張 熙，趙啟梅，尉春艷

（1.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西西安 710004；2.十堰市堰橋醫(yī)院急診科，湖北十堰 442000；3.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西西安 710004）

◇基礎(chǔ)研究◇

EGFR 對血管生成擬態(tài)的誘導(dǎo)作用及其相關(guān)機制

張 熙1，趙啟梅2，尉春艷3

（1.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西西安 710004；2.十堰市堰橋醫(yī)院急診科，湖北十堰 442000；3.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西西安 710004）

目的探討表皮生長因子受體（epithelial growth factor receptor，EGFR）對血管生成擬態(tài)的促進作用。方法應(yīng)用CD34-PAS雙重染色法檢測不同級別膠質(zhì)瘤中血管生成擬態(tài)的存在情況，應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測不同級別膠質(zhì)瘤中EGFR蛋白的表達，應(yīng)用化學(xué)缺氧法誘導(dǎo)人腦星形細胞瘤U87細胞在三維培養(yǎng)體系中形成血管生成擬態(tài)，Transwell法檢測細胞的遷移及侵襲能力，甲基噻唑基四唑法（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）檢測細胞的增殖能力，蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測EGFR、絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶AKT和磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3 K）蛋白的表達，探討EGFR/AKT/PI3K通路對血管生成擬態(tài)的誘導(dǎo)作用。結(jié)果血管擬態(tài)陽性的患者EGFR陽性率為94.4%（17/18），血管擬態(tài)陰性的患者EGFR陽性率為71.8%（56/78），兩者差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。U87細胞三維培養(yǎng)后，缺氧組平均每個視野網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)數(shù)量、遷移能力，侵襲能力和增殖能力均顯著高于常氧組（P＜0.01）。Western blot顯示缺氧組中EGFR、AKT、PI3K蛋白的表達顯著高于常氧組。結(jié)論缺氧可誘導(dǎo)EGFR/AKT/PI3K信號通路活化，進而誘導(dǎo)血管生成擬態(tài)的形成，EGFR在血管生成擬態(tài)的形成過程中起著十分重要的作用。

血管生成擬態(tài)；缺氧；膠質(zhì)瘤；EGFR/AKT/PI3K信號通路

血管生成擬態(tài)（vasculogenic mimicry，VM）是近年來發(fā)現(xiàn)的存在于惡性腫瘤中的一種獨特的血液供應(yīng)方式。它是由腫瘤細胞經(jīng)過自身重塑圍成的管腔樣結(jié)構(gòu)。它的管腔內(nèi)表面沒有內(nèi)皮細胞，取而代之的是細長的腫瘤細胞，血液可在管腔內(nèi)流動。只有同時抑制內(nèi)皮細胞依賴性血管和血管生成擬態(tài)，徹底切斷腫瘤血供，才有可能達到治療腫瘤的目的。有研究證明，缺氧能夠誘導(dǎo)血管生成擬態(tài)的形成。在缺氧條件下，EGFR蛋白的表達明顯升高，它可通過激活其下游通路如AKT/PI3K激活層粘連蛋白5γ2和環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2，Cox2），進而誘導(dǎo)血管生成擬態(tài)的形成［1-2］。另有研究證明，層粘連蛋白5γ2和Cox2能誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的形成，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化也能促進血管生成擬態(tài)的形成［3］。本實驗擬探討EGFR蛋白對膠質(zhì)瘤血管生成擬態(tài)的促進作用及其相關(guān)機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑U87膠質(zhì)瘤細胞由ATCC（American Type Culture Collection）提供，免疫組化鼠抗人EGFR抗體購自Santa Cruz公司，Western blot檢測所用EGFR、AKT和PI3K抗體購自Abcam公司。96例人腦膠質(zhì)瘤標本為兩安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部第一附屬醫(yī)院、第二附屬醫(yī)院2002年2月至2013年10月手術(shù)存檔石蠟標本。術(shù)后均經(jīng)病理診斷證實為膠質(zhì)瘤，包括72例星形細胞瘤，10例髓母細胞瘤，8例室管膜母細胞瘤，6例少突胺質(zhì)細胞瘤。所有患者術(shù)前均未進行放療或化療。

1.2 免疫組織化學(xué)染色和CD34-PAS雙重染色免疫組織化學(xué)采用SP法，按照CD34免疫組化試劑盒步驟操作。顯微鏡下觀察，血管內(nèi)皮呈現(xiàn)棕黃色后，蒸餾水沖洗1 min終止顯色反應(yīng)；然后行PAS染色，常規(guī)脫水、透明、樹膠封片。計算陽性細胞所占比例，＜10%為陰性，＞10%為陽性。

1.3 細胞的三維培養(yǎng)將Matrigel基質(zhì)膠與新生牛血清1∶1混合，加入到24孔板中，每孔加入20μL，室溫下放置20 min，基質(zhì)膠凝固后，每孔加入U87細胞1×104個。分為常氧組和缺氧組。常氧組加入100 m L/L的新生牛血清至達爾伯克必需基本培養(yǎng)基（Dulbecco’s minimum essential medium，DMEM），缺氧組中再加入二氯化鈷（CoCl2）100μmol/L，每組隨機選擇8個視野，計數(shù)血管生成擬態(tài)數(shù)目。

1.4 細胞遷移能力檢測采用Transwell法檢測細胞的遷移能力。將U87細胞加入到Transwell小室的上室中，每孔2×104個，分為常氧組和缺氧組，每個上室中加入10 m L/L新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液200μL，下室加入10 mL/L新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液600μL。缺氧組在上室加入CoCl2100μmol/L，12 h后每組隨機選擇8個視野計數(shù)遷移細胞數(shù)目，觀察各組細胞遷移至小室聚碳脂膜內(nèi)的細胞數(shù)。

1.5 細胞侵襲能力的檢測采用Transwell法檢測細胞的侵襲能力。將Matrigel基質(zhì)膠與新生牛血清1∶1混合，加入到Transwell小室的上室中，室溫下放置20 min，基質(zhì)膠凝固后，每個上室加入U87細胞8×104個，分為常氧組和缺氧組，上室中加入10 mL/L新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液200μL，下室加入100 m L/L新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液600μL。缺氧組在上室加入CoCl2至100μmol/L。24 h后U87細胞每組隨機選擇8個視野計數(shù)侵襲細胞數(shù)目，觀察各組細胞侵襲至小室聚碳脂膜內(nèi)的細胞數(shù)。

1.6 MTT檢測收集對數(shù)期U87細胞，顯微鏡下用細胞計數(shù)板調(diào)整細胞密度，加入到96孔板中，每孔100μL，每孔細胞約5 000個。50 mL/L CO2、37℃培養(yǎng)，細胞貼壁后，分為常氧組和缺氧組，每組8個復(fù)孔，常氧組加入100 m L/L的新生牛血清DMEM培養(yǎng)液，缺氧組再加入CoCl2100μmol/L。在50 m L/L CO2、37℃培養(yǎng)24 h，顯微鏡下觀察細胞生長情況，移去細胞培養(yǎng)液，PBS清洗2次，加入細胞培養(yǎng)液，加入MTT溶液20μL。去掉培養(yǎng)液。每孔加入150μL二甲基亞砜，振蕩10 min，酶聯(lián)免疫檢測儀的A490 nm處測量吸光值。

1.7 Western blot檢測提取常氧組和缺氧組細胞的總蛋白，經(jīng)100 g/L十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜。封閉2 h后與鼠抗人EGFR抗體孵育過夜，二抗孵育1 h，化學(xué)發(fā)光顯色，以β-actin為內(nèi)參校正。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析所得結(jié)果均用表示，采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析，采用卡方檢驗，t檢驗，Spearman相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 膠質(zhì)瘤中血管生成擬態(tài)與EGFR蛋白表達的關(guān)系96例人腦膠質(zhì)瘤標本中，18例血管生成擬態(tài)陽性，78例血管擬態(tài)陰性。18例血管擬態(tài)陽性的標本17例EGFR蛋白表達陽性，陽性率為94.4%，78例血管擬態(tài)陰性的標本中，56例EGFR蛋白表達陽性，陽性率為71.8%，兩組陽性率相比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表1、圖1）。

表1 人腦膠質(zhì)瘤中血管生成擬態(tài)與EGFR蛋白表達的關(guān)系Tab.1 The relationship between vasculogenic mimicry and EGFR protein in glioma

圖1 膠質(zhì)瘤中血管生成擬態(tài)的鑒定和EGFR蛋白的表達Fig.1 The identification of vasculogenic mimicry and EGFR protein expression in glioma

2.2 缺氧可誘導(dǎo)U87細胞血管生成擬態(tài)的形成24 h后發(fā)現(xiàn)常氧組及缺氧組均變形，相互連接形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，但是缺氧組的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)數(shù)目明顯多于常氧組。缺氧組平均每個視野網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)數(shù)量為58.29± 7.02，而常氧組為23.71±5.77，缺氧組和常氧組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，圖2）。

圖2 三維培養(yǎng)中缺氧對U87細胞血管生成擬態(tài)的誘導(dǎo)作用Fig.2 Vasculogenic mimicry of U87 cells was induced in three-dementional culture in hypoxia

2.3 缺氧可上調(diào)U87細胞的遷移能力缺氧組U87細胞平均遷移數(shù)目為177.86±18.12，常氧組為70.43±9.32，兩組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），細胞遷移能力與血管生成擬態(tài)的形成呈顯著正相關(guān)（r=0.713，P＜0.01，圖3）。

圖3 缺氧對U87細胞遷移能力的影響Fig.3 The impact of hypoxia on migration of U87 cells

2.4 缺氧可上調(diào)U87細胞的侵襲能力在常氧組中，平均每個視野U87細胞侵襲數(shù)目為40.57± 6.48，而在缺氧組中，U87細胞侵襲數(shù)目為87.29± 10.70，兩組之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），細胞侵襲能力與血管生成擬態(tài)的形成呈正相關(guān)（r= 0.796，P＜0.01，圖4）。

圖4 缺氧對U87細胞侵襲能力的影響Fig.4 The impact of hypoxia on invasion of U87 cells

2.5 缺氧可上調(diào)U87細胞的增殖能力常氧組的平均A值為0.46±0.05，缺氧組的平均A值為0.60 ±0.06，兩組之間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），與血管生成擬態(tài)的形成呈顯著正相關(guān)（r= 0.676，P＜0.01）。

2.6 缺氧可激活EGFR/AKT/PI3 K通路與常氧組比較，缺氧組中EGFR蛋白的表達明顯上調(diào)，其下游蛋白AKT和PI3K蛋白的表達也明顯上調(diào)，EGFR/ AKT/PI3K信號通路明顯活化（圖5）。

3 討 論

圖5 兩組中EGFR、AKT和PI3K蛋白的表達Fig.5 The expressions of EGFR，AKT and PI3K protein

血管生成擬態(tài)是新發(fā)現(xiàn)的腫瘤內(nèi)微循環(huán)結(jié)構(gòu)。它是由腫瘤細胞變形、重塑以及相互連接形成的管腔樣結(jié)構(gòu)，管道內(nèi)沒有血管內(nèi)皮細胞的覆蓋，管腔內(nèi)可見血細胞，可向腫瘤組織供血。目前已在多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)有血管生成擬態(tài)的存在，如肝癌，膠質(zhì)瘤［4-5］等，它對腫瘤的發(fā)展、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)均起著十分重要的作用。

形成血管生成擬態(tài)的腫瘤細胞主要有以下2個特點：①形成擬態(tài)血管的腫瘤細胞具有一定的可塑性；②它們喪失腫瘤細胞本身的一些標志蛋白，轉(zhuǎn)而表達一些內(nèi)皮細胞特有的蛋白，存在多分化潛能［6］。研究表明，在多種腫瘤中，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化能夠賦予腫瘤細胞重塑、分化的能力［7］，能夠促進腫瘤細胞血管生成擬態(tài)的形成。RIZVI等［8］認為，在卵巢癌中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化往往伴隨著EGFR的過表達。在腫瘤細胞中，血管內(nèi)皮鈣粘蛋白（vascular endothelial cadherin，VE-cadherin）可誘導(dǎo)Eph A2蛋白轉(zhuǎn)移至細胞膜。細胞膜上的Eph A2蛋白相互作用，導(dǎo)致其磷酸化，進而激活基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase，MMP2）蛋白?；罨腗MP2蛋白能夠切割層粘連蛋白5γ2形成γ2’片段和γ2x片段，增加腫瘤的遷移及侵襲能力，誘導(dǎo)擬態(tài)血管的生成［9］。另外，Cox-2與血管生成擬態(tài)的形成也密切相關(guān)，應(yīng)用Cox-2抑制劑可明顯抑制血管生成擬態(tài)的形成［10］。層粘連蛋白5γ2的Ⅲ鏈中包含了多個類似EGF的氨基酸序列，可和EGFR結(jié)合，進而激活下游通路［11］。Cox-2可催化花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素H2，前列腺素H2隨后被轉(zhuǎn)化成前列腺素E2，然后激活EGFR通路，發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)［12］。由此可見，EGFR可能在血管生成擬態(tài)的形成過程中發(fā)揮十分重要的作用。我們前期的實驗表明，在缺氧環(huán)境下能夠誘導(dǎo)血管生成擬態(tài)的形成［13］。在缺氧環(huán)境下，細胞可能通過激活EGFR蛋白及其下游通路上調(diào)血管生成擬態(tài)的形成能力。我們首先在膠質(zhì)瘤標本中證明了血管生成擬態(tài)的形成與EGFR蛋白的表達存在相關(guān)性，EGFR蛋白表達陽性的標本中，越容易形成血管生成擬態(tài)。缺氧環(huán)境中膠質(zhì)瘤細胞的EGFR蛋白的表達明顯上調(diào)，進而激活A(yù)KT/PI3K通路，最終誘導(dǎo)血管生成擬態(tài)的形成?？梢奅GFR/AKT/PI3K通路在血管生成擬態(tài)的形成過程中起著十分重要的作用。EGFR/ AKT/PI3 K通路也可作為分子靶點，用于抑制血管生成擬態(tài)，達到治療腫瘤的目的。

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（編輯 韓維棟）

The effect and mechanism of epithelial growth factor receptor（EGFR）in inducing vasculogenic mimicry formation

ZHANG Xi1，ZHAO Qi-mei2，WEI Chun-yan3
（1.Department of Neurosurgery，the Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University Health Science Center，Xi’an 710004；2.Department of Emergency，Yanqiao Hospital，Shiyan 442000；3.Department of Obstetrics and Gynecology，the Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University Health Science Center，Xi’an 710004，China）

ObjectiveTo investigate the effect and mechanism of EGFR in inducing vasculogenic mimicry（VM）formation.MethodsImmunohistochemistry was used to detect the expression of EGFR protein and CD34-PAS double staining was used to detect the VM in gliomas paraffin blocks.The migration and VM formation of U87 cell in hypoxic and normoxic groups were detected by transwell and three-dimensional culture.Then we used Western blot to detect the expressions of EGFR，AKT and PI3K protein.ResultsThe positive rate of EGFR expression in VM positive patients was 94.4%，which was significantly higher than that in VM negative patients（71.8%）.In hypoxic group，the abilities of migration and VM formation were significantly higher those in normoxic group.The expressions of EGFR，AKT and PI3 K were higher in hypoxic group.ConclusionVM formation can be induced by the activation of EGFR/AKT/PI3K signaling pathway.EGFR is very important for VM formation.

vasculogenic mimicry；hypoxia；glioma；EGFR/AKT/PI3 K signaling pathway

R739.41

A

10.7652/jdyxb201506005

2015-01-18

2015-03-19

陜西省社會發(fā)展攻關(guān)計劃資助項目（No.2014K11-01-01-12）

Supported by the Social Development Research Project of Shaanxi Province（No.2014K11-01-01-12）

尉春艷.E-mail：weichy1023@163.com

優(yōu)先出版：http：//www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20150928.1603.016.html（2015-09-28）