趙慶斌，周 娟，吳 岳，田雨靈，劉治全

（西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部第一附屬醫(yī)院：1.老年內(nèi)科；2.心內(nèi)科，陜西西安 710061）

◇基礎(chǔ)研究◇

粒細(xì)胞集落刺激因子對(duì)兔慢性心肌缺血的保護(hù)作用

趙慶斌1，周 娟2，吳 岳2，田雨靈2，劉治全2

（西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部第一附屬醫(yī)院：1.老年內(nèi)科；2.心內(nèi)科，陜西西安 710061）

目的探討粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）對(duì)慢性心肌缺血的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法雄性日本大耳白兔為研究對(duì)象，開胸后不全結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支，建立慢性心肌缺血模型。將成功制備的模型兔隨機(jī)分為2組，即G-CSF干預(yù)組和對(duì)照組。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定外周血CD34+細(xì)胞百分率，應(yīng)用免疫組化法測(cè)定心肌組織CD34+細(xì)胞歸巢和vWF的表達(dá)。結(jié)果G-CSF明顯提高慢性心肌缺血模型兔的生存率，增加外周血CD34+細(xì)胞百分率，促進(jìn)缺血心肌組織中CD34+細(xì)胞歸巢和vWF表達(dá)。結(jié)論G-CSF對(duì)兔慢性心肌缺血損傷具有明顯保護(hù)作用，其機(jī)制與外周血CD34+細(xì)胞動(dòng)員和歸巢于缺血心肌以及促進(jìn)血管新生有關(guān)。

粒細(xì)胞集落刺激因子；心肌缺血；血管新生；CD34+

粒細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte-colony-stimulating factor，G-CSF）是25 ku的糖蛋白分子，由單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等產(chǎn)生。G-CSF可以刺激中性粒細(xì)胞及其前體細(xì)胞增生。體外研究證實(shí)，G-CSF可以直接刺激內(nèi)皮細(xì)胞遷移和增殖［1］，修復(fù)機(jī)械損傷的內(nèi)皮單細(xì)胞層及生成毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)［2］。G-CSF也能促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖［3］。有研究表明，G-CSF具有直接的心臟保護(hù)作用［4］。缺血性心臟病是當(dāng)前人類死亡的主要原因之一。本研究探討G-CSF對(duì)兔慢性心肌缺血模型的保護(hù)作用和潛在機(jī)制，為G-CSF治療缺血性心臟病提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料兔淋巴細(xì)胞分離液購于北京普利萊基因技術(shù)有限公司；CD34單克隆抗體及陰性對(duì)照購于B.D.公司；G-CSF（商品名：立生素300μg/支）購于北京雙鷺?biāo)帢I(yè)股份有限公司；CD34和vWF因子免疫組化試劑盒均購于武漢博士德生物工程有限公司。Beckman Coulter公司流式細(xì)胞儀由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)中心提供。雄性日本大耳白兔88只，體質(zhì)量2～3 kg，購于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)前，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在動(dòng)物中心適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2 兔慢性心肌缺血模型制備［5］30 g/L戊巴比妥鈉（30 mg/kg）耳緣靜脈麻醉。隨后經(jīng)耳緣靜脈注射利多卡因（1 mg/kg），以預(yù)防冠狀動(dòng)脈結(jié)扎過程中發(fā)生室性心律失常。將兔仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，備皮，沿胸骨左緣剪斷左側(cè)第3～4肋軟骨，暴露縱隔和心臟，保持兩側(cè)胸膜完整，距左冠狀動(dòng)脈冠狀竇開口4～5 mm處，用5/0無損傷帶針縫合線穿過左前降支下方，將直徑分別為0.8 mm和0.1 mm的粗、細(xì)絲線各一根置于左前降支前緣，將絲線與左前降支一起結(jié)扎，隨后迅速抽出細(xì)絲線，相當(dāng)于血管90%狹窄。觀察左前降支遠(yuǎn)端血管充盈不明顯，左心室前壁和心尖部心肌顏色稍變暗，表明結(jié)扎成功。術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng)，肌肉注射青霉素（40萬單位/只）3 d預(yù)防感染。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組88只模型兔隨機(jī)分成2組。GCSF干預(yù)組（G-CSF組，n=44）；應(yīng)用G-CSF 10μg/（kg·d）皮下注射，每日1次，共6 d；對(duì)照組（n=44），應(yīng)用等量的生理鹽水皮下注射模型兔，其余同G-CSF干預(yù)組。各組中的20只用于生存分析，觀察28 d，另外24只用于細(xì)胞和組織分析。

1.4 生存分析觀察G-CSF干預(yù)組和對(duì)照組各20只動(dòng)物28 d生存狀況，任何原因的死亡均為終點(diǎn)事件。

1.5 外周血CD34+細(xì)胞百分率測(cè)定各組的另外24只兔，分別于術(shù)后1、3、7、28 d，自耳緣靜脈取血5 m L，肝素抗凝，用淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單個(gè)核細(xì)胞。取2×106個(gè)細(xì)胞，分別加入10μL CD34單克隆抗體和熒光素藻紅蛋白標(biāo)記（陰性對(duì)照），室溫避光孵育20 min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血中CD34+細(xì)胞百分率。

1.6 CD34+細(xì)胞和vWF免疫組化染色于術(shù)后1、3、7、28 d處死動(dòng)物，取出心臟，將缺血心肌組織放入40 m L/L中性甲醛緩沖液中固定16 h后，常規(guī)石蠟包埋并制作4～5μm厚切片，貼于潔凈的載玻片上，室溫過夜之后存放于干燥避光處備用。按照試劑盒說明書采用SP法進(jìn)行CD34+細(xì)胞和v WF（1∶100）免疫組化染色。

結(jié)果判斷：CD34陽性著色表現(xiàn)為胞質(zhì)染成棕色或棕黃色。在400倍光學(xué)顯微鏡下，每張切片隨機(jī)取3個(gè)視野數(shù)出CD34+細(xì)胞，求其均值作為最終值。微血管計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)：抗vWF抗體是最特異的內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物，能較好地顯示組織中的小血管和毛細(xì)血管，作為反映血管生成的間接手段。血管內(nèi)皮細(xì)胞被染成棕黃色。低倍光學(xué)顯微鏡（100倍）下找到血管密度較大區(qū)域，再轉(zhuǎn)到高倍視野（200倍）下精確計(jì)數(shù)每高倍視野下的微血管數(shù)量。單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞簇、微小血管均予計(jì)數(shù)。隨機(jī)測(cè)定8個(gè)視野，取其均值作為測(cè)定值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用GraphPad Prism 4.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用兩因素方差分析及LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。應(yīng)用Kaplan-Meier乘積限法估計(jì)生存率，應(yīng)用Log-rank檢驗(yàn)比較兩組生存時(shí)間。

2 結(jié) 果

2.1 生存分析結(jié)果應(yīng)用Kaplan-Meier分析結(jié)果顯示，G-CSF干預(yù)慢性心肌缺血模型兔的28 d生存時(shí)間明顯提高，G-CSF干預(yù)組和對(duì)照組兔28 d生存率分別為75%和40%（P＜0.05，圖1）。

圖1 G-CSF干預(yù)組與對(duì)照組的生存分析Fig.1 Analysis of the rabbits’survival from chronic myocardial ischemia in G-CSF and control groups

2.2 外周血CD34+細(xì)胞百分率檢測(cè)結(jié)果G-CSF干預(yù)組兔在術(shù)后第1、第3、第7和第28天，外周血CD34+細(xì)胞百分率顯著高于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的對(duì)照組（n=6，P＜0.01）。在術(shù)后第7天，干預(yù)組和對(duì)照組外周血CD34+細(xì)胞百分率均明顯高于其他時(shí)間點(diǎn)（P＜0.01，圖2）。提示G-CSF能顯著提高心肌缺血早期的外周血CD34+細(xì)胞百分率。

圖2 G-CSF干預(yù)組和對(duì)照組外周血CD34+細(xì)胞百分率的變化Fig.2 Changes of CD34-positive cell percentage in the peripheral blood of model rabbits

2.3 缺血心肌組織中CD34+細(xì)胞的表達(dá)情況免疫組化染色結(jié)果顯示，在術(shù)后第7天，G-CSF干預(yù)組缺血心肌組織中CD34+細(xì)胞數(shù)目明顯高于相應(yīng)的對(duì)照組；在術(shù)后第28天，兩組缺血心肌組織中均未觀察到CD34+細(xì)胞（圖3）。

圖3 術(shù)后28 d對(duì)照組（A）和G-CSF干預(yù)組（B）缺血心肌組織中CD34+細(xì)胞染色和各組細(xì)胞計(jì)數(shù)（C）Fig.3Resultsof immunocytomitry for the CD34-stained sections in control group（A）and G-CSF group（B）at day 28 post-operation，and the number of CD34+cells in ischemic myocardium at different time points（C）

2.4 缺血心肌組織中vWF的表達(dá)結(jié)果應(yīng)用免疫組化法觀察缺血心肌組織中v WF表達(dá)以確定內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)目，并計(jì)數(shù)vWF染色陽性血管，在高倍視野下（200倍）隨機(jī)測(cè)定8個(gè)視野，取其均值作為測(cè)定值。在術(shù)后第28天，干預(yù)組［（33.6±10.4）/mm2）］較對(duì)照組缺血心肌組織中有明顯的血管新生［（16.2 ±5.6）/mm2，P＜0.01，圖4］。

圖4 術(shù)后28 d對(duì)照組（A）和G-CSF干預(yù)組（B）缺血心肌組織中vWF染色和各組微血管計(jì)數(shù)（C）Fig.4 The vonWillebrand factor（v WF）-stained sections in control group（A）and G-CSF group（B），and the number of vWF-positive vessels in the ischemic areas（C）

3 討 論

心臟作為終末分化器官不能再生的法則現(xiàn)在已經(jīng)受到挑戰(zhàn)。在特定條件下部分心肌細(xì)胞有可能重新進(jìn)入細(xì)胞周期，并通過募集局部和循環(huán)中的干細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)有限的再生。雖然這種有限的再生不足以對(duì)臨床上急性心肌梗死和慢性充血性心力衰竭產(chǎn)生足夠的代償作用，但存在內(nèi)源性的修復(fù)機(jī)制提示實(shí)現(xiàn)心臟修復(fù)并不是空想?；A(chǔ)研究已經(jīng)證實(shí)，將干細(xì)胞或祖細(xì)胞移植到心臟能改善受損心臟的組織灌注和收縮功能，可能的機(jī)制包括干細(xì)胞與心肌細(xì)胞融合，橫向分化為心肌細(xì)胞、血管細(xì)胞以及所謂的旁分泌作用。

臨床研究所采用的細(xì)胞主要為可從自體獲得的骨髓細(xì)胞（包含了不同的干細(xì)胞和祖細(xì)胞群，如造血干細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞）和骨骼肌成肌細(xì)胞，移植途徑包括經(jīng)冠狀動(dòng)脈內(nèi)輸注、在體動(dòng)員、直接注射入心室壁（經(jīng)心外膜、經(jīng)心內(nèi)膜和經(jīng)冠狀靜脈竇）。近年來，已有不少關(guān)于干細(xì)胞移植治療缺血性心臟病的臨床報(bào)道，雖然這些研究多為小樣本、非隨機(jī)對(duì)照研究，但卻初步提示了這種方法應(yīng)用于患者的可行性和安全性。

G-CSF是強(qiáng)有力的造血細(xì)胞因子，它能影響粒細(xì)胞的增殖、存活、成熟以及功能活性，并且能動(dòng)員骨髓中的粒細(xì)胞、干細(xì)胞或前體細(xì)胞到血循環(huán)［6-7］。這種動(dòng)員機(jī)制還未完全明確，但可能是通過結(jié)合到特異性的細(xì)胞表面受體即G-CSF受體而進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而引起后續(xù)黏附分子的消化。SDF-1及其受體CXCR-4可能起了關(guān)鍵作用［8］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明了G-CSF動(dòng)員干細(xì)胞改善心肌梗死后左室功能，促進(jìn)血管生成，以及減輕心肌梗死后心室重塑［9-10］。ORLIC等［9］將重組鼠干細(xì)胞因子和重組人G-CSF注射到小鼠動(dòng)員干細(xì)胞5 d，然后結(jié)扎冠狀動(dòng)脈，隨后再應(yīng)用干細(xì)胞因子和G-CSF 3 d，結(jié)果顯示有新的心肌和血管形成，射血分?jǐn)?shù)明顯提高。近來也有實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在兔心肌梗死再灌注模型應(yīng)用G-CSF，結(jié)果發(fā)現(xiàn)左室射血分?jǐn)?shù)提高，減低了心室重塑［11］。

本研究結(jié)果證實(shí)，應(yīng)用G-CSF早期干預(yù)慢性心肌缺血模型兔，觀察到G-CSF除能動(dòng)員骨髓干細(xì)胞提高外周血CD34+細(xì)胞百分率外，還能促進(jìn)CD34+細(xì)胞歸巢于缺血心肌，促進(jìn)血管新生，提高模型兔生存率。因此，慢性心肌缺血早期應(yīng)用G-CSF可以提高生存率，其作用機(jī)制可能與骨髓干細(xì)胞動(dòng)員和歸巢以及新生血管生成有關(guān)。

［1］SILVESCU CI，SACKSTEIN R.G-CSF induces membrane expression of a myeloperoxidase glycovariant that operates as an E-selectin ligand on human myeloid cells［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2014，111（29）：10696-10701.

［2］XUE J，DU G，SHI J，et al.Combined treatment with erythropoietin and granulocyte colony-stimulating factor enhances neovascularization and improves cardiac function after myocardial infarction［J］.Chin Med J（Engl），2014，127（9）：1677-1683.

［3］LAVIN B，GOMEZ M，PELLO OM，et al.Nitric oxide prevents aortic neointimal hyperplasia by controlling macrophage polarization［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2014，34（8）：1739-1746.

［4］MATSUMOTO S，IWATA H，SHIRAHASHI K，et al.Suppression of right ventricular hypertrophy after extensive pulmonary resection in rats by granulocyte colony-stimulating factor［J］.J Surg Res，2010，162（2）：153-159.

［5］ZHAO Q，SUN C，XU X，et al.CD34+cell mobilization and upregulation of myocardial cytokines in a rabbit model of myocardial ischemia［J］.Int J Cardiol，2011，152（1）：18-23.

［6］GARCIA NP，DE LEON EB，DA COSTA AG，et al.Kinetics of mesenchymal and hematopoietic stem cells mobilization by G-CSF and its impact on the cytokine microenvironment in primary cultures［J］.Cell Immunol，2015，293（1）：1-9.

［7］田婧，王雪晶，馬耀華，等.rh G-CSF對(duì)缺氧SH-SY5Y細(xì)胞及大鼠缺血腦組織中LAMP-2a和HSC-70蛋白表達(dá)的影響［J］.鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2013，48（4）：481-484.

［8］TAVERNIER E，AANEI C，SOLLY F，et al.CXCR4：a new therapeutic target of the leukaemic cell？Role of the SDF-1/ CXCR4 axis in acute myeloid leukaemia［J］.Bull Cancer，2014，101（6）：593-604.

［9］ORLIC D，KAJSTURA J，CHIMENTI S，et al.Mobilized bone marrow cells repair the infarcted heart，improving function and survival［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2001，98（18）：10344-10349.

［10］GONG Y，ZHAO Y，LI Y，et al.Plasminogen regulates cardiac repair after myocardial infarction through its noncanonical function in stem cell homing to the infarcted heart［J］.J Am Coll Cardiol，2014，63（25 Pt A）：2862-2872.

［11］SANGANALMATH SK，ABDEL-LATIF A，BOLLI R，et al. Hematopoietic cytokines for cardiac repair：mobilization of bone marrow cells and beyond［J］.Basic Res Cardiol，2011，106（5）：709-733.

（編輯 國(guó) 榮）

Protective effect of granulocyte-colony-stimulating factor against chronic myocardial ischemia in rabbits

ZHAO Qing-bin1，ZHOU Juan2，WU Yue2，TIAN Yu-ling2，LIU Zhi-quan2
（1.Department of Gerontology；2.Department of Cardiology，the First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University Health Science Center，Xi’an 710061，China）

ObjectiveTo investigate the protective effects and mechanisms of granulocyte-colony-stimulating factor（G-CSF）on a rabbit model of chronic myocardial ischemia.MethodsMyocardial ischemia models were created by partial ligation of the left anterior descending coronary artery in Japanese white male rabbits.Rabbits were subcutaneously injected with G-CSF（G-CSF group）or saline（control group）for 6 days after myocardial ischemia.The percentage of CD34-positive cells in the peripheral blood was evaluated by flow cytometry，and CD34-positive cells homing and v WF expression in the ischemic myocardium were determined by immunohistochemistry.ResultsRabbits in G-CSF group had a higher survival rate than those in control group（P＜0.05）.Immunohistochemistry of the ischemic myocardium showed that compared with control group，G-CSF group had increased homing of CD34-positive cells on day 7 post-surgery，and more vessels on day 28 post-surgery by anti-von Willebrand factor staining.In addition，we observed an increase in the percentage of CD34-positive cells in the peripheral blood in G-CSF group.ConclusionG-CSF produces an obvious protective effect against chronic myocardial ischemia in rabbits by increasing stem cell mobilization，homing to ischemic myocardium and accelerating neovascularization.

granulocyte-colony-stimulating factor（G-CSF）；myocardial ischemia；neovascularization；CD34+

R541.4

A

10.7652/jdyxb201506004

2015-03-05

2015-05-26

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.81200098）；陜西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No.2014K11-03-04-06）

Supported by the National Natural Science Foundation of China（No.81200098）and the Natural Science Foundation of Shaanxi Province（No.2014K11-03-04-06）

趙慶斌.E-mail：zhaoqingbin05@163.com

優(yōu)先出版：http：//w ww.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20150928.1758.030.html（2015-09-28）