熊永江，劉純青，戴志紅，董相權(quán)，劉志宇

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院泌尿外科，重慶 402160；2.大連醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，遼寧大連 116044；3.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院泌尿外科，遼寧大連 116027)

·基礎(chǔ)研究·

三氧化二砷聯(lián)合環(huán)杷明協(xié)同抑制PC3細(xì)胞生長(zhǎng)及其機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究

熊永江1，劉純青2，戴志紅3，董相權(quán)3，劉志宇3

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院泌尿外科，重慶 402160；2.大連醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，遼寧大連 116044；3.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院泌尿外科，遼寧大連 116027)

目的 探討三氧化二砷(ATO)聯(lián)合環(huán)杷明(cyclopamine，CYA)對(duì)非雄激素依賴前列腺癌PC3細(xì)胞增殖的影響及其分子學(xué)機(jī)制。方法 采用MTT比色法檢測(cè)不同濃度ATO及CYA單獨(dú)或聯(lián)合治療對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)PC3細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。應(yīng)用裸鼠致瘤實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證ATO聯(lián)合CYA對(duì)PC3細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。Western blot檢測(cè)ATO聯(lián)合CYA對(duì)PC3細(xì)胞內(nèi)Hedgehog(Hh)信號(hào)通路中重要蛋白Smoothened(Smo)、Patched (Ptch)及GLI1的影響。結(jié)果 ATO或CYA抑制PC3細(xì)胞生長(zhǎng)呈現(xiàn)明顯的劑量及時(shí)間依賴性，且兩藥聯(lián)合對(duì)PC3細(xì)胞生長(zhǎng)有協(xié)同殺傷作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)ATO聯(lián)合CYA較單劑量組更能明顯抑制PC3細(xì)胞移植瘤的生長(zhǎng)(P<0.05)。Western blot 結(jié)果證實(shí)ATO和CYA聯(lián)合較單劑量組更明顯下調(diào)Smo、Ptch及GLI1的表達(dá)。結(jié)論 ATO聯(lián)合CYA能協(xié)同抑制PC3細(xì)胞的生長(zhǎng)，其機(jī)制可能是兩藥聯(lián)合協(xié)同下調(diào)PC3細(xì)胞中Hh信號(hào)通路的表達(dá)。

前列腺癌；PC3細(xì)胞；三氧化二砷；Hedgehog信號(hào)通路

前列腺癌(prostatic cancer, Pca)在西方國(guó)家位居男性惡性腫瘤之首，近年來我國(guó)Pca的發(fā)病率亦大幅提升，雖然治療水平已有明顯提高，但是大多數(shù)患者將在較短時(shí)間里發(fā)展成為非雄激素依賴Pca，而對(duì)此階段的Pca尚無確切有效的治療手段[1]。因此，探索非雄激素依賴Pca的發(fā)生機(jī)制及有效的治療藥物是目前臨床迫切需要解決的問題。Hedgehogh(Hh)信號(hào)通路在非雄激素依賴前列腺癌的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[2]。最近BEAUCHAMP等[3]研究表明三氧化二砷(arsenic trioxide，ATO)可以通過下調(diào)GLI1基因阻滯尤文肉瘤和成神經(jīng)管細(xì)胞瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，提示ATO對(duì)Hh信號(hào)通路異常激活的惡性腫瘤具有潛在的抗癌作用。在二期臨床試驗(yàn)中單用ATO對(duì)一些實(shí)體瘤如轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌療效比較有限[4]。但是，高劑量的ATO用于實(shí)體瘤的治療伴隨著較高臨床風(fēng)險(xiǎn)[5]。因此，ATO與其他化療藥的聯(lián)合治療將是一個(gè)很好的策略，以達(dá)到增效減毒的作用。最近BEACHY等[6]以ATO聯(lián)合環(huán)杷明(cyclopamine, CYA)治療已經(jīng)轉(zhuǎn)染GLI信號(hào)的小鼠成纖維細(xì)胞(NIH3T3 fibroblasts cells)，發(fā)現(xiàn)作用于Hh通路不同位點(diǎn)的兩種藥物聯(lián)合能夠明顯降低藥物劑量，但對(duì)Hh通路產(chǎn)生了更為顯著的阻滯作用。

基于上述研究基礎(chǔ)，我們提出ATO與Smoothened (Smo) 特異的拮抗劑CYA聯(lián)合應(yīng)用治療非雄依賴的Pca的設(shè)想。本研究選取非雄依賴的Pca細(xì)胞株P(guān)C3細(xì)胞，通過體外細(xì)胞培養(yǎng)及裸鼠實(shí)驗(yàn)，觀察ATO及CYA單獨(dú)及聯(lián)合應(yīng)用對(duì)PC3細(xì)胞增殖的影響，并進(jìn)一步探討其內(nèi)在細(xì)胞分子機(jī)制，以明確ATO聯(lián)合CYA對(duì)非雄依賴Pca的潛在治療效果。

1 材料與方法

1.1 主要藥物及試劑 人前列腺癌PC3細(xì)胞株購(gòu)于中科院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫。裸鼠購(gòu)買并飼養(yǎng)于大連醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào)：SYXK(遼)2013-0006，三氧化二砷注射液購(gòu)自哈爾濱伊達(dá)藥業(yè)有限公司；Cyclopamine(粉劑)，購(gòu)自美國(guó)LC實(shí)驗(yàn)室；Ptch、Gli1、Smo、抗體購(gòu)于美國(guó)Abcam公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) PC3細(xì)胞用含10%新生牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的Ham’S F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于5% CO2培養(yǎng)箱、37 ℃飽和濕度培養(yǎng)，待細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)行藥物干預(yù)。

1.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性 消化并收集PC3細(xì)胞，以1×106/mL培養(yǎng)液稀釋,按照200 μL/孔接種于無菌96孔培養(yǎng)板，不同濃度的ATO (2.5、5、10、20 μmol/L)和不同濃度的CYA (4、8、16、32 μmol/L)及兩者聯(lián)合給藥，同時(shí)設(shè)立對(duì)照組為參照，每個(gè)濃度3個(gè)復(fù)孔，分別處理24、48 及72 h后加入MTT 20 μL，繼續(xù)孵育4 h后棄上清，加入200 μL DMSO輕微震蕩10 min，酶標(biāo)儀測(cè)490 nm A值，細(xì)胞增殖抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值)×100%。

1.4 前列腺癌裸鼠實(shí)驗(yàn) 調(diào)整對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PC3細(xì)胞濃度為1×107/mL，吸取50 μL Matrigel置于冰上，加入50 μL單細(xì)胞懸液，混勻，迅速接種于裸鼠左前肢近腋窩皮下。每周以游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤體積，腫瘤體積計(jì)算公式為：腫瘤大小=長(zhǎng)×寬×寬×0.5[7]。裸鼠24只，SPF級(jí)，雄性，5～6周齡，體重18～20 mg，隨機(jī)分為4組，每組6只。設(shè)立空白對(duì)照組，治療組分別以ATO(5 mg/kg)、CYA (16 mg/kg)、及兩者聯(lián)合給藥、隔日一次腹腔注射，共治療5周。

1.5 Western blot檢測(cè) ATO 2.5 μmol/L、CYA 8 μmol/L單用及聯(lián)合分別治療PC3細(xì)胞48 h后收集細(xì)胞，提取蛋白質(zhì)，測(cè)定蛋白濃度，配膠，加樣，濃縮膠60 V、分離膠 120電泳至條帶明顯分開，轉(zhuǎn)膜約90 min，5%牛奶封閉2 h，TBST清洗3次，然后一抗4度孵育過夜，次日二抗常溫孵育2 h，TBST清洗3次后于暗室ECL發(fā)光，暗盒曝光，顯影，定影，拍照。

2 結(jié) 果

2.1 ATO與CYA協(xié)同抑制PC3細(xì)胞生長(zhǎng) ATO和CYA均能抑制PC3細(xì)胞的生長(zhǎng)，且呈現(xiàn)出明顯的劑量及時(shí)間依賴性( 圖1A、1B)。在此基礎(chǔ)上，本研究選取2.5 μmol/L ATO聯(lián)合8 μmol/L CYA治療PC3細(xì)胞(圖1C)，24 h抑制PC3細(xì)胞達(dá)25.2%，與2倍劑量的ATO(21.5%，P>0.05)或CYA (28.3%，P>0.05)效果類似，但明顯優(yōu)于單劑量ATO(8.5%，P<0.05)或CYA(5.9%，P<0.05)；48 h抑制PC3細(xì)胞達(dá)48.9%，明顯優(yōu)于2倍劑量的ATO(38.7%，P<0.05)或CYA (32.6%，P<0.05)；72 h抑制PC3細(xì)胞達(dá)55.7%，盡管效果也優(yōu)于2倍劑量的ATO(49%)或CYA(40.7%)，但統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異并不顯著(P>0.05)。

應(yīng)用Chou’s公式[8]對(duì)兩藥是否具有協(xié)同作用進(jìn)行分析，結(jié)果顯示2.5 μmol/L ATO聯(lián)合8 μmol/L CYA治療24、48及72 h其聯(lián)合指數(shù)(combination index value，CI)均小于1，提示ATO和CYA聯(lián)合化療具有協(xié)同作用。

2.2 ATO與CYA聯(lián)合應(yīng)用對(duì)PC3細(xì)胞致瘤裸鼠移植瘤的抑制作用 各組腫瘤體積在0～10 d內(nèi)無明顯差異，第17天三個(gè)治療組腫瘤體積和對(duì)照組比較開始下降，第24天可觀察到明顯差異，第31天差異進(jìn)一步擴(kuò)大，治療結(jié)束時(shí)ATO治療組、CYA治療組以及聯(lián)合治療組與對(duì)照組比較均能顯著阻滯PC3細(xì)胞移植瘤生長(zhǎng)，抑瘤率分別為35.4% (P<0.05)、39.5%(P<0.05)和79.1% (P<0.05) (圖2A、2C)，且聯(lián)合治療組的移植瘤體積明顯低于兩個(gè)單劑量藥物組(P<0.05,圖2B)。同樣，各組腫瘤重量與腫瘤體積結(jié)果相似(圖2D)。

圖1 MTT比色法檢測(cè)ATO、CYA及其聯(lián)合應(yīng)用對(duì)PC3細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用

A：ATO(呈時(shí)間和劑量依賴性)；B：CYA(呈時(shí)間和劑量依賴性)；C：ATO和CYA協(xié)同抑制作用。與對(duì)照組比較,*P<0.05，與聯(lián)合組比較,#P<0.05。

圖2 ATO聯(lián)合CYA對(duì)PC3細(xì)胞致瘤裸鼠移植瘤的抑制作用

A:移植瘤位置；B:移植瘤體積折線圖；C:移植瘤大體觀；D:移植瘤質(zhì)量柱狀圖。與對(duì)照組比較，*P<0.05；與單劑量藥物組比較，#P<0.05。

2.3 ATO與CYA聯(lián)合治療對(duì)PC3細(xì)胞內(nèi)Hh信號(hào)通路重要蛋白表達(dá)的影響 為了探索ATO與CYA協(xié)同抑制PC3細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制，我們通過Western blot檢測(cè)Hh信號(hào)通路中Smo、Ptch及Gli1蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示ATO治療組Ptch及Gli1表達(dá)水平降低，對(duì)Smo的表達(dá)無明顯影響；聯(lián)合治療組Ptch及Gli1表達(dá)進(jìn)一步降低；與對(duì)照組比較均明顯下調(diào)，同時(shí)聯(lián)合治療組與ATO及CYA單劑量藥物組比較進(jìn)一步下調(diào)Ptch及Gli1蛋白表達(dá)(圖3)。

圖3 Western blot檢測(cè)ATO聯(lián)合CYA對(duì)PC3細(xì)胞內(nèi)Hh信號(hào)通路中重要蛋白Smo、Ptch及GLI1的影響

3 討 論

Hh信號(hào)通路是調(diào)節(jié)胚胎正常發(fā)育過程中各種組織生長(zhǎng)必不可少的信號(hào)通路之一,其主要功能為控制細(xì)胞增殖。Hh信號(hào)通路受細(xì)胞跨膜蛋白Ptch及Smo控制，當(dāng)Hh和細(xì)胞膜上的接收器Ptch結(jié)合時(shí)，釋放被Ptch抑制的跨膜蛋白Smo，然后激活的Smo誘導(dǎo)增強(qiáng)下游的GLI的活性，故有研究者將Hh信號(hào)通路形象的稱為Hh-Gli通路。前列腺癌的進(jìn)展是一個(gè)復(fù)雜的過程，涉及變異的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑。 Hh信號(hào)通路是這樣的途徑之一，越來越多的證據(jù)表明Hh信號(hào)通路異常激活在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用[2, 9]。

本研究通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了ATO聯(lián)合CYA可以明顯抑制非雄激素依賴前列腺癌PC3細(xì)胞生長(zhǎng)，且具有協(xié)同作用(CI<1)。我們進(jìn)一步探討ATO和CYA協(xié)同作用可能存在的分子機(jī)制。眾所周知，ATO治療急性粒細(xì)胞白血病具有較高的完全緩解率，主要是作用于PML/RAR蛋白的鋅指結(jié)構(gòu)[10]。同樣GLI家族亦有鋅指結(jié)構(gòu)，HAN等學(xué)者通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)ATO可以結(jié)合GLI1鋅指結(jié)構(gòu)蛋白而抑制胰腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[11]。在本研究中，CYA以及ATO單獨(dú)處理PC3細(xì)胞分別主要減少Smo和GLI的表達(dá)，這與先前的研究結(jié)果一致。此外，我們的結(jié)果表明，ATO和CYA聯(lián)合治療和單一藥物治療比較能夠顯著抑制GLI1蛋白的表達(dá)。在Hh通路，Ptch不僅是一種通路阻滯劑的受體，而且作為這條通路的靶基因，形成負(fù)反饋機(jī)制，以維持Hh信號(hào)通路活性在適當(dāng)水平[12]。為了進(jìn)一步說明的ATO聯(lián)合CYA對(duì)Hh通路的作用，我們對(duì)Ptch蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。Ptch的表達(dá)水平在ATO、CYA及聯(lián)合治療組均下降，其中在聯(lián)合用藥組下降最為明顯。相似地，KIM等[13]研究發(fā)現(xiàn)伊曲康唑和ATO主要作用為分別抑制Smo/GLI蛋白，聯(lián)合應(yīng)用時(shí)對(duì)Smo拮抗劑已產(chǎn)生耐藥的成神經(jīng)管細(xì)胞瘤細(xì)胞同樣有著疊加抑制Hh信號(hào)通路活性以及腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。綜上所訴，這種多靶點(diǎn)治療有助于協(xié)同抗癌作用。

激素非依賴性Pca目前無確切有效的治療藥物及手段，而癌細(xì)胞的增殖擴(kuò)散則常常是導(dǎo)致患者最終死亡的重要原因。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了ATO聯(lián)合CYA能協(xié)同抑制PC3細(xì)胞的增殖，主要通過下調(diào)Hh信號(hào)通路活性，為今后可能的臨床應(yīng)用提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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(編輯 何宏靈)

An experimental study on synergism between arsenic trioxide and cyclopamine in the inhibition of PC3 cell survival and its mechanisms

XIONG Yong-jiang1, LIU Chun-qing2, DAI Zhi-hong3, DONG Xiang-quan3, LIU Zhi-yu3

(1. Department of Urology, Yongchuan Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 402160, China; 2. College of Medical Laboratory, Dalian Medical University, Dalian 116044; 3. Department of Urological Surgery, Second Affiliated Hospital of Dalian Medical University, Dalian 116027, China)

Objective To investigate the effect of arsenic trioxide (ATO) alone and in combination with cyclopamine (CYA) on the proliferation of PC3 cells and to further explore its molecular mechanism. Methods PC3 cells were treated with different concentrations of ATO and CYA alone or in combination for different periods, and cell viability was analyzed with MTT assay. PC-3 xenograft model was used to further investigate the antiproliferative effects of ATO combined with CYA. The expressions of Hh target genes Ptch, Smo, and Gli1 were determined by Western blot. Results The results of MTT displayed that ATO or CYA alone reduced the viability of PC3 cells in a concentration-dependent and time-dependent manner and exhibited a synergism. Combined treatment of the cells with ATO and CYA dramatically increased antiproliferative effects in nude mice compared with ATO or CYA treatments alone (P<0.05). The combined treatment of ATO and CYA was much more effective than CYA or ATO alone in terms of down-regulating the Ptch, Smo, and Gli1 expressions in PC3 cells. Conclusions ATO showed synergism with CYA in inhibiting the growth of PC3 cells. The exact mechanism may involve downregulation of Hh pathway.

prostatic cancer; PC3 cells; arsenic trioxide; hedgehog signaling pathway

2015-01-30

2015-04-08

劉志宇，博士，主任醫(yī)師. E-mail：letter89@163.com

熊永江(1988-)，男(漢族)，醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士.主要從事泌尿外科基礎(chǔ)與臨床研究.E-mail：xiongyongjiang1988@126.com

R34

A

10.3969/j.issn.1009-8291.2015.08.017