施云峰, 莫乃新, 呂 忠, 吳 斌, 史紅雷，王旭剛

(江蘇大學(xué)附屬武進(jìn)醫(yī)院泌尿外科,江蘇常州 213002)

·基礎(chǔ)研究·

抑制CD24基因?qū)Π螂装┘?xì)胞生物學(xué)行為的影響

施云峰, 莫乃新, 呂 忠, 吳 斌, 史紅雷，王旭剛

(江蘇大學(xué)附屬武進(jìn)醫(yī)院泌尿外科,江蘇常州 213002)

目的 利用特異性siRNA沉默CD24基因表達(dá)，探討CD24的表達(dá)抑制對(duì)體外膀胱癌細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲的影響。方法 利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將含有CD24特異性siRNA的真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至人膀胱癌T24細(xì)胞中，實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot法檢測(cè)T24細(xì)胞中CD24基因的表達(dá)情況，MTT法、劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwells侵襲實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)調(diào)控CD24的表達(dá)對(duì)體外膀胱癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲作用的影響。結(jié)果 我們成功建立CD24 siRNA轉(zhuǎn)染的膀胱癌T24細(xì)胞株。經(jīng)實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot法證實(shí)siRNA組較空載體組細(xì)胞CD24 mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平明顯降低。MTT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)siRNA組較空載體組細(xì)胞的增殖能力顯著下降。劃痕實(shí)驗(yàn)提示siRNA組細(xì)胞的遷移能力顯著降低；Transwells侵襲實(shí)驗(yàn)顯示siRNA組的穿膜細(xì)胞數(shù)顯著少于空載體組。結(jié)論 特異性siRNA沉默CD24基因表達(dá)能顯著抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖和遷移，同時(shí)明顯抑制其體外侵襲能力。

膀胱癌；細(xì)胞增殖；侵襲；RNA干擾

早期膀胱癌可以通過(guò)手術(shù)獲得較好的療效，但是發(fā)生轉(zhuǎn)移的晚期膀胱癌的治療仍是臨床的難點(diǎn)，針對(duì)膀胱癌轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)研究具有積極的意義。有研究發(fā)現(xiàn)CD24 高表達(dá)于多種腫瘤細(xì)胞膜上，并與腫瘤的轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)[1]。在誘導(dǎo)的膀胱癌研究模型中，CD24基因敲除小鼠發(fā)生腫瘤的比例明顯較對(duì)照組低，而且腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移能力減弱[2]。因此我們擬采用RNA干擾技術(shù)阻斷CD24在膀胱癌T24細(xì)胞中的作用，以觀察腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)變化情況，并探討其變化機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 膀胱癌T24細(xì)胞株購(gòu)自中科院上海細(xì)胞研究所，CD24 siRNA真核表達(dá)質(zhì)粒和空載體由上海吉瑪公司構(gòu)建并測(cè)序鑒定，脂質(zhì)體細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑 LipofectamineTM2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；胎牛血清和RPMI-1640培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，CD24單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗購(gòu)自杭州華安生物公司，Transwells小室購(gòu)自美國(guó)Costar公司，BCA蛋白定量試劑盒和ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自美國(guó)Pierce公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 膀胱癌T24細(xì)胞采用RPMI-1640加10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的培養(yǎng)液，置于37°C、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用0.25%的胰酶消化傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞以2×105個(gè)接種于6孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)至60%～80%融合時(shí)開始轉(zhuǎn)染，按照LipofectamineTM2000說(shuō)明轉(zhuǎn)染，共分3組，分別為空白對(duì)照組(未做處理)、陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染無(wú)義siRNA)、CD24-siRNA組(轉(zhuǎn)染CD24 siRNA)，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

1.2.2 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)CD24 mRNA的表達(dá) 轉(zhuǎn)染后48 h收集細(xì)胞，提取各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞總RNA，取1 μg逆轉(zhuǎn)錄到cDNA。CD24引物序列由上海英俊公司合成，CD24上游引物：5′- AAAGAAATGGCTGAAAGAGCAA -3′，下游引物：5′- AGGCTCATAGAACCATGATTACCC -3′，內(nèi)參β-actin上游引物：5′- GTGATGGTGGGAATGGGT -3′，下游引物：5′- TGGGGTGTTGAAGGTCTC -3′。反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 20 s；72 ℃ 20 s，共40個(gè)循環(huán)，然后采用2e -△△Ct相對(duì)定量比較各組差異。

1.2.3 Western blot檢測(cè) 收集轉(zhuǎn)染后96 h的細(xì)胞，用裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度后按60 μg/孔上樣后電泳。4 ℃ 100 V轉(zhuǎn)膜1.5 h至PVDF膜上，PVDF用5%脫脂奶粉TBST液封閉45 min，加入鼠抗人AR單抗(1∶1 000稀釋)，4 ℃孵育過(guò)夜。然后再加入HRP標(biāo)記的二抗(1∶3 000稀釋)孵育1 h，ECL檢測(cè)試劑盒顯色，曝光。圖像掃描后用BandScan軟件作灰度分析。

1.2.4 MTT實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞調(diào)整濃度為4×103個(gè)/孔，種植于96孔板，將細(xì)胞放于37 ℃培養(yǎng)箱、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。每組細(xì)胞設(shè)3個(gè)平衡孔，分別于0、24、48、72 h后，吸去多余培養(yǎng)基，然后加入80 μL新鮮培養(yǎng)基，加入20 μL MTT、37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)4 h；吸去培養(yǎng)基，加入150 μL DMSO，避光置于搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀A590 nm處測(cè)量各孔的A值。

1.2.5 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 將Matrigel基質(zhì)膠與含0.1%BSA的1640液按1∶8比例混合后于37℃包被Transwell小室6 h，然后用50 μL含0.1%BSA的1 640液水化小室30 min。收集轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞，分組同前，重懸浮后以每孔2×104接種于Transwell小室的上室，下室加入600 μL含10%血清培養(yǎng)基，置于孵箱培養(yǎng)24 h。取出Transwell小室，PBS洗滌以4%多聚甲醛固定30 min，棉簽擦去上室未穿膜的細(xì)胞，后用結(jié)晶紫染色30 min，顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)整個(gè)視野內(nèi)穿膜至下面的細(xì)胞數(shù)，計(jì)算平均值。

1.2.6 劃痕實(shí)驗(yàn) 將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞消化接種至6孔板內(nèi)。待細(xì)胞融合度達(dá)100%后，在6孔板背部，均勻劃出橫線，用PBS清洗細(xì)胞3次，去除漂浮的細(xì)胞，加入含2%FBS的1640培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后，沿劃痕邊緣等距離取5個(gè)數(shù)據(jù)測(cè)定點(diǎn)以 Image J軟件測(cè)定細(xì)胞間距，測(cè)量后取平均值。細(xì)胞遷移比例用如下公式計(jì)算：100%-(24 h后的寬度/實(shí)驗(yàn)開始時(shí)的寬度)×100%。

2 結(jié) 果

2.1 特異性siRNA作用對(duì)CD24基因表達(dá)的影響 與空白組比較，陰性對(duì)照組和siRNA組的CD24 mRNA相對(duì)表達(dá)水平分別為1.083±0.21、0.375±0.09。蛋白印跡檢測(cè)顯示siRNA組CD24蛋白的表達(dá)明顯低于其他兩組(P<0.05,圖1、圖2)。

圖1 CD24 mRNA在各組的相對(duì)表達(dá)量

A:柱狀圖；B:熒光顯微鏡下，綠色熒光蛋白在細(xì)胞中廣泛表達(dá)，表明CD24 siRNA和無(wú)義siRNA已成功轉(zhuǎn)入細(xì)胞(×100)。

2.2 CD24表達(dá)抑制對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示，轉(zhuǎn)染CD24-siRNA后的細(xì)胞遷移能力顯著降低(F=278.45，P=0.000)，siRNA組遷移比例為[(38.9±4.85)%]較對(duì)照組[(73.5±9.51)%]、空白對(duì)照組[(75.83±11.24)%]明顯降低(P=0.000)。

2.3 抑制CD24基因表達(dá)對(duì)膀胱T24癌細(xì)胞增殖作用的影響 通過(guò)MTT法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，siRNA組細(xì)胞的吸光度值顯著低于其他兩組，多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，隨著監(jiān)測(cè)時(shí)間延長(zhǎng)，生長(zhǎng)抑制作用加劇(圖3)。

圖2 CD24蛋白在各組的表達(dá)

1.空白對(duì)照組;2.陰性對(duì)照組;3.siRNA組。

圖3 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞在各組中的增殖情況的變化

*與其他組比較，P<0.05。

2.4 抑制CD24基因表達(dá)對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞侵襲能力的影響 Transwells侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，siRNA組穿膜細(xì)胞數(shù)(58.9±19.7)與空白對(duì)照組(163.4±25.5)及陰性對(duì)照組(161.3±18.7)相比明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖4)。

圖4 Transwells侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力變化(×100)

A:空白對(duì)照組;B:陰性對(duì)照組;C:siRNA組。

2.5 調(diào)控CD24基因表達(dá)對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白的影響 蛋白印跡法檢測(cè)顯示，siRNA組細(xì)胞中的細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1、基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9均有明顯降低(圖5)。

圖5 各組細(xì)胞中細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1、基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2、MMP-9的表達(dá)

3 討 論

CD24為一種膜糖蛋白，是P-選擇素的配體之一，在正常生理情況下，參與介導(dǎo)單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞與表達(dá)P-選擇素的內(nèi)皮細(xì)胞、血小板之間的粘附[3]。近年來(lái)，臨床研究發(fā)現(xiàn)CD24 高表達(dá)于多種腫瘤細(xì)胞膜上，并與腫瘤的轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)，已證實(shí)了CD24與乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌及前列腺癌等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[4]。曹曉鋒等[5]研究CD24可能參與了膀胱尿路上皮腫瘤的血管生成，促進(jìn)膀胱腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，CD24的高表達(dá)是腫瘤的浸潤(rùn)性和高分級(jí)的標(biāo)志。LEE等[6]研究顯示在胰腺癌、結(jié)腸癌、肝細(xì)胞癌中CD24陽(yáng)性細(xì)胞群具有自我更新、分化和轉(zhuǎn)移的能力。

我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中針對(duì)CD24基因mRNA特點(diǎn)設(shè)計(jì)合成siRNA分子，轉(zhuǎn)染至膀胱癌T24細(xì)胞。通過(guò)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)CD24基因mRNA水平及蛋白質(zhì)水平均明顯下降，說(shuō)明轉(zhuǎn)染成功抑制了CD24的表達(dá)。后續(xù)的MTT實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell實(shí)驗(yàn)顯示轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力均較空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組顯著減弱。為初步探討細(xì)胞轉(zhuǎn)染后發(fā)生生長(zhǎng)狀態(tài)變化的原因，我們的進(jìn)一步研究提示，在轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中，CD24表達(dá)抑制后細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白(Cyclin D1)和基質(zhì)金屬蛋白(MMP-2、MMP-9)的表達(dá)降低，細(xì)胞的增殖和侵襲能力降低可能與此有關(guān)。siRNA干擾組T-24細(xì)胞MMP-2、MMP-9的分泌量顯著低于對(duì)照組細(xì)胞，這是可能是由于封閉CD24后阻斷了腫瘤細(xì)胞自分泌產(chǎn)生MMPs的結(jié)果[7]。OVERDEVEST等[8]通過(guò)對(duì)比研究膀胱癌的原發(fā)瘤及轉(zhuǎn)移瘤，發(fā)現(xiàn)CD24在轉(zhuǎn)移瘤中高表達(dá)，裸鼠實(shí)驗(yàn)中，運(yùn)用單克隆抗體抑制CD24后，發(fā)現(xiàn)能顯著抑制腫瘤的生長(zhǎng)，并延長(zhǎng)裸鼠生存期。這些都表明CD24在膀胱癌的轉(zhuǎn)移進(jìn)展中可能具有重要的作用。

本研究提示CD24在膀胱癌細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵的作用，深入研究CD24的具體作用機(jī)制以及其參與介導(dǎo)的相關(guān)信號(hào)通路變化，對(duì)以CD24為新靶點(diǎn)的膀胱癌基因生物治療研究具有積極的意義。

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(編輯 何宏靈)

Effects of downregulation of CD24 gene expression on malignant biological behavior of bladder cancer cells

SHI Yun-feng, MO Nai-xin, Lü Zhong, WU Bin, SHI Hong-lei, WANG Xu-gang

(Department of Urology, Affiliated Wujin Hospital of Jiangsu University, Changzhou 213002, China)

Objective To investigate the effects of CD24 knockdown by siRNA on bladder cancer cell proliferation, apoptosis and invasion. Methods CD24 siRNA plasmids were constructed, and then transfected into T24 cells. The mRNA and protein levels of CD24 expression in the transfected cells were detected using qRT-PCR and Western blot assay. The proliferation, migration and invasion of bladder cancer cells were observed with MTT, scratch test and Transwells assays. Results The mRNA and protein levels of CD24 expression in the siRNA group were significantly decreased compared with the control group. The proliferation of CD24 siRNA cells decreased notably compared with the control group, and the migration ability was reduced. The number of invasive T24 cells in the siRNA group decreased compared with the control group. Conclusions Downregulation of CD24 by siRNA inhibits bladder cancer cell proliferation, induces apoptosis and weakens its invasive ability in vitro.

bladder cancer; cell proliferation; invasion; RNA interference

2014-12-24

2015-04-06

常州市武進(jìn)區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目(No.WS201316)

施云峰(1983-)，男(漢族)，碩士，主治醫(yī)師.研究方向：泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤基礎(chǔ)與臨床.E-mail: fzy8353@163.com

R737.4

A

10.3969/j.issn.1009-8291.2015.08.018