王艷麗，王 京，劉國順，丁松爽＊，李建華

（1河南農(nóng)業(yè)大學煙草學院／國家煙草栽培生理生化研究基地，鄭州450002；2河南省煙草公司許昌市公司，河南許昌461000）

磷脅迫對烤煙高親和磷轉(zhuǎn)運蛋白基因表達及磷素吸收利用的影響

王艷麗1，王 京1，劉國順1，丁松爽1＊，李建華2

（1河南農(nóng)業(yè)大學煙草學院／國家煙草栽培生理生化研究基地，鄭州450002；2河南省煙草公司許昌市公司，河南許昌461000）

為探明缺磷脅迫對烤煙磷吸收的影響機理，以烤煙品種‘豫煙10號’為材料，采用盆栽試驗設置不施磷（-P）和正常供磷（＋P）2個處理，分析了煙草生育后期根系和葉片中高親和磷轉(zhuǎn)運蛋白基因NtPht1；1、NtPht1；2（簡稱PT1、PT2）的表達差異性及其表達量與煙草磷含量、磷積累量的關系。結(jié)果表明：（1）隨生育期的推進，烤煙根系和葉片的PT1基因相對表達量、PT2基因相對表達量、干物質(zhì)重和磷素積累量逐漸增加，煙葉的磷含量逐漸降低，根系磷含量無明顯的變化規(guī)律。（2）磷脅迫促使PT1、PT2基因的表達量上調(diào)，其中葉片PT1基因的相對表達量高于根系，葉片PT2基因的相對表達量顯著低于根系。（3）磷脅迫限制了烤煙對干物質(zhì)和磷素的積累，在移栽后90d，-P處理烤煙根系和葉片的干物質(zhì)重、磷素積累量不到＋P處理的一半，處理間差異極顯著。研究認為，在缺磷環(huán)境下，煙草高親和磷轉(zhuǎn)運蛋白基因PT1和PT2表達量的增加，是由磷脅迫下煙草體內(nèi)磷積累量降低所引起的系統(tǒng)性調(diào)控。

烤煙；磷脅迫；高親和磷轉(zhuǎn)運蛋白基因；磷素吸收利用

磷是重要的生命元素，是烤煙體內(nèi)許多有機化合物的組成成分，與烤煙的新陳代謝和生長發(fā)育狀況密切相關?？緹熚盏牧滓訦2PO4-和HPO42-為主，肥料磷施入土壤后極易被固定，形成難以利用的礦物態(tài)，導致土壤總磷含量高、磷肥利用率普遍偏低。一般認為植物從土壤中吸收磷素是逆濃度梯度的主動耗能吸收過程，屬于H2PO4-／H＋共運機理（Pht1家族）［12］，因此，土壤磷濃度的改變必然影響到烤煙對磷的吸收。郭燕等［3］認為烤煙磷含量與土壤速效磷含量呈極顯著的正相關關系，即在一定范圍內(nèi)烤煙磷含量隨土壤速效磷含量的升高而升高。

低磷脅迫下，植物根系形態(tài)發(fā)生一系列變化［4-5］的同時，也會通過增加根系分泌物、降低代謝消耗、增強缺磷誘導基因的表達等生理變化來吸收更多的磷營養(yǎng)［6-7］。其中，與磷酸鹽吸收轉(zhuǎn)運直接相關的基因就是煙草高親和磷轉(zhuǎn)運蛋白基因。目前已克隆出的煙草高親和磷轉(zhuǎn)運蛋白基因有5個，其中Nt-Pht1；1和NtPht1；2（簡稱PT1和PT2）基因受磷脅迫誘導表達上調(diào)，NtPht1；3、NtPht1；4和Nt-Pht1；5與菌根誘導有關［8］。關于植物Pht1家族磷轉(zhuǎn)運蛋白基因的已有研究主要集中在基因的結(jié)構(gòu)、功能以及表達調(diào)控方面［2，9］，在擬南芥、水稻等模式作物上研究較多，認為Pht1家族的磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白主要存在于細胞質(zhì)膜上［10］，負責低磷環(huán)境下植物根系從土壤中吸收磷素營養(yǎng)，并調(diào)節(jié)植物體內(nèi)磷素向維管組織的轉(zhuǎn)運過程［11-12］，基因的表達則受轉(zhuǎn)錄因子［13］、其他礦質(zhì)營養(yǎng)水平、植物激素等因素共同調(diào)控［10］。盡管已知低磷調(diào)控高親和磷轉(zhuǎn)運蛋白基因的表達，但這種低磷信號來自于土壤還是植物體內(nèi)磷濃度的變化，或是二者共同起作用尚不清楚。Liu等［14］通過番茄的分根試驗發(fā)現(xiàn)，分根植株LePt1和LePt2基因的表達量介于所有根系磷脅迫和所有根系正常供磷的植株之間，認為植物對缺磷的響應可能是受植物整體磷狀態(tài)影響的。關于高親和磷轉(zhuǎn)運蛋白基因表達水平與植物體內(nèi)磷含量關系方面的研究，賈宏昉等［15］將水稻高親和磷轉(zhuǎn)運蛋白基因OsPT8轉(zhuǎn)入煙草中，發(fā)現(xiàn)在低磷和正常供磷條件下，轉(zhuǎn)基因煙草全磷含量和有效磷含量均顯著高于野生型，認為煙草磷含量的提高是OsPT8基因與煙草PT1、PT2基因共同復雜作用的結(jié)果。目前關于磷脅迫對烤煙不同器官PT1、PT2基因表達的影響及其與磷素吸收利用的關系尚未見報道。本研究探討了烤煙大田生育后期缺磷脅迫對其根系和葉片PT1、PT2基因表達及磷吸收的影響，以期從分子水平上闡明磷素對烤煙生長的生理效應，為進一步研究烤煙高親和磷轉(zhuǎn)運蛋白基因的作用機理、提高磷肥利用率提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗設計

2014年在河南農(nóng)業(yè)大學煙草科教園進行盆栽試驗。供試烤煙品種為‘豫煙10號’，依據(jù)移栽后30d時該烤煙品種的整株生物量、整株磷積累量和根系表面積調(diào)查結(jié)果與相似處理條件下磷高效、對磷敏感的代表性烤煙品種（‘云煙85’、‘云煙2號’、‘K326’）同生育期的相關指標［16］對比認為，‘豫煙10號’屬于磷高效對磷敏感的烤煙品種。土壤類型為褐土，基礎肥力如下：有機質(zhì)含量2.05%、堿解氮含量47.76mg·kg-1、速效磷（P）含量9.77mg· kg-1、速效鉀（K）含量133.33mg·kg-1、pH 7.71。試驗設不施磷（-P）和施磷（＋P）2個處理，其P2O5用量分別為每株0和7g（施磷處理的磷用量為豫中地區(qū)推薦的磷用量），N和K2O用量相同，分別為每株3.5和10.5g，采用分析純硝酸銨、磷酸二氫鉀和硫酸鉀作氮、磷、鉀肥源。以單株煙為單位，計算其肥料用量并提前分裝，分裝好的肥料直接與土壤充分混勻后裝盆。

試驗用盆缽高31.5cm，內(nèi)口徑42.0cm，底徑28.5cm。取當?shù)剞r(nóng)田0～20cm耕作土，風干熏蒸消毒并過0.5cm×1.0cm網(wǎng)篩，與肥料混合均勻后裝盆，每盆裝土30kg。每個處理25盆，按120cm× 55cm的行株距盆栽，將盆身埋于土中，起到保水、降溫的作用。煙株生長過程中經(jīng)常轉(zhuǎn)動盆體，避免根系扎入土中。5月4日移栽，7月6日左右打頂（因生長狀況不同，不施磷處理煙株打頂時間稍晚于施磷處理）。采用滴灌裝置澆水，根據(jù)天氣情況和煙草不同生育期需水規(guī)律不同，適當延長或縮短灌水時間間隔。每次澆水時，于當天15：00打開滴灌裝置，通過調(diào)節(jié)噴頭旋鈕來控制流速，以不成股流下為宜，21：00左右關閉裝置，確保盆中土壤全部浸濕。其他栽培管理措施及病蟲害防治均按照當?shù)貎?yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)管理要求進行。

1.2 取樣方法及測定指標

1.2.1 取樣方法 在移栽后60、75和90d，各處理分別選取長勢均勻一致的3株煙，在中部功能葉（自下而上第12片葉）6～10支脈之間快速剪取鮮煙葉適量，用錫箔紙和紗布包裹后迅速放到液氮中，帶入實驗室后置于-70℃冰箱保存。將每盆煙的地上部分砍去，用流水小心沖走盆里的土，直至煙根完全沖洗干凈。剪取少量的鮮根，保存方法同上。所得的新鮮煙葉和根系樣品用來測定高親和磷轉(zhuǎn)運蛋白基因的表達量。最后，將煙株分不同器官殺青（105℃，15min），65℃烘至恒重，并記錄根系和葉片的干物質(zhì)重；粉碎過60目篩，保存，用來測定根系和葉片的磷含量。

1.2.2 PT1和PT2基因的表達檢測 采用試劑盒法提取煙葉和根系中的RNA（試劑盒購于北京艾德萊生物科技有限公司），具體提取方法參看說明書，通過隨機引物法反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用SYBR GreenⅠ嵌合熒光法進行實時熒光定量PCR（qRTPCR試劑盒購于南京諾維贊生物科技有限公司），以檢測烤煙不同器官PT1和PT2基因的表達水平。將反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA稀釋10倍后作為qRTPCR擴增模板。利用引物設計軟件Primer Premier 5設計qRT-PCR檢測所用的引物，內(nèi)參基因L25和目的基因的引物序列如表1所示。

cDNA擴增反應在96孔PCR板中進行，反應體系為10μL，包含cDNA模板1μL，正反向引物（濃度為10μmol·L-1）各0.25μL，SYBR Green Master Mix 5μL，無菌水3.5μL。擴增反應程序為：95℃預變性10min，然后95℃變性10s，60℃退火30s進行40次循環(huán)反應。PCR擴增結(jié)束后進行融解曲線分析，以檢驗擴增的特異性。融解曲線程序為：95℃預變性15s；60℃變性15s；95℃退火15s。

表1 目的基因qRT－PCR引物序列Table 1 Primer sequences of target genes for quantitative real-time PCR

設定移栽后60d時不施磷處理（-P）葉片PT1和PT2基因表達量為1（對照），采用內(nèi)均一化法計算其他時期目的基因的相對表達量，計算公式為：目的基因相對表達量＝2-△△Ct，其中Ct代表每個PCR反應管內(nèi)熒光信號到達設定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，△Ct＝Ct目的基因-CtL25，△△Ct＝△Ct（樣品）-

1.2.3 磷含量的測定 采用干灰化法處理煙葉和根系樣品，使用ICP（電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀，美國）測定磷含量。樣品前處理的方法如下：準確稱取0.4g（精確至0.000 1g）樣品至坩堝中，加入3～4滴95%乙醇，將坩堝放于馬福爐中，升溫至100℃穩(wěn)定0.5h，再升溫至250℃穩(wěn)定1h；最后升溫至500℃穩(wěn)定3h。冷卻后取出，用5%硝酸（優(yōu)級純）洗滌過濾至50mL容量瓶中，定容，待進樣。

1.3 數(shù)據(jù)處理

分別采用Excel 2003、SPSS 18.0繪制圖表和對數(shù)據(jù)進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 磷脅迫對烤煙不同器官高親和磷轉(zhuǎn)運蛋白基因表達的影響

2.1.1 PT1基因 由圖1，A可知，隨煙草生育期的推進，兩處理葉片和根系PT1基因的相對表達量整體呈上升趨勢，僅＋P處理葉片PT1基因表達量在移栽后75d時略有下降。不同器官間相比，葉片PT1基因的表達量高于根系，尤其是缺磷環(huán)境下，在移栽后60d時葉片PT1基因的表達量約是根系的7倍。磷脅迫促使根系和葉片中PT1基因的表達量上調(diào)，各生育時期-P處理葉片PT1基因相對表達量為1.00～1.50，＋P處理葉片PT1基因相對表達量為0.42～0.93；除移栽后60d時根系PT1基因相對表達量在兩處理間差異不顯著外，其他時期-P處理根系和葉片PT1基因的相對表達量均極顯著地高于相應＋P處理（P＜0.01）。

2.1.2 PT2基因 qRT-PCR結(jié)果顯示（圖1，B），烤煙根系和葉片PT2基因的相對表達量均隨生育期的推進逐漸增加，但葉片的增加趨勢不明顯。與PT1基因在器官中的相對表達水平不同，各生育時期PT2基因在葉片中的相對表達量為1.00～4.54，根系中高達4.90～61.86，即葉片遠低于根系中PT2基因的表達水平。磷脅迫誘導PT2基因強烈表達，尤其在移栽后75d，-P處理根系PT2基因相對表達量約是＋P處理的4倍。方差分析結(jié)果表明，-P處理根系和葉片中PT2基因的相對表達量大多極顯著高于相應＋P處理（P＜0.01），僅在移栽后90d時葉片PT2基因的相對表達量在處理間差異不顯著（P＞0.05）。

2.2 磷脅迫對烤煙不同器官磷素吸收利用的影響

2.2.1 器官磷含量 圖2，A顯示，隨生育期的推進，烤煙葉片磷含量逐漸下降，且-P處理下降幅度較大；根系磷含量隨生育期的推進無明顯的變化規(guī)律。磷含量在不同器官間表現(xiàn)為葉片稍高于根系。不同處理間相比，＋P處理葉片的磷含量高于-P處理，但差異均不顯著；根系磷含量在移栽后60和90d時＋P處理低于-P處理，且差異不顯著，而在移栽后75d時，＋P處理烤煙根系磷含量為1.35 mg·g-1，并極顯著高于-P處理（P＜0.01）。從圖2，A還可以看出，根系磷含量的標準誤差較大，進一步分析其變異系數(shù)也較大，表明所選樣品的平均數(shù)未必能反映處理間的真實差異，這可能是根系磷含量隨生育期無明顯變化規(guī)律的原因，還有待進一步驗證。

圖1 不同磷水平下烤煙根系和葉片PT1、PT2基因的相對表達量相同生育期同一器官-P和＋P處理兩兩比較；＊和＊＊分別表示處理間差異達5%和1%顯著水平；下同F(xiàn)ig.1 The expression of PT1and PT2gene in roots and leaves of flue-cured tobacco under different phosphorus levels The values of no phosphate fertilizer application（-P）was compared with that of recommended amount of phosphate fertilizer application（＋P）for the same organ and same growth stage，＊and＊＊denoted significant difference between two treatments at 5%and 1%probability levels，respectively；The same as below

圖2 不同磷水平下烤煙根系和葉片的磷含量、磷積累量的變化Fig.2 The content and accumulation of phosphorus in roots and leaves of flue-cured tobacco under different phosphorus levels

2.2.2 器官磷積累量 由圖2，B可知，烤煙不同器官的磷積累量隨生育期的推進逐漸增加，移栽后75d時增加較快，移栽后90d時磷積累量的增長幅度較小。各生育時期＋P處理葉片和根系磷積累量分別為每株123～445和26～95mg，-P處理葉片和根系磷積累量分別為每株60～159和14～42 mg，葉片中磷素的積累量明顯高于根系，＋P處理磷素的積累量又明顯高于-P處理。進一步方差分析結(jié)果表明，在任何生育時期，烤煙葉片和根系磷積累量在處理間的差異均達極顯著水平（P＜0.01）。

2.3 磷脅迫對烤煙不同器官干物質(zhì)積累的影響

由圖3可知，烤煙干物質(zhì)重隨生育期的推進逐漸增加，至移栽后90d，＋P處理烤煙根系和葉片干物質(zhì)重分別為每株88和242g，-P處理烤煙根系和葉片干物質(zhì)重僅為＋P處理根系和葉片干物質(zhì)重的38%和43%，缺磷嚴重限制了烤煙根系和葉片的干物質(zhì)積累。方差分析結(jié)果表明，在任何生育時期，-P處理烤煙根系和葉片的干物質(zhì)重均極顯著地低于＋P處理（P＜0.01），這種差異在生育后期更明顯。

圖3 不同磷水平下烤煙根系和葉片的干物質(zhì)重Fig.3 The dry weight of roots and leaves of fluecured tobacco under different phosphorus levels

3 討 論

關于煙草、辣椒和茄子等茄科作物在不同供磷水平下磷轉(zhuǎn)運蛋白基因的表達情況，有研究認為磷脅迫促使茄科作物根系和葉片PT1基因的表達量顯著增加，葉片中的相對表達量高于根系；PT2基因在植物根系中表達量極高，葉片中幾乎不表達［17］。本研究中PT1和PT2基因的相對表達量在不同器官間的表現(xiàn)與上述研究結(jié)果一致。關于植物對營養(yǎng)元素的反應機制，一般認為有兩種方式：一種是依賴于植物整體的營養(yǎng)狀況引起的系統(tǒng)性調(diào)控，另一種則是根部對外界營養(yǎng)元素濃度變化發(fā)生的局部反應［18］。Chen等［17］對磷饑餓處理的植物恢復磷供應，一段時間后發(fā)現(xiàn)PT1基因僅在根系中有少量的表達，葉片中檢測不到，而植物體內(nèi)的磷含量顯著增加，推測PT1基因的表達受植物組織內(nèi)磷含量的調(diào)控，即上述的第一種調(diào)控方式。本研究結(jié)果中，＋P處理煙草根系和葉片中的磷素積累量顯著高于-P處理，而PT1、PT2基因的相對表達量低于-P處理，推測本試驗條件下PT1、PT2基因表達的調(diào)控信號來自于煙株本身磷營養(yǎng)狀況的變化，尤其是葉片磷濃度的高低。

一般情況下，煙葉的磷含量（指濃度，而非積累量）隨生育期的推進逐漸下降，至煙葉成熟時磷向種子和果實運輸，煙葉磷含量進一步降低［1］，調(diào)制后煙葉的磷含量與煙草生長過程中煙葉磷含量的動態(tài)變化密切相關。國際優(yōu)質(zhì)煙葉磷含量為0.20%～0.28%，中國煙葉磷含量落在優(yōu)質(zhì)煙葉磷含量范圍內(nèi)的理論概率僅有59.8%［19］，如何提高煙草生長過程中對磷素的吸收利用效率進而提高烤煙磷含量，改善煙草的吸味品質(zhì)［20］是一個值得探討的問題。研究烤煙磷轉(zhuǎn)運蛋白基因的功能及調(diào)控機制，利用分子生物技術結(jié)合常規(guī)育種手段選育對土壤非有效態(tài)磷利用能力強的烤煙新品種，是節(jié)約磷礦資源、改善低磷脅迫下烤煙磷素營養(yǎng)狀況的有效途徑［21］。本研究結(jié)果中，以移栽后90d為例，與正常供磷（＋P）相比，磷脅迫（-P）使烤煙葉片和根系PT1基因相對表達量分別上調(diào)62%和130%，葉片和根系PT2基因相對表達量分別上調(diào)38%和162%；同一生育時期-P處理葉片和根系的磷積累量、干物質(zhì)重不到相應＋P處理葉片和根系磷積累量、干物質(zhì)重的一半；葉片和根系的磷含量在處理間差異不顯著。說明在缺磷脅迫下，相對于高親和磷轉(zhuǎn)運蛋白基因的表達量上調(diào)來說，有限的外源磷供給對烤煙磷素吸收利用的影響更大；＋P處理煙株的干物質(zhì)重顯著大于-P處理，表明缺磷脅迫對烤煙磷素吸收利用的影響是通過限制烤煙干物質(zhì)積累來實現(xiàn)的。

煙草的吸磷能力是由土壤有效磷水平和自身的遺傳因素共同決定的，不同烤煙品種的磷效率可能存在一定的差異，煙草高親和磷轉(zhuǎn)運蛋白基因在品種間的表達差異性還需要進一步研究，以篩選磷高效吸收基因和磷高效利用基因，從遺傳育種角度尋找提高煙草磷效率的新途徑。

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（編輯：裴阿衛(wèi)）

Expression of High-affinity Phosphate Transporter Genes，Phosphorus Absorption and Utilization in Flue-cured Tobacco under Deficient Phosphorus Stress

WANG Yanli1，WANG Jing1，LIU Guoshun1，DING Songshuang1＊，LI Jianhua2
（1College of Tobacco Science，Henan Agricultural University／National Tobacco Cultivation ＆Physiology ＆Biochemistry Research Center，Zhengzhou 450002，China；2Xuchang Branch of Henan Tobacco Company，Xuchang，He’nan 461000，China）

In order to clarify the mechanism of deficient phosphorus stress on phosphorus absorption of fluecured tobacco，taking‘Yuyan No.10’as the material，we designed a pot experiment with two treatments，which were no phosphate fertilizer application and recommended amount of phosphate fertilizer.The expression differences of high-affinity phosphate transporter genes NtPht1；1（PT1）and NtPht1；2（PT2）between two treatments and the correlation of genes expression and phosphorus accumulation in leaves and roots at later growth stages were analyzed.The results showed that：（1）with the advancement of the growth stages，the relative expression of PT1and PT2genes，the dry matter weight and the phosphorus accumulation in leaves and roots of flue-cured tobacco increased gradually and the content of phosphorus in leaves decreased.Whereas，there was no significant pattern in roots.（2）The relative expression of PT1and PT2genes were up-regulated under deficient phosphorus stress.The relative expression of PT1gene inleaves was higher than that in roots，while PT2gene was the opposite，comparatively.（3）The accumulation of dry matter and phosphorus in flue-cured tobacco were limited under deficient phosphorus stress.At 90 days after transplanting，the dry matter weight and phosphorus accumulation in tobacco roots and leaves with no phosphate fertilizer application were less than half the values of the phosphorus application treatment.There were extremely significant differences among treatments at 0.01probability levels.This might imply that the up-regulated expression of PT1and PT2genes under deficient phosphorus stress was due to the decrease of phosphorus accumulation in tobacco tissues rather than the low available phosphorus soil.

flue-cured tobacco；deficient phosphorus stress；high-affinity phosphate transporter gene；phosphorus absorption and utilization

Q945.79；Q789

A

1000-4025（2015）07-1403-06

10.7606／j.issn.1000-4025.2015.07.1403

2015-04-02；修改稿收到日期：2015-05-08

中國煙草總公司特色優(yōu)質(zhì)煙葉開發(fā)重大專項濃香型項目（Ts-01-2011005）

王艷麗（1989-），女，在讀碩士研究生，主要從事煙草栽培生理生化研究。E-mail：yanliw000＠163.com

＊通信作者：丁松爽，博士，講師，主要從事煙草生態(tài)學研究和教學工作。E-mail：shuangsd＠126.com