武生梅，史淑紅，李艷芳，李榮霞，李潔

(1赤城縣人民醫(yī)院，河北張家口075500；2河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院；3河北中醫(yī)學(xué)院)

異位子宮內(nèi)膜組織間質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液中VEGF、sflt-1表達(dá)及意義

武生梅1，史淑紅2，李艷芳2，李榮霞2，李潔3

(1赤城縣人民醫(yī)院，河北張家口075500；2河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院；3河北中醫(yī)學(xué)院)

目的 探討VEGF及其受體在子宮內(nèi)膜異位癥(EMs)發(fā)生中的作用。方法 采用細(xì)胞原代培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)48例子宮內(nèi)膜異位癥患者(異位癥組)在位、異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞及30例無子宮內(nèi)膜異位癥患者(對(duì)照組)子宮內(nèi)膜細(xì)胞，檢測其細(xì)胞培養(yǎng)液中VEGF及其可溶性受體sflt-1表達(dá)；計(jì)算VEGF活性指數(shù)(VEGF/ sflt-1)。結(jié)果 異位癥組在位、異位細(xì)胞培養(yǎng)液VEGF、sflt-1水平及VEGF活性指數(shù)均高于對(duì)照組(P均<0.05)，在位及異位細(xì)胞培養(yǎng)液中VEGF、sflt-1水平及VEGF活性指數(shù)相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 EMs患者子宮內(nèi)膜組織sflt-1表達(dá)相對(duì)不足；此可能為EMs發(fā)生的原因之一。

子宮內(nèi)膜異位癥；子宮內(nèi)膜細(xì)胞原代培養(yǎng)；血管內(nèi)皮生長因子；血管內(nèi)皮生長因子可溶性受體

子宮內(nèi)膜異位癥(EMs)是婦科最常見的疾病之一，其為良性疾病，但有惡性腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移等行為，且發(fā)病機(jī)制復(fù)雜[1]。研究證實(shí)，EMs的發(fā)生發(fā)展離不開新生血管的形成，而VEGF為有強(qiáng)力的促血管生成因子。sflt-1(sVEGFR-1)為VEGF的受體之一，與VEGF有高度的親和力，其不具有酪氨酸激酶活性，為天然的VEGF抑制劑[2]。為探討其在EMs發(fā)生中的作用，我們于2013年5月～2014年2月進(jìn)行了如下研究。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2011年6月～2012年6月在河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院因EMs行腹腔鏡手術(shù)治療的48例患者，年齡20～48歲，術(shù)后病理證實(shí)為EMs，根據(jù)美國生育協(xié)會(huì)(R-AFs)分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ～Ⅱ期15例，Ⅲ～Ⅳ期33例。取得異位病灶48份，在位內(nèi)膜32份，分別為異位組和在位組。選擇同期因卵巢良性腫瘤、宮頸病變、漿膜下肌瘤、輸卵管疾病等非內(nèi)異癥原因接受子宮切除的患者以及接受宮腔鏡檢查的非EMs患者30例，為對(duì)照組，年齡32～48歲(子宮內(nèi)膜為增生期18例、分泌期12例)，術(shù)后病理證實(shí)為正常的子宮內(nèi)膜。兩組均月經(jīng)規(guī)律(28～32 d)，未合并其他外科疾病，術(shù)前6個(gè)月未接受過激素類藥物治療，6個(gè)月內(nèi)無妊娠及哺乳史。各組受試者年齡、BMI、孕次、產(chǎn)次、月經(jīng)周期、經(jīng)期天數(shù)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 細(xì)胞原代培養(yǎng) 術(shù)中取得在位及異位子宮內(nèi)膜組織標(biāo)本后，迅速用無菌冰生理鹽水沖洗3遍，置入含有冰DMEM液無菌瓶中，30 min內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室。依照文獻(xiàn)[3～5]方法行間質(zhì)細(xì)胞分離培養(yǎng)：將內(nèi)膜組織剪碎，組織大小1 mm3，無菌生理鹽水沖洗2次，置入燒杯，加入胰蛋白酶液。于5%CO2、37 ℃、飽和濕度培養(yǎng)箱中消化。2～3 h后加入含15%的小牛血清培養(yǎng)液終止消化。將細(xì)胞懸液吹打均勻，加入緩沖液PBS 5 mL，550 r/min離心4 min，取上清，800 r/min離心4 min，去上清，PBS吹打清洗2～3次，800 r/min，離心4 min，去上清，加入細(xì)胞培養(yǎng)液，吹打?yàn)榫鶆虻募?xì)胞懸液，置細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，于5%CO2、37 ℃、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h以后更換細(xì)胞培養(yǎng)液，倒置顯微鏡每天觀察細(xì)胞生長情況，隔日更換細(xì)胞培養(yǎng)液1次。在位組、異位組各有26、20例細(xì)胞原代培養(yǎng)成功。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)液中VEGF與sflt-1水平檢測 各組換液過程中收集細(xì)胞培養(yǎng)液及2次沖洗液，800 r/min離心4 min，取上清，記錄總體積，分別取3 mL，采用ELISA法測定游離VEGF和sflt-1水平，最終反應(yīng)板在Bio-Rad 2250酶標(biāo)檢測儀于450 nm處讀取光密度值，所測值按照標(biāo)準(zhǔn)曲線換算成VEGF及sflt-1水平。依據(jù)各組細(xì)胞液的體積及血細(xì)胞數(shù)(血細(xì)胞計(jì)數(shù)器測得)計(jì)算每105個(gè)細(xì)胞表達(dá)VEGF及sflt-1水平。VEGF/ sflt-1為VEGF活性指數(shù)。

2 結(jié)果

異位組在位、異位內(nèi)膜細(xì)胞培養(yǎng)液中VEGF、sflt-1水平及VEGF活性指數(shù)均高于對(duì)照組(P均<0.05)，在位、異位內(nèi)膜細(xì)胞培養(yǎng)液VEGF、sflt-1水平及VEGF活性指數(shù)相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

表1 各組細(xì)胞培養(yǎng)液中VEGF、sflt-1表達(dá)比較

注：與對(duì)照組相比，*P<0.01。

3 討論

EMs是一種婦科常見病，可以導(dǎo)致不孕、性交痛，是多年來婦科領(lǐng)域中的研究熱點(diǎn)。子宮內(nèi)膜細(xì)胞原代體外培養(yǎng)是目前研究EMs的常用方法，細(xì)胞離開機(jī)體時(shí)間較短，可以更好的反映疾病的特點(diǎn)，且無倫理問題。子宮內(nèi)膜細(xì)胞分為腺細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞，其中腺細(xì)胞的體外培養(yǎng)較困難，幾乎不能完成傳代，故傳代后的子宮內(nèi)膜細(xì)胞大多為子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞。

有報(bào)道，EMs患者的在位子宮內(nèi)膜血管形成活性明顯增強(qiáng)，存在血管異常增生現(xiàn)象[6]；EMs是一種血管依賴性疾病，VEGF在血管發(fā)生和形成中起著中樞性的調(diào)節(jié)作用，是最關(guān)鍵的血管形成刺激因子[7～9]。子宮內(nèi)膜的血管形成受到促血管生成因子和抗血管生成因子共同調(diào)控，其平衡被打破會(huì)導(dǎo)致疾病的發(fā)生，例如月經(jīng)過多和EMs[10]。本課題組前期研究證實(shí)VEGF及sflt-1在在位子宮內(nèi)膜及異位子宮內(nèi)膜中表達(dá)與對(duì)照組相比存在顯著差異。本研究結(jié)果顯示，EMs患者在位內(nèi)膜及異位內(nèi)膜細(xì)胞培養(yǎng)液中VEGF及sflt-1的表達(dá)及VEGF活性指數(shù)均較對(duì)照組升高。表明EMs患者在位及異位子宮內(nèi)膜組織sflt-1表達(dá)相對(duì)不足，使血管生成調(diào)節(jié)平衡中抑制血管生成的作用降低，促血管生成作用相對(duì)占優(yōu)勢，促進(jìn)了EMs疾病發(fā)生發(fā)展中的血管生成，為異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞黏附后的種植、病灶形成提供了條件。

sflt-1為VEGF的天然抗體之一，其抗血管生成作用已被臨床證實(shí)，且在腫瘤[11]、子癇前期[12～16]、習(xí)慣性流產(chǎn)[17]等疾病診治的相關(guān)研究中取得一定進(jìn)展。EMs為一種血管依賴性疾病，抗血管形成為其治療思路。本研究結(jié)果及我們的前期研究均證實(shí)，sflt-1在EMs患者血液、腹腔液、組織、細(xì)胞培養(yǎng)液中表達(dá)均相對(duì)不足，因此用sflt-1作為抗血管形成治療靶點(diǎn)治療EMs應(yīng)該是有臨床價(jià)值的。但確切效果尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。

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河北省科技計(jì)劃項(xiàng)目(12277740)。

史淑紅

10.3969/j.issn.1002-266X.2015.06.014

R711.5

B

1002-266X(2015)06-0040-02

2014-11-16)