jié)果表明漆黃素可以增強(qiáng)U87細(xì)胞的GJ功能(Fig 2)。

2.3 漆黃素對(duì)順鉑細(xì)胞毒性的影響Fig 3中結(jié)果顯示高密度(生長(zhǎng)融合、形成GJ)細(xì)胞和低密度(生長(zhǎng)未融合、無(wú)GJ形成)細(xì)胞與20 μmol·L-1順鉑作用1 h，均能夠明顯降低U87細(xì)胞的集落生成率。與單用順鉑組相比，在高密度接種細(xì)胞，漆黃素能明顯降低順鉑處理后細(xì)胞集落形成率(P<0.05)，而在低密度接種細(xì)胞中，漆黃素不影響順鉑處理后的細(xì)胞集落形成率(P>0.05)。結(jié)果表明，在無(wú)GJ形成的細(xì)胞，漆黃素不影響順鉑的細(xì)胞毒性；在有GJ形成的細(xì)胞，漆黃素能明顯增強(qiáng)順鉑的細(xì)胞毒性。

2.4 漆黃素對(duì)Cx43蛋白表達(dá)的影響通過(guò)Western blot研究漆黃素是否影響Cx43蛋白的表達(dá)。Fig 4表明不同濃度的漆黃素(0.001～1 μmol·L-1)作用4 h不影響Cx43表達(dá)。

3 討論

Cx43是在人體中分布最廣泛的一種縫隙連接蛋白，人體的多種組織細(xì)胞中都有Cx43的表達(dá)。Sato等[11]發(fā)現(xiàn)在間皮瘤細(xì)胞中Cx43所組成的GJ能夠顯著增強(qiáng)順鉑的細(xì)胞毒性，另有Peterson-Roth等[12]發(fā)現(xiàn)Src可通過(guò)Cx43來(lái)改變順鉑的細(xì)胞毒性，本次研究中細(xì)胞集落形成分析法的結(jié)果也顯示順鉑的細(xì)胞毒性在有GJ形成時(shí)明顯增強(qiáng)。因此，當(dāng)腫瘤細(xì)胞間的GJ功能增強(qiáng)時(shí)，可以增敏化療藥物的細(xì)胞毒性；反之，降低GJ功能則會(huì)抑制化療藥物的細(xì)胞毒性。

A. The dye spread of U87 cells in control group (200×). B, C, D, E: The dye spread of U87 cells in fisetin group (200×)，(B, fisetin 0.001μmol·L-1; C, fisetin 0.01μmol·L-1; D, fisetin 0.1μmol·L-1; E, fisetin 1μmol·L-1). F: The normalized enhancement of dye coupling through gap junctions treated with 0.001, 0.01, 0.1, 1μmol·L-1fisetin.*P<0.05vscontrol group.

Fig 3 Effect of fisetin on the cytotoxicity of ciplatin in U87 cells expressing ±s)

Clonogenic survival of Cx43-expressing cells treated with 20 μmol·L-1cisplatin at high and low cell density with fisetin.*P<0.05vscontrol group,#P<0.05vscisplatin group.

GJ功能受到多種水平的調(diào)節(jié)，快速調(diào)節(jié)包括改變單側(cè)通道的電導(dǎo)率或通道開放的概率，慢速調(diào)節(jié)則通過(guò)改變通道的數(shù)量來(lái)實(shí)現(xiàn)[13]。而對(duì)連接蛋白轉(zhuǎn)錄后調(diào)控則對(duì)GJ功能的調(diào)節(jié)起到重要作用[14]。漆黃素已有文獻(xiàn)報(bào)道其抗腫瘤作用[7-15]，但并未研究這兩種藥物對(duì)于GJ功能的作用。本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示漆黃素(0.001～1 μmol·L-1)可以隨著濃度增加，GJ功能增強(qiáng)。根據(jù)Western blot實(shí)驗(yàn)可知，漆黃素可能不是通過(guò)調(diào)節(jié)Cx43的表達(dá)水平來(lái)增強(qiáng)GJ功能。另外，實(shí)驗(yàn)中1、4、24、48 h的Western blot結(jié)果顯示Cx蛋白表達(dá)量也無(wú)變化。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，漆黃素可通過(guò)p38、p53等細(xì)胞死亡信號(hào)通路來(lái)增強(qiáng)順鉑的細(xì)胞毒性[16]，而尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道p38、p53等信號(hào)通路對(duì)Cx43表達(dá)有影響。我們將在今后的研究中探討漆黃素增強(qiáng)GJ功能的機(jī)制。

本研究首次證明了漆黃素能夠增強(qiáng)GJ功能及增敏順鉑細(xì)胞毒性：提示我們漆黃素的化療增敏作用可能是通過(guò)增強(qiáng)GJ功能而實(shí)現(xiàn)的，本研究為尋找以GJ為靶點(diǎn)的新型抗腫瘤藥物和化療增敏藥提供了理論基礎(chǔ)。

Fig 4 Effect of fisetin on the expression of Cx43 determined by Western ±s)

The figure shows that treating with fisetin(0.001～1μ mol·L-1) did not change Cx43 expression.

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Fisetin increases the cytotoxicity of cisplatin by enhancing gap junctional intercellular communication

YANG Ke-fan, FAN Li-xia, PENG Yue-xia, WANG Qin, TAO Liang

(DeptofPharmacology,ZhongshanSchoolofMedicine,SunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China)

Aim To investigate the effect of fisetin on the cytotoxicity of cisplatin and its mechanisms. Methods CCK-8 was used to assay the toxicity of fisetin. “Parachute” dye-coupling assay was used to examine dye spread through gap junctions in U87 cells. “Standard colony-forming assay” was used to examine cell survivals of U87 treated with cisplatin with fisetin. Western blot was performed to detect the expression level of Cx43. Results Fisetin had no cytotoxic effect on U87 cells at the concentration of 0～1μmol·L-1. Parachute assay demonstrated that fisetin enhanced dye-coupling through gap juntions in U87 cells. Standard Colony forming assay showed that cisplatin inhibited the clonogenic survivals of U87 cells and fisetin could enhance cisplatin-induced inhibitory effect of clonogenic survivals on cells with gap junctional formation more than on cells without gap junctional formation. Conclusion These rusults demonstrate that fisetin could increase the sensitivity of glioma cells to cisplatin through the enhancement of gap junctional intercellular communication but this may not be related to the expression of Cx43.

fisetin; flavonoids; cisplatin; gap junction; gap junctional intercellular communication; connexin 43;U87 glioma cells

時(shí)間：2015-3-3 11:08 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150303.1108.007.html

2014-11-22,

2014-12-29

新疆維吾爾自治區(qū)科技廳科技支疆項(xiàng)目(No 201233150)；國(guó)家自然科學(xué)基金-新疆聯(lián)合基金重點(diǎn)支持項(xiàng)目(No U1303221)；國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(No 81373439)

楊克凡(1990-)，男，碩士生，研究方向：細(xì)胞縫隙連接與疾病，E-mail：yangkf@mail.sysu.edu.cn; 陶 亮(1959-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：細(xì)胞縫隙連接與疾病，通訊作者，Tel：020-87332318，E-mail：taol@mail.sysu.edu.cn

10.3969/j.issn.1001-1978.2015.03.007

A

1001-1978(2015)03-0323-04

R284.1；R329.24；R341；R979.19