◇基礎(chǔ)研究◇

攜帶CIP2A shRNA重組腺相關(guān)病毒載體的構(gòu)建及其鑒定

cancerous inhibitor of PP2A（CIP2A）；RNA interference；recombinant adeno-associated virus（r AAV）；short hairpin RNA（sh RNA）

蛋白磷酸酶2A（protein phosphatase 2A，PP2A）的癌性抑制因子（cancerous inhibitor of PP2A，CIP2A）是近年來識別的能夠抑制其活性的癌蛋白，具有穩(wěn)定癌蛋白c-Myc二元磷酸化結(jié)構(gòu)，促進細胞惡性轉(zhuǎn)化及體內(nèi)腫瘤生長作用［1-2］。前期研究證實，CIP2A在肝細胞癌組織及人肝癌細胞系Hep G2中存在高表達，參與肝癌惡性進展過程，可能成為肝癌潛在的分子生物學標志物及治療靶點［3-4］。

短發(fā)卡RNA（short hairpin RNA，shRNA）是一段具有緊密發(fā)卡環(huán)的RNA序列，進入細胞后會被細胞質(zhì)內(nèi)Dicer酶剪切加工成siRNA進而發(fā)揮RNA干擾作用［5］。腺相關(guān)病毒（adeno-Associated virus，AAV）以位點特異性方式整合于人類第19號染色體上，避免隨機整合導致宿主細胞引起基因突變的潛在危險，成為目前用于基因治療的安全有效病毒載體［6］。本實驗擬構(gòu)建攜帶CIP2A sh RNA重組腺相關(guān)病毒載體（r AAV-CIP2A sh RNA）并轉(zhuǎn)染人肝癌細胞系HepG2，通過特異且有效地抑制HepG2細胞內(nèi)CIP2A基因轉(zhuǎn)錄，為進一步探索CIP2A對肝癌細胞HepG2生物學特性的影響奠定工作基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及細胞株p DC316-EGFP-U6質(zhì)粒及腺相關(guān)病毒通用載體質(zhì)粒pSNAV 2.0購自北京本元正陽基因技術(shù)有限公司；宿主菌為大腸桿菌DH5α株，購自北京博大泰克生物基因技術(shù)有限公司；金黃地鼠腎細胞BHK-21、包裝重組AAV 2用輔助病毒HSV1-rc/ΔUL2、r AAV 2顆粒滴度測定試劑盒及空載腺相關(guān)病毒r AAV 2-EGFP（規(guī)格：5.0×1012v.g./m L）購自北京本元正陽基因技術(shù)有限公司；限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、DNA marker以及SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒均購自Ta KaRa公司，LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司，濃縮型鼠抗人CIP2A多克隆抗體（sc-80659）及二抗試劑均購自Santa Cruz公司。人肝癌細胞系HepG2購自中國科學院細胞庫，西安交通大學醫(yī)學部生物醫(yī)學基礎(chǔ)研究中心保存。

1.2 方法

1.2.1 CIP2A shRNA的設(shè)計和構(gòu)建 參考KHANNA等［7］在胃癌中的研究文獻，選擇5′-ACCATTGATATCCTTAGAA-3′作為干擾靶序列，結(jié)合shRNA設(shè)計原則，按上述靶位點設(shè)計編碼具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的siRNA正義鏈和反義鏈的表達載體，在每條寡核苷酸鏈兩端分別加入用于酶切的Bam HⅠ和Hin dⅢ位點，以及作為RNA聚合酶Ⅲ轉(zhuǎn)錄終止信號TTTTT序列，2個反向互補排列的19nt特異性序列結(jié)構(gòu)和1個9nt的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。具體設(shè)計合成序列如下：sense：5′-GATCCGACCATTGATATCCTTAGAATTCAAGAGATTCTAAGGATATCAATGGTTTTTTA-3′；antisense：5′-AGCTTAAAAAAACCATTGATATCCTTAGAATCTCTTGAATTCTAAGGATATCAATGGTTTG-3′。將該序列交由北京本元正陽基因技術(shù)有限公司負責合成鑒定。

1.2.2 重組質(zhì)粒p DC316-EGFP-CIP2A sh RNA的構(gòu)建與鑒定 將寡核苷酸單鏈退火形成雙鏈DNA，利用Bam HⅠ和Hin dⅢ限制性內(nèi)切酶雙酶切pDC316-EGFP-U6質(zhì)粒并回收載體片段，采用T4 DNA連接酶連接雙鏈DNA及線性化質(zhì)粒p DC316-EGFP-U6，命名為重組質(zhì)粒pDC316-EGFP-CIP2A shRNA-U6，熱休克法轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌DH5α，挑取單克隆培養(yǎng)，接種于LB液體培養(yǎng)基，提取質(zhì)粒。PCR鑒定重組質(zhì)粒p DC316-EGFP-CIP2A sh RNA-U6，鑒定引物序列：forward：5′-TGTAGAGGTTTTACTTGCTT-3′；reward：5′-CATATACGATACAAGGCTG-3′，擴增產(chǎn)物503 bp。經(jīng)PCR鑒定陽性的克隆，將細菌擴增培養(yǎng)送北京奧科鼎盛生物科技有限公司檢測核苷酸序列。

1.2.3 重組腺相關(guān)病毒載體質(zhì)粒pSNAV 2.0-EGFPCIP2A shRNA的構(gòu)建與鑒定 以重組質(zhì)粒p DC316-EGFP-CIP2A shRNA為模板，進行PCR擴增。擴增引物設(shè)計上游為重組質(zhì)粒中的EGFP基因讀碼框5′端特異性互補序列（EGFP-f）：5′-GCCAGAATTCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC-3′，同時引入Eco RⅠ位點；下游為重組質(zhì)粒中的U6啟動子5′端特異性互補序列（U6-r）：5′-CTGCGTCGACCCCCAGTGGAAAGACGCGCA-3′，同時引入SalⅠ位點?；厥誔CR產(chǎn)物，Eco RⅠ和SalⅠ雙酶切EGFP-CIP2A sh RNAU6片段及pSNAV2.0質(zhì)粒，采用T4 DNA連接酶連接上述酶切產(chǎn)物，命名為pSNAV2.0-EGFPCIP2A shRNA，熱休克法轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌DH5α，挑取單克隆培養(yǎng)，接種于LB液體培養(yǎng)基，提取質(zhì)粒。測序鑒定經(jīng)Eco RⅠ和SalⅠ雙酶酶切陽性的克隆，送北京奧科鼎盛生物科技有限公司檢測核苷酸序列。

1.2.4 腺相關(guān)病毒的包裝、擴增、純化以及滴度檢測

按照lipofectamine 2000試劑說明書將重組質(zhì)粒pSNAV2.0-EGFP-CIP2A shRNA轉(zhuǎn)染入金黃地鼠腎細胞BHK-21，G418（800μg/m L）篩選培養(yǎng)待有G418抗性的細胞克隆形成并逐漸生長至孔底面積50%左右，用2.5 g/L的胰蛋白酶消化，繼續(xù)用含G418的細胞培養(yǎng)液選擇培養(yǎng)，直至細胞長至90%左右傳代，傳代后細胞培養(yǎng)液不再加入G418篩選，將此細胞命名為BHK-21/CIP2A sh RNA。將穩(wěn)定傳代細胞轉(zhuǎn)移至轉(zhuǎn)瓶中培養(yǎng)，待細胞長滿后加入輔助病毒HSV1-rc/ΔUL2，經(jīng)48 h孵育后收集含病毒r AVV2-EGFP-CIP2 A shRNA的上清液。采用氯仿處理-聚乙二醇/NaCl沉淀-氯仿抽提進行病毒的分離、濃縮和純化。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳法檢測腺相關(guān)病毒r AAV的衣殼蛋白。按本元正陽基因技術(shù)有限公司提供的AVSachTMELISA法r AAV2顆粒滴度測定試劑盒產(chǎn)品說明書方法進行病毒滴度測定。

1.2.5 腺相關(guān)病毒感染肝癌細胞Hep G2 按感染復數(shù)（multiplicity of infection，MOI）分別為5×104v.g./cell、1×105v.g./cell、2×105v.g./cell計算所需加r AAV2-EGFP-CIP2A sh RNA病毒的體積數(shù)，采用本元正陽基因技術(shù)有限公司提供的r AAV2-EGFP為陽性對照病毒（病毒滴度為1×1012v.g./ m L），以無血清的RPMI 1640培養(yǎng)液作空白對照，病毒感染1 h后，加入丁酸鈉（終濃度50 mmol/L）以增強表達。熒光顯微鏡下計數(shù)綠色熒光細胞，計算病毒感染效率，選擇最佳的病毒感染滴度。將同等條件下培養(yǎng)的Hep G2細胞分為3組：r AAV2-CIP2A shRNA（干擾組）、r AAV2-EGFP（空載病毒，陰性對照組）以及無血清RPMI 1640培養(yǎng)液替代病毒感染（空白對照組）。3組處理細胞在同等條件下培養(yǎng)，設(shè)感染后24、48 h兩時間點收集細胞。

1.2.6 靶基因CIP2A沉默效率的驗證 采用Realtime PCR分析不同處理組的HepG2細胞內(nèi)CIP2A mRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化。應用IQ5快速實時定量PCR軟件系統(tǒng)，根據(jù)設(shè)定的閾值，從擴增曲線中直接獲得循環(huán)閾值（Ct）。對Ct值進行相對定量分析。Western blot方法檢測轉(zhuǎn)染后細胞內(nèi)CIP2A蛋白的表達水平。GIS1000分析軟件根據(jù)蛋白印記結(jié)果圖上條帶灰度值計算各組細胞內(nèi)CIP2A蛋白的相對表達量。

1.2.7 統(tǒng)計學方法 全部數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 pSNAV2.0-EGFP-CIP2A shRNA鑒定以鑒定正確的p DC316-EGFP-CIP2A shRNA克隆為模板（圖1、2），PCR擴增EGFP-CIP2A sh RNA片段，Eco RⅠ和SalⅠ雙酶切PCR擴增產(chǎn)物及pSNAV2.0質(zhì)粒后進行連接形成重組質(zhì)粒pSNAV2.0-EGFPCIP2A shRNA，將雙酶切產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示酶切鑒定與預期結(jié)果相符（圖3）。測序結(jié)果顯示重組質(zhì)粒pSNAV2.0-EGFP-CIP2A sh RNA構(gòu)建成功（圖4）。

圖1 p DC316-EGFP-CIP2A shRNA-U6 PCR質(zhì)粒的PCR電泳圖Fig.1 Electrophoretic map of p DC316-EGFP-CIP2A sh RNA-U6 PCR plasmid

圖2 p DC316-EGFP-CIP2A shRNA-U6質(zhì)粒測序圖Fig.2 The DNA sequence of p DC316-EGFP-CIP2 A shRNA-U6 PCR plasmid

圖3 pSNAV2.0-EGFP-CIP2A shRNA重組質(zhì)粒雙酶切電泳圖Fig.3 Electrophoretic map of recombinant plasmid pSNAV2.0-EGFP-CIP2 A shRNA

2.2 重組腺相關(guān)病毒的純度及滴度結(jié)果將經(jīng)過包裝，大量擴增及純化后的重組腺相關(guān)病毒載體r AVV2-CIP2A sh RNA進行SDS-PAGE電泳法檢測了r AAV2的衣殼蛋白（VP1、VP2、VP3），電泳后將膠進行考馬斯亮藍染色及脫色處理，結(jié)果顯示在VP1、VP2、VP3蛋白呈現(xiàn)3條特征性的染色條帶，位置與其相應蛋白量大小一致，無明顯雜帶（圖5）。

利用HRP標記小鼠抗r AVV2單克隆抗體與待檢測樣品和試劑盒中標準品中r AVV2顆粒相結(jié)合，然后加入底物顯色。根據(jù)試劑盒提供的標準品顯色反應程度作出標準曲線，根據(jù)標準曲線進行待測樣品的r AVV2顆粒定量。經(jīng)測定純化所得r AVV2病毒滴度為0.25×1012v.g./m L，滿足下一步體內(nèi)外實驗需要。

2.3 r AVV2-EGFP-CIP2A shRNA在肝癌細胞HepG2中的表達熒光顯微鏡下觀察MOI值為5×104時，可見少量綠色熒光蛋白表達；MOI值為1×105時，表達綠色熒光蛋白的細胞逐漸增多，熒光強度增強；MOI值為2×105時，表達綠色熒光蛋白的細胞未見明顯增多（圖6）。進一步在熒光顯微鏡下隨機選取3個視野，計數(shù)各組100個細胞下綠色熒光細胞百分數(shù)（表1），結(jié)果提示隨著MOI值上升，表達綠色熒光蛋白的細胞逐漸增多，熒光強度逐漸增強。與MOI值為1×105感染組相比較，MOI值為2×105時感染效率無明顯提高，且感染HepG2細胞逐漸變圓，懸浮數(shù)目增多，貼壁能力下降，因此實驗將選擇MOI值為1×105作為rAAV2轉(zhuǎn)染HepG2細胞最適值。

圖4 pSNAV2.0-EGFP-CIP2A shRNA重組質(zhì)粒測序圖Fig.4 The DNA sequence of recombinant plasmid pSNAV2.0-EGFP-CIP2A shRNA

圖5 r AAV2的衣殼蛋白條帶Fig.5 The bands of r AAV2 capsid protein

表1 r AAV2感染HepG2細胞效率的比較Tab.1 Comparison of r AAV2 transfection efficiency in infected HepG2 cells

A：陽性對照病毒r AAV2-EGFP；B：MOI 5×104病毒組；C：MOI 1×105病毒組；D：MOI 2×105病毒組。

2.4 r AVV 2-EGFP-CIP2A shRNA對靶基因的抑制效果Real-time PCR分析不同處理組的HepG2細胞內(nèi)CIP2A mRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化，r AVV 2-EGFP-CIP2A shRNA感染細胞24 h后細胞內(nèi)CIP2A mRNA轉(zhuǎn)錄水平即被明顯抑制（P＜0.001），感染48 h后基因抑制作用持續(xù)存在，而空載病毒感染組（r AVV 2-EGFP）及空白對照組相比未見差異（P＞0.05，圖7）。

圖7 HepG2細胞內(nèi)CIP2A mRNA相對轉(zhuǎn)錄水平的比較Fig.7 Comparison of CIP2A mRNA relative transcription level in HepG2 cells

采用Western blot檢測不同處理組的HepG2細胞內(nèi)CIP2A蛋白表達，蛋白印記結(jié)果顯示各特異性條帶（圖8A）。GIS1000分析軟件根據(jù)蛋白印記結(jié)果圖上條帶灰度值計算各組細胞內(nèi)CIP2 A蛋白相對表達量（圖8B），結(jié)果顯示同等條件下不同處理24 h后各組間細胞內(nèi)CIP2A蛋白表達無明顯差異；感染48 h后細胞內(nèi)CIP2A蛋白表達明顯下降，與空載病毒感染組（r AVV2-EGFP）及空白對照組相比有統(tǒng)計學差異（P＜0.001）；而r AVV2-EGFP組與空白對照組相比，CIP2A蛋白的表達未見差異（P＞0.05）。

3 討 論

圖8 HepG2細胞內(nèi)CIP2A蛋白表達水平的比較Fig.8 Comparison of CIP2A protein expression level in HepG2 cells

CIP2 A在人類多種腫瘤組織中存在異常高表達，其與腫瘤的惡性生物學特性密切相關(guān)。CIP2 A能夠抑制PP2A活性的蛋白，其可以通過抑制PP2A的B56α調(diào)節(jié)亞基對癌蛋白c-Myc第62位絲氨酸脫磷酸化作用，從而穩(wěn)定c-Myc蛋白二元磷酸化結(jié)構(gòu)，抑制c-Myc蛋白被泛素化水解。同時，c-Myc作為核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子又能夠調(diào)節(jié)CIP2 A mRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化從而形成一個正反饋環(huán)路［7-8］。CIP2A在人類頭頸部鱗狀細胞癌、結(jié)腸癌、胃癌、乳腺癌以及非小細胞肺癌中存在高表達，且與腫瘤惡性分化程度相關(guān)，提示不良預后［9］。細胞學實驗進一步證實，CIP2A在維持細胞表型轉(zhuǎn)化，促進細胞增殖和體內(nèi)腫瘤生長方面起關(guān)鍵作用；推測CIP2A可能和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，被列為一新的癌候選基因［2］。我們前期研究已證實，CIP2A在肝癌組織中高表達，且與肝癌的惡性臨床病理特征密切相關(guān)。

RNA干擾（RNA interference，RNAi）技術(shù)是與某段內(nèi)源性mRNA編碼區(qū)序列同源的ds RNA在細胞內(nèi)發(fā)揮特異性降解該段mRNA作用，從而使得該段基因表達沉默［10-11］。shRNA是一段具有緊密發(fā)卡環(huán)的RNA序列，包括兩個短反向重復序列，中間由一莖環(huán)序列分隔組成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。shRNA進入細胞后會被細胞質(zhì)內(nèi)Dicer酶剪切加工成siRNA進而發(fā)揮RNAi作用。sh RNA被質(zhì)粒或病毒載體所轉(zhuǎn)載導入細胞，載體中的U6啟動子確保sh RNA總是表達；裝載了shRNA載體可被傳遞到子代細胞中去使基因的沉默可被遺傳，使得RNAi作用更為持久長效。本實驗中根據(jù)文獻中所提及的CIP2 A siRNA堿基序列，選擇其相應的特異性的干擾位點，按照shRNA設(shè)計原則設(shè)計相應的CIP2A shRNA序列，從而簡化了前期篩選siRNA等長時間的研究，并在轉(zhuǎn)染CIP2A sh RNA的肝癌細胞HepG2中采用Real-time PCR及Western blot方法進行鑒定，結(jié)果證實了該CIP2A shRNA序列能夠有效地抑制靶基因CIP2A的表達。

構(gòu)建高效穩(wěn)定的RNAi表達載體除了必須有與產(chǎn)生siRNA相應的DNA模板序列，另一方面載體因素至關(guān)重要，即選擇安全、高效、免疫原性小、無特殊致病性的穩(wěn)定表達載體。目前，RNAi研究工作中基因載體系統(tǒng)主要包括病毒性和非病毒性，非病毒性載體系統(tǒng)中應用最為廣泛的是質(zhì)粒載體，其屬于細菌，是一種可在細胞內(nèi)自我復制的環(huán)狀雙鏈DNA分子，經(jīng)人工改造或構(gòu)建的質(zhì)粒載體帶有抗生素抗性基因，將質(zhì)粒載體與設(shè)計合成的DNA模板相連接構(gòu)建siRNA質(zhì)粒表達載體轉(zhuǎn)染入細胞，通過抗生素篩選獲得穩(wěn)定表達，其抑制靶基因表達的作用持續(xù)時間在10～14 d左右，只局限于細胞水平的研究，不能進行體內(nèi)實驗研究［12］。病毒載體是利用病毒具有傳送其基因組進入細胞進行感染的分子機制，將攜帶的目的DNA模板整合入宿主細胞。該機制可發(fā)生于細胞培養(yǎng)及活體動物中，目前廣泛應用于基礎(chǔ)基因研究，甚至開始逐步進入病毒疫苗等基因治療的臨床試驗中［13］。腺相關(guān)病毒是單鏈DNA病毒，屬于微小病毒科。作為基因表達載體，AAV基因組中刪除了野生型AAV的致病基因，提高其安全性同時降低了其免疫原性，同時AAV可以感染分裂及非分裂期細胞，最為重要的是AAV以位點特異性方式整合于人類第19號染色體上，從而保證持續(xù)穩(wěn)定表達所攜帶的外源性基因，同時避免與染色體基因組隨機整合導致宿主細胞引起基因突變的潛在危險［6］。AAV表達載體因其獨特的優(yōu)勢已成為目前基因載體研究的熱點，廣泛應用于基因功能研究、構(gòu)建疾病模型、制備基因敲除小鼠等方面。同時，有關(guān)AAV基因藥物的臨床研究已有60余項，涉及癌癥、糖尿病、眼部疾病以及神經(jīng)系統(tǒng)疾病等研究［14］。

因此，本研究利用重組腺相關(guān)病毒r AAV 2作為基因表達載體，以CIP2A特異性干擾位點設(shè)計合成CIP2A shRNA干擾序列，將CIP2A shRNA插入至相應表達載體中，經(jīng)反復RT-PCR、酶切及測序驗證插入序列結(jié)構(gòu)，采用經(jīng)典包裝方法最終獲得攜帶CIP2A shRNA重組腺相關(guān)病毒。按MOI值為1×105的r AAV 2-CIP2A shRNA感染肝癌細胞HepG2，證實感染CIP2A shRNA重組腺相關(guān)病毒后能夠特異且有效地抑制肝癌細胞HepG2中靶基因CIP2A的表達，為進一步探索CIP2A基因功能的體內(nèi)外實驗研究奠定了基礎(chǔ)。

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（編輯 韓維棟）