劉 亮，肖延風(fēng)，尹春燕，張衛(wèi)琴，3

（1.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部第二附屬醫(yī)院兒科，陜西西安 710004；2.西安市兒童醫(yī)院，陜西西安 710003；3.浙江大學(xué)附屬兒童醫(yī)院，浙江杭州 310003）

◇基礎(chǔ)研究◇

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在高脂飼料誘導(dǎo)幼年大鼠脂肪性肝損傷中的作用

劉 亮1，2，肖延風(fēng)1，尹春燕1，張衛(wèi)琴1，3

（1.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部第二附屬醫(yī)院兒科，陜西西安 710004；2.西安市兒童醫(yī)院，陜西西安 710003；3.浙江大學(xué)附屬兒童醫(yī)院，浙江杭州 310003）

目的研究內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在高脂飲食所致肝損傷中的作用及其機(jī)制。方法48只剛斷乳雄性SD大鼠，隨機(jī)分為高脂組和對照組。分別采用高脂飼料和普通飼料喂養(yǎng)，在第8、12、16周末測量體質(zhì)量、內(nèi)臟脂肪質(zhì)量及肝臟質(zhì)量；檢測血清肝功能；HE染色觀察肝臟病理變化；透射電鏡觀察肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)情況；RT-PCR法檢測兩組大鼠肝細(xì)胞內(nèi)活化轉(zhuǎn)錄因子6（ATF6）、糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）m RNA的表達(dá)。結(jié)果①高脂組大鼠體質(zhì)量和內(nèi)臟脂肪質(zhì)量明顯高于對照組（P＜0.05）。②高脂組谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）及谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）均隨時(shí)間延長輕度升高（P＞0.05），ALT在第16周與對照組有顯著差別（P＜0.05）。③HE染色光鏡下可見高脂組在第8周肝內(nèi)出現(xiàn)小泡性脂肪變性，12～16周時(shí)，肝臟脂肪變性進(jìn)一步加重。④電鏡下可見，8周時(shí)，高脂組大鼠肝細(xì)胞內(nèi)聚集大量脂滴，結(jié)構(gòu)基本清晰，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)基本正常；12周及16周，細(xì)胞內(nèi)脂滴增加，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)池內(nèi)可見線樣結(jié)構(gòu)沉積。⑤高脂組大鼠肝組織內(nèi)ATF6、GRP78 m RNA在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯著高于對照組（P＜0.05）。結(jié)論幼年高脂飲食可引起內(nèi)臟脂肪聚集、肝細(xì)胞脂肪變性及肝功損傷。高脂飲食誘導(dǎo)肝損傷的機(jī)制可能與ATF6介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激密切相關(guān)。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；肝損傷；幼年大鼠；高脂飲食；非酒精性脂肪性肝炎

近些年來，隨著社會的快速發(fā)展，肥胖越來越成為全球關(guān)注的疾病。全球范圍流行病調(diào)查表明，超過1億人群達(dá)到超重水平，肥胖占30%，超過10%學(xué)齡兒童達(dá)到超重［1］。隨著肥胖在全球的流行，肥胖伴發(fā)非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）的狀況也越來越受到關(guān)注。目前，NAFLD是最常見的慢性肝臟疾?。?-3］。NAFLD在普通兒童中的發(fā)病率為3%，而在肥胖兒童的發(fā)病率為80%［4］。NAFLD導(dǎo)致肝臟損害的主要病理表現(xiàn)為非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH），進(jìn)而發(fā)展為肝臟纖維化和肝硬化。肝細(xì)胞富含內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，為脂肪酸代謝的第一場所。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)含有大量的三酰甘油合成酶，在脂肪酸的代謝中有著重要的作用。并且，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是一個(gè)非常敏感的細(xì)胞器，當(dāng)受到刺激時(shí)，會出現(xiàn)錯(cuò)誤折疊與未折疊蛋白在腔內(nèi)聚集及細(xì)胞內(nèi)鈣離子平衡紊亂，稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）。近期文獻(xiàn)顯示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)平衡紊亂或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與脂肪肝向NASH的轉(zhuǎn)化和進(jìn)展［5］。本研究建立幼年大鼠高脂飲食模型，觀察高脂膳食對幼年大鼠肝臟脂肪變性及肝功能影響，采用RT-PCR方法檢測活化轉(zhuǎn)錄因子6（activating transcription factor-6，ATF6）、糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose regulated protein78，GRP78）mRNA在肝細(xì)胞的表達(dá)，探究其在高脂膳食誘導(dǎo)肥胖大鼠脂肪肝及肝損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1 動物飼養(yǎng)與分組購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動物中心剛斷乳SPF級的雄性SD大鼠48只，體質(zhì)量約為40～60 g。隨機(jī)分為高脂組和對照組，每組各24只。對照組給予無菌普通飼料，高脂組給予無菌高脂飼料。各組又分為8、12、16周組，每組8只。飼養(yǎng)室溫度22～24℃，光照8∶00～20∶00，自由進(jìn)食。普通飼料（普通清潔級動物基礎(chǔ)飼料）和高脂飼料（普通飼料+20%蔗糖+10%的豬油+5%蛋黃粉+1%的膽固醇）［6］。飼料由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動物中心加工制成。

1.2 標(biāo)本采集與制備分別在飼養(yǎng)8、12、16周留取標(biāo)本。前一天20∶00后禁食，次日晨先稱質(zhì)量，后用100 g/L水合氯醛按0.3 m L/100 g腹腔注射麻醉；心臟穿刺采集血液，用于肝功指標(biāo)測定；摘除肝臟稱質(zhì)量；切取1 mm3肝組織，25 g/L戊二醛初固定，于12 h內(nèi)送電鏡室制備電鏡標(biāo)本；取5 mm3肝臟組織2塊，液氮罐儲存，備用RT-PCR檢測；再取約1 cm3肝組織2塊，40 g/L多聚甲醛溶液固定、石蠟包埋，行HE染色。完整剝離雙側(cè)附睪脂肪和兩側(cè)腎周脂肪墊，稱質(zhì)量［5］。

1.3 HE染色摘除肝臟后，迅速肉眼觀察肝臟的色澤、觸摸質(zhì)地，將肝臟組織石蠟包埋，采用人工操作HE染色方法，常規(guī)脫蠟、染色、脫水、透明等操作后封片，顯微鏡下觀察、拍照并進(jìn)行圖像分析。

1.4 電鏡標(biāo)本制備肝臟組織塊依次在25 g/L戊二醛固定液和10 g/L四氧化鋨固定液4℃后固定；乙醇梯度脫水；然后浸入還氧丙烷置換；環(huán)氧樹脂Epon812浸透、包埋，聚合后制作半超薄切片（1～2μm），美蘭染色后在光學(xué)顯微鏡下定位，使用瑞典LKB-Ⅴ型超薄切片機(jī)進(jìn)行超薄切片（50～70 nm），醋酸鈾、檸檬酸鉛染色后，于日本日立H-600透射式電子顯微鏡下觀察、拍照。

1.5 血清學(xué)肝功能結(jié)果測定心臟穿刺采血，于4 000 r/min的低溫離心機(jī)上離心10 min，送至西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科使用自動生物分析儀（奧林帕斯，AU5400，日本）測定血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）。

1.6 RT-PCR檢測GRP78、ATF6 mRNA表達(dá)①提取RNA：采用RNAfast200總RNA急速抽提試劑盒提取肝組織的總RNA。取總RNA液于紫外分光光度計(jì)下測定其A260/280的值，選取A值在1.9～2.1間的總RNA溶液備用，并于-70℃冰箱儲存。②逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：采用Revert AidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒逆轉(zhuǎn)錄RNA。將合成的cDNA儲存于-70℃冰箱中，備用。③引物制備：ATF6、GRP78引物由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成，內(nèi)參GAPDH由陜西先鋒生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成。④PCR檢測：采用Dream TaqTMGreen PCR Master Mix進(jìn)行擴(kuò)增，待試劑盒中的試劑溶解后，輕輕混勻，并瞬時(shí)離心；取200μL無菌無酶的PCR管置于冰上，按以下順序加入反應(yīng)物：Dream TaqTMGreen PCR Master Mix（2×）12.5μL，F(xiàn)orward primer 1μL，Reverse primer 1μL，Template DNA 1μL，Water，nuclease-free 9.5μL；將混合物輕輕搖晃，并瞬時(shí)離心；置于PCR儀上，按下述條件進(jìn)行反應(yīng)：預(yù)變性95℃3 min×1 cycle，變性95℃30 s，退火55℃30 s×35 cycle，延伸72℃30 s，再延伸72℃5 min×1 cycle。⑤瓊脂糖凝膠電泳：放置制膠板，用移液器將上述擴(kuò)增好的樣本小心加入各點(diǎn)樣孔中，同時(shí)加入相同量的DNA Marker以識別樣本大小。電泳約40 min，在紫外燈下觀察結(jié)果，并使用凝膠成像系統(tǒng)拍照。⑥圖像半定量分析：使用Gel-Pro專業(yè)圖像分析軟件進(jìn)行掃描，測定產(chǎn)物條帶的積分吸光度（IA），并與相應(yīng)的內(nèi)參GAPDH的IA值相比，確定各目的基因mRNA在肝臟組織中的相對表達(dá)含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)資料的分析均使用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析處理。數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。采用Shapiro-Wilk檢驗(yàn)及Levene檢驗(yàn)檢測數(shù)據(jù)的正態(tài)性及方差齊性，根據(jù)情況，選擇t檢驗(yàn)或Mann-Whitney U檢驗(yàn)比較兩組均數(shù)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組大鼠體質(zhì)量的比較高脂組大鼠體質(zhì)量從第5周開始顯著高于對照組（P＜0.05，圖1）。第14周開始，兩組大鼠體質(zhì)量均增長較慢，呈現(xiàn)“平臺期”，雖然高脂組大鼠的體質(zhì)量仍然較高，但與對照組已沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖1）。

2.2 兩組大鼠內(nèi)臟脂肪質(zhì)量的比較第8、12、16周兩組大鼠的內(nèi)臟脂肪質(zhì)量比較，高脂組大鼠內(nèi)臟脂肪質(zhì)量均顯著大于對照組（P＜0.05，圖2）。

2.3 兩組大鼠血清肝功能指標(biāo)的比較高脂組谷丙轉(zhuǎn)氨酶及谷草轉(zhuǎn)氨酶水平隨著時(shí)間的延長呈逐漸升高趨勢，谷丙轉(zhuǎn)氨酶在第16周時(shí)與對照組有顯著差別（P＜0.05，圖3）。

圖1 兩組大鼠體質(zhì)量的比較Fig.1 Comparison of body weight of young rats in different groups

圖2 兩組大鼠脂肪質(zhì)量的比較Fig.2 Comparison of visceral fat weight of young rats in different groups

圖3 兩組大鼠肝功能指標(biāo)的比較Fig.3 Comparison of liver function of young rats in different groups

2.4 兩組大鼠肝臟質(zhì)量的比較高脂組肝臟質(zhì)量從8周起均顯著高于對照組（P＜0.05，圖4）。

圖4 兩組大鼠肝臟質(zhì)量的比較Fig.4 Comparison of liver weight of young rats in different groups

2.5 兩組大鼠肝細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化①肝臟大體形態(tài)：高脂組大鼠的肝臟明顯腫大，顏色變黃，有油膩感，質(zhì)地松脆，并且隨著時(shí)間的延長而加重，而對照組大鼠肝臟顏色深紅、質(zhì)軟，邊緣銳利。②肝臟光鏡下特點(diǎn)：HE染色光鏡下觀察，對照組大鼠肝細(xì)胞形態(tài)基本正常；高脂組大鼠肝細(xì)胞在8、12、16周時(shí)均出現(xiàn)不同程度的脂肪變性，肝細(xì)胞腫大，胞質(zhì)疏松并可見大小不等的脂滴空泡，肝細(xì)胞脂肪變性程度隨著時(shí)間的延長而加重。③肝臟電鏡下特點(diǎn)：對照組形態(tài)基本正常；高脂組8周時(shí)肝細(xì)胞內(nèi)脂滴蓄積，結(jié)構(gòu)基本清晰，細(xì)胞核基本呈圓形，核內(nèi)染色質(zhì)輕度凝集，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)線粒體輕度腫脹，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)基本正常，附著的核糖體可見；高脂組12周時(shí)，細(xì)胞內(nèi)見大量脂滴，細(xì)胞核呈圓形，細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)輕度凝集，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)線粒體輕度腫脹，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)池內(nèi)可見到線樣結(jié)構(gòu)沉積；高脂組16周時(shí)，肝細(xì)胞內(nèi)可見大量脂滴，細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)線粒體嵴結(jié)構(gòu)清晰，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面附著的核糖體可見，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)池內(nèi)可見到線樣結(jié)構(gòu)沉積（圖5）。

圖5 兩組大鼠肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化Fig.5 Comparison of liver cell structure of young rats in different groups

2.6 兩組大鼠肝組織ATF6 mRNA的表達(dá)高脂組大鼠在8、12、16周時(shí)，肝細(xì)胞內(nèi)ATF6 mRNA表達(dá)均較對照組明顯增高（P＜0.05，圖6），對照組ATF6 mRNA的表達(dá)隨著時(shí)間的延長無明顯改變，而高脂組隨著時(shí)間的延長，ATF6 mRNA的表達(dá)水平逐漸增加，呈時(shí)間依賴效應(yīng)。

2.7 兩組大鼠肝組織內(nèi)GRP78 mRNA的表達(dá)高脂飲食組在8、12、16周時(shí)，肝細(xì)胞內(nèi)GRP78 mRNA表達(dá)均較對照組明顯增高（P＜0.05），對照組的GRP78 mRNA表達(dá)隨著時(shí)間的延長無明顯改變，而高脂組隨著時(shí)間的延長，GRP78 mRNA的表達(dá)水平逐漸增加，呈時(shí)間依賴效應(yīng)。且隨著時(shí)間的延長，增加更為明顯（圖7）。

3 討 論

圖6 兩組大鼠肝組織ATF6 m RNA表達(dá)的比較Fig.6 Comparison of ATF6 mRNA expression of young rats in different groups

圖7 兩組大鼠肝組織內(nèi)GRP78 mRNA表達(dá)的比較Fig.7 Comparison of GRP78 m RNA expression in young rats in different groups

在世界范圍內(nèi)，肥胖已成為危害人類健康的重要影響因素之一。近10年來超重或肥胖的兒童所占的比例逐年快速的增加。WTO專家估計(jì)，世界上5歲以下肥胖兒童將超過4 300萬，到2020年世界上肥胖引起的相關(guān)性疾病將占據(jù)疾病譜的60%［7］。肥胖不僅危害著人們的健康，同時(shí)也增加了人們的健康支出。肥胖患者在醫(yī)療衛(wèi)生上的個(gè)人支出較體質(zhì)量正常者高出將近30%，肥胖不僅給個(gè)人，也給社會增加了沉重的負(fù)擔(dān)［8］。目前，引起肥胖的確切原因還不明確，但高脂飲食無疑在肥胖的發(fā)生中起著相當(dāng)重要的作用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能是通過調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成、折疊和運(yùn)輸維持蛋白質(zhì)平衡。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的生理功能發(fā)生紊亂時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)出現(xiàn)錯(cuò)誤折疊與未折疊蛋白在腔內(nèi)聚集，可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)非折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR）。GRP78是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的一種糖蛋白，又被稱為免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白（immunoglobulin heavy chain binding protein，Bip），是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中重要的分子伴侶，為熱休克蛋白70家族中的一員［9］，它能夠調(diào)節(jié)蛋白的折疊、傳遞以及降解。當(dāng)發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)，GRP78的表達(dá)異常增高，是判斷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志性蛋白。ATF6位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜中，是一種Ⅱ型跨膜蛋白，它的分子量為90 ku，當(dāng)出現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)它會被酶解成50 ku大小的片段進(jìn)入細(xì)胞核，成為轉(zhuǎn)錄因子，啟動內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)，如GRP94、GRP78等。它參與ERS中的UPR反應(yīng)，它的過度表達(dá)是判斷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激UPR信號通路的良好指標(biāo)。

為了探究肝細(xì)胞中是否存在ERS，本研究首先通過透射電鏡觀察高脂組與對照組大鼠中肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在高脂喂養(yǎng)第8周時(shí)，肝細(xì)胞內(nèi)僅可見大量脂滴，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)基本正常，而在12及16周時(shí)，肝細(xì)胞內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)池中可見到線樣蛋白物質(zhì)沉積，但粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上附著的核糖體仍可見。據(jù)此，我們推測這種線樣蛋白物沉積，就是UPR反應(yīng)中的未折疊蛋白的積聚，表明UPR反應(yīng)參與高脂飲食性肝損傷的發(fā)病機(jī)制。

進(jìn)一步我們采用RT-PCR法檢測了大鼠肝組織中GRP78及ATF6基因的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高脂組在8、12、16周時(shí)GRP78及ATF6基因的表達(dá)均進(jìn)行性增高，與對照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。同時(shí)，WANG等［10］在研究中發(fā)現(xiàn)，通過高飽和脂肪酸喂養(yǎng)Wistar大鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GRP78/Bip等ERSb標(biāo)志分子基因表達(dá)均增高，提示存在ERS。而DHAHBI等［11］研究發(fā)現(xiàn)，通過長時(shí)間的限制飲食可以降低小鼠肝臟中GRP94及GRP78 mRNA的含量，并且隨著m RNA含量的下降相應(yīng)蛋白也隨之下降，這又從反方向驗(yàn)證了我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。這就提示了高脂飲食可引起肥胖大鼠肝臟脂肪變性、脂肪性肝炎，且存在ATF6介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，提示高脂飲食誘導(dǎo)的大鼠NAFLD與ERS密切相關(guān)，ERS可能是高脂飲食所致NAFLD的機(jī)制之一。

在本實(shí)驗(yàn)中，我們還可以看出，通過對幼年大鼠進(jìn)行長期高脂飲食喂養(yǎng)，兩組大鼠體質(zhì)量及內(nèi)臟脂肪含量均發(fā)生明顯變化。與對照組相比，高脂組大鼠體質(zhì)量及內(nèi)臟脂肪含量均隨著時(shí)間延長而升高，尤其是內(nèi)臟脂肪含量，在第8周、12周、16周時(shí)高脂組大鼠的內(nèi)臟脂肪均較對照組高，兩組間有明顯差異（P＜0.05）。以上結(jié)果說明，使用高脂飼料飼養(yǎng)大鼠確實(shí)可以導(dǎo)致大鼠體質(zhì)量增加而引起肥胖，而且這種肥胖是內(nèi)臟脂肪增加的腹型肥胖。在國內(nèi)，一項(xiàng)針對145例單純性肥胖兒童的調(diào)查顯示，兒童單純性肥胖是以腹型肥胖為主的，腹型肥胖的兒童比非腹型肥胖的兒童更容易發(fā)生代謝紊亂［12］。而另一項(xiàng)針對286例肥胖患兒的研究也顯示了，兒童期的腹型肥胖和心血管危險(xiǎn)因素的發(fā)生密切相關(guān)，并且相較其他危險(xiǎn)因素其胰島功能更值得關(guān)注［13］。因此，兒童期的肥胖更需我們警惕及長期密切關(guān)注。

兒童NAFLD病理改變包括從單純脂肪肝變性到非酒精性脂肪性肝炎（NASH）等一系列肝臟病理改變［4，14］。脂肪肝早期表現(xiàn)為脂肪浸潤。本研究可以看到，與對照組比較，高脂組大鼠肝臟明顯腫大、色黃，有油膩感，質(zhì)地松脆，并且隨著時(shí)間的延長而加重。第8、12、16周高脂組大鼠肝臟質(zhì)量均顯著高于對照組（P＜0.05），且肝細(xì)胞腫大，脂肪變性，胞質(zhì)疏松并可見大小不等的脂滴空泡，肝細(xì)胞脂肪變性程度隨著時(shí)間的延長而加重。表明在第8、12、16周大鼠肝臟細(xì)胞中均有脂肪堆積，即表現(xiàn)為NAFLD。此時(shí)多數(shù)NAFLD兒童并無肝病相關(guān)癥狀，但患兒的肝臟其實(shí)已經(jīng)出現(xiàn)明顯的損害。血清轉(zhuǎn)氨酶是反映肝臟損傷的一個(gè)非常靈敏的指標(biāo)，也常常被作為診斷肝炎的指標(biāo)。轉(zhuǎn)氨酶的種類較多，但以ALT及AST最為常用。由于肝細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)氨酶濃度比血清中高出1 000～5 000倍，在肝細(xì)胞膜的通透性增加時(shí)，即使肝細(xì)胞沒有壞死，細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)氨酶也可以滲透入血中。因此，血清轉(zhuǎn)氨酶是肝細(xì)胞損傷的敏感指標(biāo)。本研究中，高脂組大鼠血清ALT、AST均隨著時(shí)間的延長而增高，提示肝臟發(fā)生了損害，但ALT敏感性高于AST，高脂組大鼠血清中ALT水平在16周時(shí)顯著高于對照組（P＜0.05）。值得一提的是，本實(shí)驗(yàn)中，肝臟在8周時(shí)已出現(xiàn)明顯的脂肪變性（電鏡下），但ALT在16周時(shí)才出現(xiàn)顯著差別（P＜0.05），提示當(dāng)發(fā)現(xiàn)肝功出現(xiàn)異常時(shí)，脂肪肝已經(jīng)在機(jī)體中發(fā)生發(fā)展了一段時(shí)間。因此，這就說明了，雖ALT是反應(yīng)肝臟損傷的敏感指標(biāo)，但它并不能早期反應(yīng)病情，亦不能提前預(yù)警。據(jù)此，我們認(rèn)為幼年高脂飲食可引起內(nèi)臟脂肪聚集、肝細(xì)胞脂肪變性、肝功損傷，高脂飲食誘導(dǎo)肝損傷的機(jī)制可能與ATF6介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激密切相關(guān)，高脂飲食在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及NAFLD中均起著重要作用。

隨著社會經(jīng)濟(jì)條件的發(fā)展，飲食方面越來越偏向高脂高糖，越來越多的兒童患有肥胖癥，從而可能出現(xiàn)NAFLD?；加蠳AFLD危害相當(dāng)大，因其早期無特異性癥狀，難以早期識別及發(fā)現(xiàn)，可以繼續(xù)發(fā)展為肝纖維化及肝硬化，產(chǎn)生嚴(yán)重后果。至今已有數(shù)例肥胖兒童NASH并發(fā)肝硬化的報(bào)道，對家庭及社會均造成嚴(yán)重的傷害及負(fù)擔(dān)。好在兒童NAFLD是一種可逆性疾病，早期發(fā)現(xiàn)及治療可避免該病惡化，使患兒重獲健康。因此，合理控制飲食是我們預(yù)防及治療NAFLD的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。通過飲食控制、體育鍛煉及改變生活方式是治療兒童和青少年NAFLD的最主要方法［4，15］。同時(shí)，越來越多的研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在NAFLD發(fā)病中起著重要的作用，隨著分子生物技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，或許會為肥胖兒童NAFLD的早期診斷及治療提供新的思路。

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（編輯 韓維棟）

Effects of endoplasmic reticulum stress on hepatocellular injury in young rats fed with high-fat diet

LIU Liang1，2，XIAO Yan-feng1，YIN Chun-yan1，ZHANG Wei-qin1，3
（1.Department of Pediatrics，the Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University Health Science Center，Xi’an 710004；2.Xi’an Children’s Hospital，Xi’an 710003；3.Children’s Hospital，Zhejiang University School of Medicine，Hangzhou 310003，China）

ObjectiveTo study the effects of endoplasmic reticulum stress on liver damage in young rats fed with high-fat diet.MethodsWe divided 48 male weaned young rats randomly into high-fat diet group and control group，which were separately fed with high-fat diet and normal diet.After feeding 8，12 and 16 weeks，the body weight and visceral fat of the rats were measured.The serum liver function was measured.The morphology of livers was observed by HE and transmission electron microscopy.The m RNA expressions of ATF6 and GRP78 in hepatocytes were measured with RT-PCR.Results①The body weight and visceral fat weight of rats in high-fat diet group increased compared with those in control group（P＜0.05）.②Alanine aminotransferase and aspartate aminotransferase in high-fat diet group increased slightly over time（P＞0.05）；alanine aminotransferase at week 16 was increased significantly compared with that in controls（P＜0.05）.③Liver cells in high-fat diet group had steatosis at week 8 and the steatosis became more serious between week 12 and week 16.④In high-fat diet group at week 8 there were a large number of lipid droplets in the cytoplasm，and the cell structure was close to that of normal cells；rough endoplasmic reticulum was nearly normal and the ribosome was visible.At week 12 and week 16，besides a large number of lipid droplets，we could also see that some substances with line-like structure deposited in rough endoplasmic reticulum pool.⑤The expressions of ATF6 and GRP78 m RNA in hepatocytes in high-fat group at weeks 8，12 and 16 were significantly increased compared with those in control group（P＜0.05）.ConclusionHigh-fat diet in infants can cause visceral fat accumulation，fatty degeneration of hepatocytes and liver injury.ATF6-mediated endoplasmic reticulum may be closely related to the liver injury which results f rom highfat diet.

endoplasmic reticulum stress；hepatocellular injury；young rat；high-fat diet；nonalcoholic steatohepatitis（NASH）

Q493.5

A

10.7652/jdyxb201506002

2014-11-24

2015-04-25

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.81172689）；西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部第二附屬醫(yī)院重大科研方向資助計(jì)劃［No.YJ（ZDJH）2013（03）］

Supported by the National Natural Science Foundation of China（No.81172689），Important Scientific Projects of the Second Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University Health Science Center［No.YJ（ZDJH）2013（03）］

肖延風(fēng).E-mail：xiaoyanfeng0639@sina.com

優(yōu)先出版：http：//www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20150928.1610.018.html（2015-09-28）