高彥琳, 張寧坤, 陳厚良, 高連如, 朱智明

(中國(guó)人民解放軍海軍總醫(yī)院,北京100000)

·基礎(chǔ)研究·

人臍帶來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞再次培養(yǎng)效果觀察

高彥琳, 張寧坤, 陳厚良, 高連如, 朱智明

(中國(guó)人民解放軍海軍總醫(yī)院,北京100000)

目的 探討人臍帶來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞(hUC- MSCs )體外培養(yǎng)的最佳方法。方法 采用組織塊貼壁法分離培養(yǎng)hUC- MSCs,記為初次培養(yǎng)組。將原代培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液及組織離心，重新分成再次培養(yǎng)組織組、再次培養(yǎng)混合組和再次培養(yǎng)純液組進(jìn)行再次培養(yǎng)。觀察四組原代細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)、獲得時(shí)間和細(xì)胞得率；MTT法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線， 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期及免疫表型。結(jié)果 初次培養(yǎng)組、再次培養(yǎng)組織組、再次培養(yǎng)混合組、再次培養(yǎng)純液組獲取細(xì)胞的平均時(shí)間分別為(15±0.45)d、(7±0.30)d、(8±0.25)d、(8±0.25)d。每個(gè)T75培養(yǎng)瓶可獲取的第1代細(xì)胞數(shù)分別為(4.0±0.50)×105、(9.0±0.55)×105、(15.0±0.20)×105、(7.0±0.33)×105個(gè)。倒置顯微鏡下觀察四組細(xì)胞為形態(tài)相對(duì)均一的梭形貼壁細(xì)胞，呈平行排列生長(zhǎng)或旋渦狀生長(zhǎng)。四組細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線、增殖活性、表面標(biāo)記物檢測(cè)均無(wú)明顯差異。結(jié)論 對(duì)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的原代培養(yǎng)體系進(jìn)行再次培養(yǎng)，可在短時(shí)間內(nèi)擴(kuò)增出大量原代細(xì)胞。

間充質(zhì)干細(xì)胞；臍帶；細(xì)胞培養(yǎng)

間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)是進(jìn)行細(xì)胞療法的主要種子細(xì)胞[1], 具有較強(qiáng)的自我更新能力和多向分化潛能，在細(xì)胞治療領(lǐng)域有著極為廣闊的應(yīng)用前景[2，3]。目前已從骨髓、 脂肪、 羊膜、 胎盤、 臍血以及臍帶等組織中分離出MSCs，其有向內(nèi)皮細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成肌細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞分化的能力[4～6]。 臍帶的來(lái)源廣泛，取材方便，易于收集、保存、冷凍，屬于醫(yī)療廢棄物，不受倫理、道德及法律方面的限制，且臍帶組織中MSCs含量豐富，是再生醫(yī)學(xué)理想的種子細(xì)胞[7]。目前分離培養(yǎng)臍帶血來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞(hUC-MSCs )的方法很多，但是都不能快速有效地獲取原代細(xì)胞。2014年1～5月，我們觀察并比較了對(duì)hUC-MSCs原代培養(yǎng)體系進(jìn)行再次培養(yǎng)所獲得hUC-MSCs的形態(tài)，獲得hUC-MSCs 時(shí)間及數(shù)目，獲得hUC-MSCs 細(xì)胞表型、增殖能力、周期分布，探討最佳的hUC- MSCs 培養(yǎng)方法?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臍帶來(lái)源 經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)， 在征得產(chǎn)婦和家屬書面知情同意的情況下， 在海軍總醫(yī)院婦產(chǎn)科產(chǎn)房取當(dāng)日剖宮產(chǎn)健康足月生產(chǎn)的新生兒臍帶 (乙型肝炎病毒、 丙肝病毒、 人類免疫缺陷病毒、 TP-SX、巨細(xì)胞病毒梅毒、艾滋病等傳染性疾病檢測(cè)陰性)。

1.1.2 主要試劑及器材 DMEM/F12培養(yǎng)液、胎牛血清(FBS)、0.25%trypsin-EDTA胰蛋白酶均為美國(guó) Gibco 公司生產(chǎn)；MTT為Sigma公司生產(chǎn)；流式單抗CD45-FITC、CD44-FITC、CD90-PE、 CD105-PE、HLA-ABC-PE、HLA-DR-FITC、CD31-PE 均為美國(guó)Biolegend 公司生產(chǎn)；倒置相差顯微鏡下為日本Nikon公司生產(chǎn)；流式細(xì)胞儀為美國(guó) BD 公司生產(chǎn)；紫外分光光度儀、 二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo)。

1.2 hUC-MSCs分離及培養(yǎng)

1.2.1 hUC-MSCs的原代培養(yǎng) 將無(wú)菌條件下獲取的臍帶放入無(wú)菌生理鹽水中，1 h內(nèi)送至細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室。參照Li等[8]報(bào)道的hUC-MSLs分離、培養(yǎng)方法。用生理鹽水反復(fù)沖洗，洗去臍帶殘留血液，將臍帶剪成3～4 cm的小段，每段均沿臍靜脈腔剪開，平鋪后剔除靜脈，再剔除2根動(dòng)脈，取出血管之間、血管與外膜之間的膠狀物——華通膠，用小剪刀將取出的華通膠反復(fù)剪切成大約1 mm3及以下小塊，接種于T75培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，每個(gè)培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入10 mL含有10%FBS 的 DMEM/F12 培養(yǎng)液，使臍帶華通膠均勻分布瓶底，置于5%CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。在顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)增殖情況并拍照。待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%融合狀態(tài)時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化傳代細(xì)胞，為初次培養(yǎng)組。

1.2.2 hUC-MSCs再次培養(yǎng) 將原代培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液及組織移入離心管中，1 500轉(zhuǎn)/min離心5 min。將此體系分成三組，并分別接種于T75培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。再次培養(yǎng)組織組：?jiǎn)渭兘M織塊組(無(wú)原培養(yǎng)基)加入10 mL含有10%FBS 的 DMEM/F12 培養(yǎng)液；再次培養(yǎng)混合組：組織塊及原培養(yǎng)基的混合物組加入5 mL含有10%FBS 的 DMEM/F12 培養(yǎng)及5 mL原培養(yǎng)液；再次培養(yǎng)純液組：原培養(yǎng)液10 mL，分別置于5%CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。在顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)增殖情況并拍照。待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%融合狀態(tài)時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化傳代細(xì)胞。

1.3 觀察項(xiàng)目及方法

1.3.1 hUC-MSCs形態(tài)、第一代細(xì)胞獲取時(shí)間及數(shù)量 采用倒置顯微鏡觀察四組hUC-MSCs形態(tài)。統(tǒng)計(jì)各組獲取第一代hUC-MSCs的時(shí)間及每個(gè)培養(yǎng)瓶獲取hUC-MSCs的數(shù)量。

1.3.2 hUC- MSCs 表面標(biāo)記物 取各組第3代細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化，PBS洗兩次，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL單細(xì)胞懸液，每個(gè)Eppembrf 管加 100 μL的細(xì)胞懸液 , 加入鼠抗人單克隆抗體 PE- CD90PE- CD105PE- CD44PE-CD73PE- HLA- ABC FITC- CD45FITC- CD34FITC- HLA- DR各 20 μL，充分混勻，避光室溫孵育30 min， PBS 洗 2 遍(250 g 離心 5 min )，重新制成細(xì)胞懸液 0.5 mL，經(jīng)300目細(xì)胞篩過(guò)濾，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)并分析。

1.3.3 細(xì)胞增殖活性 取各組第3代細(xì)胞， 經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化計(jì)數(shù)后，分別用完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞數(shù)至2.5 × 104/mL，取200 μL細(xì)胞懸液接種在96孔板中,每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，置于37 ℃ 5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔24 h用MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞吸光度值(激發(fā)波長(zhǎng)490 nm)，連續(xù)7 d，取6孔均值繪制生長(zhǎng)曲線。

1.3.4 細(xì)胞周期分布 取各組第3代細(xì)胞，經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化收集后，分別用 PBS 離心洗滌 2 次，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至 1×106/mL，離心棄上清，加入4 ℃預(yù)冷的70%乙醇1 mL重懸，4 ℃冰箱過(guò)夜; 離心棄上清，用1 mL碘化丙啶重懸，4 ℃避光孵育 30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，分析細(xì)胞周期。

2 結(jié)果

2.1 hUC-MSCs形態(tài)、得第一代細(xì)胞獲取時(shí)間及數(shù)量 倒置顯微鏡下觀察四組原代細(xì)胞呈貼壁生長(zhǎng)，形態(tài)均為長(zhǎng)梭形或多角形1。初次培養(yǎng)組細(xì)胞以華通膠為中心呈旋渦狀或平行排列生長(zhǎng)，獲取細(xì)胞的時(shí)間為(15.00±0.45)d,每個(gè)培養(yǎng)瓶可獲取(4.00±0.5)×105個(gè)第一代細(xì)胞；再次培養(yǎng)組織組細(xì)胞以華通膠為中心呈旋渦狀生長(zhǎng)，獲取細(xì)胞的平均時(shí)間為(7.00±0.3)d,每個(gè)培養(yǎng)瓶可獲取(9.00±0.55)×105個(gè)第一代細(xì)胞；再次培養(yǎng)混合組部分細(xì)胞以華通膠為中心呈旋渦狀生長(zhǎng)，部分細(xì)胞呈散在生長(zhǎng)，得到原代細(xì)胞的時(shí)間(8.00±0.25)d,每個(gè)培養(yǎng)瓶可獲取(15.00±0.20)×105個(gè)第一代細(xì)胞；再次培養(yǎng)純液組細(xì)胞呈散在生長(zhǎng)，得到原代細(xì)胞的平均時(shí)間(8.00±0.58)d,每個(gè)T75培養(yǎng)瓶可獲取(7.00±0.33)×105個(gè)第一代細(xì)胞。傳至第3 代， 細(xì)胞增殖速度加快，形態(tài)較為均一呈長(zhǎng)梭形，折光度好。四組第一代及第3代hUC-MSCs細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯差異，初次培養(yǎng)組原代細(xì)胞獲取時(shí)間顯著長(zhǎng)于其他三組(P均<0.05)，再次培養(yǎng)的三組之間兩兩比較，P均>0.05。獲取原代細(xì)胞數(shù)再次培養(yǎng)混合組數(shù)目最多，再次培養(yǎng)組織組其次，再次培養(yǎng)純液組稍差，初次培養(yǎng)組最少，四組間兩兩比較P均<0.05。

2.2 hUC-MSCs免疫表型 四組第3代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞均高表達(dá)CD90、CD105、HLA-ABC，不表達(dá) CD31、CD34、CD45、HLA- DR。

2.3 hUC-MSCs增殖能力 四組第3代hUC- MSCs細(xì)胞生長(zhǎng)曲線見圖1。四組hUC- MSCs 生長(zhǎng)曲線形態(tài)相似，基本重疊。第1～2 d各組細(xì)胞處于潛伏期，增殖不明顯; 3～5 d各組細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期， 細(xì)胞增殖加速; 第 6 天以后進(jìn)入平臺(tái)期，細(xì)胞生長(zhǎng)停滯。

圖1 四組hUC-MSCs 生長(zhǎng)曲線

2.4 hUC-MSCs細(xì)胞周期分布 各組細(xì)胞周期分布無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3 討論

最近幾年里，對(duì)成體干細(xì)胞療法的研究在不斷增加。MSCs是一個(gè)相當(dāng)具有吸引力的種子細(xì)胞，可以用于治療各種疾病，包括神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病、自身免疫性疾病、內(nèi)分泌疾病等[9]。hUC- MSCs 是介于胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞之間的原始干細(xì)胞，分化能力強(qiáng)，倍增時(shí)間短，具有免疫調(diào)節(jié)作用和較低的免疫原性，且無(wú)致腫瘤性[10，11]。1976年Friedenstein等[12]首先從臍帶組織中分離培養(yǎng)出間充質(zhì)干細(xì)胞，之后Schugar等[13]采用組織塊法和酶消化法兩種方法分別培養(yǎng)出臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，這也是目前較為常用的兩種方法。這兩種方法分離培養(yǎng)出的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)、 生長(zhǎng)曲線、 細(xì)胞表面標(biāo)記物等無(wú)明顯差異[14]。但是酶消化法成本較高；操作比較繁瑣污染概率大；消化過(guò)程時(shí)間過(guò)短，細(xì)胞很難爬出；消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)易損傷細(xì)胞；長(zhǎng)時(shí)間酶的消化對(duì)細(xì)胞損傷較大, 多次傳代后細(xì)胞易脫落死亡[15]。

本研究采用組織塊培養(yǎng)法提取臍帶中MSCs。通常來(lái)講組織塊貼壁法是將小的組織塊均勻鋪于培養(yǎng)瓶底，原代細(xì)胞從組織塊邊緣爬出。雖然組織塊貼壁法方便易行，操作簡(jiǎn)單，但存在原代細(xì)胞收獲率低、培養(yǎng)周期長(zhǎng)等問(wèn)題[16]，難以適應(yīng)組織工程對(duì)種子細(xì)胞的需要。本研究中初次培養(yǎng)組獲取原代細(xì)胞的平均時(shí)間大約2周,獲取細(xì)胞數(shù)量較少，符合組織塊貼壁法培養(yǎng)的結(jié)果。一般傳代結(jié)束后就會(huì)將培養(yǎng)原代細(xì)胞的組織和培養(yǎng)液丟棄。本研究中筆者將廢棄的組織和培養(yǎng)液離心后，分成組織組、混合組和純液組進(jìn)行再次培養(yǎng)，大約1周即可傳代，且獲取的細(xì)胞數(shù)為初次培養(yǎng)的2倍左右。相對(duì)于傳統(tǒng)組織貼壁法，這種改進(jìn)的方法可在較短時(shí)間內(nèi)獲得大量原代細(xì)胞，而且獲得細(xì)胞的免疫表型、增殖能力及周期分布正常。筆者推測(cè)其原因：①初次培養(yǎng)后組織塊內(nèi)細(xì)胞并未完全爬出；②初次培養(yǎng)過(guò)程中可能形成了某些黏附物質(zhì)和生長(zhǎng)因子，促進(jìn)組織塊貼壁和生長(zhǎng)[17]；③組織塊在經(jīng)過(guò)一輪培養(yǎng)后，纖維組織松解，細(xì)胞易于爬出；④原代培養(yǎng)的培養(yǎng)液中可能存在一些散在細(xì)胞。

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國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81170094)。

朱智明

10.3969/j.issn.1002-266X.2015.06.010

R318

A

1002-266X(2015)06-0028-03

2014-10-15)