吳 江,張國(guó)梁,劉 杰,鞏忠萍，鄭極慧,呂玉光

(1.佳木斯大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154002 ；2.青島大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 青島 266000；3.佳木斯大學(xué)化學(xué)與藥學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

Sm/Ag/TiO2無(wú)機(jī)納米復(fù)合材料表征與抗菌性能研究①

吳 江1,張國(guó)梁1,劉 杰2,鞏忠萍3，鄭極慧3,呂玉光3

(1.佳木斯大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154002 ；2.青島大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 青島 266000；3.佳木斯大學(xué)化學(xué)與藥學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

目的：初步研究無(wú)機(jī)納米材料Sm/Ag/TiO2的表征和抗菌活性。方法：通過(guò)XRD分析、TEM觀(guān)察測(cè)量檢測(cè)Sm/Ag/TiO2的粒子分布情況；通過(guò)抑菌環(huán)實(shí)驗(yàn)和液體稀釋實(shí)驗(yàn)，測(cè)定在摩爾比為2:2:100的Sm/Ag/TiO2作用于金黃色葡萄球菌和白色念珠球菌的抗菌活性。結(jié)果：(1)XRD分析結(jié)果：Sm/Ag/TiO2的平均粒徑為14.62nm；Ag離子和Sm離子以一個(gè)高度分散和非晶形式分散在二氧化鈦表面；(2)TEM圖像表明，謝勒公式計(jì)算出粒子的大小是12nm；(3)抗菌活性結(jié)果：當(dāng)摩爾比是2:2:100時(shí)，抑菌圈直徑為16mm；最小抑菌濃度為200μg/mL；最小殺菌濃度為2×104μg/mL。結(jié)論：無(wú)機(jī)納米材料Sm/Ag/TiO2具有高比表面積、分散性和抗菌性良好的特點(diǎn)。

無(wú)機(jī)納米材料；釤/銀/二氧化鈦；表征分析；抗菌活性

通常情況下，口腔微生態(tài)系統(tǒng)的平衡和失調(diào)與口腔的健康和疾病密切相關(guān)。在臨床治療各種口腔疾病時(shí)需要在口腔材料中添加一些適應(yīng)口腔環(huán)境、長(zhǎng)效、耐熱、無(wú)毒、不變色的抗菌劑，其目的是維護(hù)口腔微生態(tài)系統(tǒng)的動(dòng)力平衡，保證臨床治療遠(yuǎn)期療效[1]。目前，兼有納米特性和無(wú)機(jī)抗菌劑性能的納米無(wú)機(jī)抗菌劑廣泛應(yīng)用于各領(lǐng)域[2]，其中以銀系和鈦系抗菌劑為代表。雖然銀類(lèi)抗菌劑有抗菌廣譜、殺菌率高、不易產(chǎn)生抗藥性等特點(diǎn)，但其成本高、易變色、納米銀粒子生物安全性等問(wèn)題一直是廣大研究者熱論的問(wèn)題[3，4]。

鈦系抗菌劑受到光照條件限制、“電子—空穴對(duì)”易復(fù)合等問(wèn)題的困擾，無(wú)法在口腔環(huán)境里發(fā)揮理想抗菌效果。然而，稀土元素具有4f 電子、易產(chǎn)生多電子組態(tài)的獨(dú)特的電子層和核結(jié)構(gòu)，延長(zhǎng)光生電子-空穴對(duì)的壽命，成本低，也不存在變色問(wèn)題，毒性小于Ag+，具有優(yōu)異的抗菌功能和理化性能以及抗凝血、抗炎、抑癌防癌、抗腫瘤等生物學(xué)作用[5～8]。本研究主要目的是根據(jù)銀和稀土的特性，借助納米二氧化鈦TiO2為載體，利用超臨界流體干燥(SCFD)結(jié)合溶膠-凝膠(Sol-gel)組合技術(shù)實(shí)現(xiàn)無(wú)機(jī)納米抗菌劑Sm/Ag/TiO2的合成及抗菌活性的研究。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 實(shí)驗(yàn)用品

日本理學(xué)HR-6000型X射線(xiàn)衍射儀(Cu靶X射線(xiàn)管，管壓40kv，管流30mA，掃描范圍10～80°),日本島津公司生產(chǎn)的UV-2501PC紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì),DHG-9030型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，JA1203型電子天平，H-J4型磁力攪拌器，SX2-2.5-12型馬弗爐，800型離心機(jī)，SFT-110XW超臨界萃取儀，超凈工作臺(tái)(上海凈化設(shè)備廠(chǎng))，恒溫培養(yǎng)箱(天津市實(shí)驗(yàn)儀器廠(chǎng))，血球計(jì)數(shù)板，XW-80漩渦混合器，電子天平秤，-40℃冷藏箱。無(wú)水乙醇(AR)，鈦酸正四丁酯[Ti(OC4H9)4](AR)，鹽酸(AR)，硝酸釤[Sm(NO3)3·6H2O](AR),冰醋酸(AR)，BHI培養(yǎng)基、沙堡培養(yǎng)基(無(wú)錫市賽維商貿(mào)有限公司)。金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，ATCC29213)，白色念珠菌(Saccharomyces albicans，ATCC90028)(廣東微生物保藏中心)。

1.2 Sm/Ag/TiO2粉體的制備

在常溫條件下，選用10mL鈦酸四丁酯作為前驅(qū)體、無(wú)水乙醇為溶劑，以冰醋酸作為抑制劑，濃硝酸作為催化劑，調(diào)節(jié)溶膠pH值為2～4，可以制得均勻穩(wěn)定透明的二氧化鈦溶膠，其中Ti(OC4H9)4、C2H5OH與H2O的摩爾比為1:12:9，控制B液滴加速度為1～25滴，磁力攪拌速度為中速，制備納米二氧化鈦粉體。將摻雜銀、稀土Sm的TiO2粉末放入馬弗爐中，在不同的溫度下進(jìn)行熱處理，經(jīng)超臨界萃取得到無(wú)機(jī)納米復(fù)合材料Sm/Ag/TiO2粉體。

1.3 XRD分析

利用超臨界流體干燥(SCFD)結(jié)合溶膠-凝膠(Sol-gel)組合技術(shù)合成Ag/TiO2和Sm/Ag/TiO2粉體，進(jìn)行XRD分析如圖1、2所示。

1.4 TEM電鏡下觀(guān)察

利用投射電子顯微鏡(TEM)觀(guān)察Sm/Ag/TiO2粉體的團(tuán)聚情況。

1.5 菌懸液配制

用BHI培養(yǎng)液、沙堡培養(yǎng)液分別復(fù)蘇金黃色葡萄球菌和白色念珠菌。采用連續(xù)轉(zhuǎn)接2次后的新鮮菌液培養(yǎng)物，分別挑取單菌落混懸于BHI培養(yǎng)液和沙堡培養(yǎng)液中，37℃下需氧培養(yǎng)24h，用血球計(jì)數(shù)板分別配置濃度為1×105CFU/mL的菌液，備用。

1.6 抑菌環(huán)試驗(yàn)

以無(wú)菌棉簽蘸金黃色葡萄球菌液，在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板表面均勻涂沫3次。蓋好平皿，置室溫干燥3min。在培養(yǎng)基表面打直徑為5mm的小孔，兩個(gè)小孔間距不少于24mm，小孔距平板邊緣不少于15mm，在小孔內(nèi)分別注入不同比例的抗菌劑0.2mL后，置37℃溫箱孵育24h后，讀取結(jié)果，抑菌圈邊緣以肉眼見(jiàn)不到菌落明顯生長(zhǎng)為限。抑菌圈寬度(W)公式：W=(D-T)/2(D為抑菌圈的直徑，T為小孔的直徑)。

1.7 液體稀釋法

將抗菌劑在120℃下烘烤2h后，與生理鹽水配制成不同濃度的混懸液，備用。將已配置好濃度的白色念珠菌菌液分別于抗菌劑混懸液混合，不添加抗菌劑的溶液作為陽(yáng)性對(duì)照；不添加菌液的溶液作為陰性對(duì)照。37℃下，需氧培養(yǎng)24h。之后，再?gòu)母髟嚬軆?nèi)取0.02mL液體置于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，37℃需氧培養(yǎng)24h后，觀(guān)察結(jié)果。MIC結(jié)果：同陽(yáng)性對(duì)照組相比，平板培養(yǎng)基上試驗(yàn)菌菌落個(gè)數(shù)無(wú)增加的那組抗菌劑溶液濃度值，就是抑制該菌生長(zhǎng)的最小抑菌濃度值(MIC)。MBC結(jié)果：同陽(yáng)性對(duì)照組相比，平板培養(yǎng)基上無(wú)試驗(yàn)菌菌落生長(zhǎng)的最低抗菌劑溶液濃度值，就是抗菌劑殺滅該菌的最小殺菌濃度值(MBC)。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

圖1 在500℃、100min的條件下，TiO2、Ag/TiO2和Sm/Ag/TiO2的X射線(xiàn)衍射分析

2 結(jié)果

2.1 XRD 分析

圖1可知，TiO2粉體的晶相是銳鈦礦，在2θ=25.2，34.58，37.81，52.36處有TiO2銳鈦礦的特征峰。根據(jù)謝樂(lè)公式(Scherrer)可求得Ag/TiO2的平均粒子粒徑，D=14.01nm，Sm/Ag/TiO2的平均粒子粒徑，D=14.62nm。Sm/Ag/TiO2的譜圖中觀(guān)察不到Sm的特征峰，說(shuō)明Sm高度分散于粉體中，并且材料為納米級(jí)材料。

由圖2所示，Sm/Ag/TiO2的摩爾比例為2:2:100時(shí)，Ag和Sm離子以高分散或非晶態(tài)形式分散在TiO2的表面，強(qiáng)度更強(qiáng)，其晶型結(jié)構(gòu)更為規(guī)整，結(jié)晶度更高，峰型更清晰。

圖2 在500℃、100min條件下,不同比例的Sm/Ag/TiO2粉末的XRD分析(Sm/Ag/TiO2的添加量為：a.2:2:100;b.1:2:100;c.2:1:100;d.1:0:100)

2.2 TEM測(cè)量分析

圖3顯示，利用謝勒公式計(jì)算得出Sm/Ag/TiO2粒子大小是12納米,說(shuō)明在煅燒過(guò)程中Sm、Ag和TiO2的摻雜，減少了顆粒之間的聚集從而使得納米粒子具有高比表面積、體積小和良好分散性的特點(diǎn)。

圖3 Sm/Ag/TiO2的TEM觀(guān)察

2.3 抑菌活性分析

在摻銀含量一定的前提下，隨著釤離子摻雜量的增加，該抗菌劑作用于金黃色葡萄球菌，抑菌圈平均直徑顯著增大，但是Sm/Ag/TiO2的比例超過(guò)2:2:100時(shí)，繼續(xù)增加釤量，抑菌性能反而下滑，見(jiàn)表1(可見(jiàn)光條件下)。Sm/Ag/TiO2(2:2:100)對(duì)白色念珠菌的最小抑菌濃度是200μg/mL，最小殺菌濃度是20mg/mL，說(shuō)明此材料的抗菌性能好。

表1 材料的抗菌活性比較

3 討論

根據(jù)《消毒技術(shù)規(guī)范2006》以及《中華人民共和國(guó)化工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)機(jī)抗菌劑性能及評(píng)價(jià)》中的規(guī)定，說(shuō)明無(wú)機(jī)納米材料Sm/Ag/TiO2的抗菌效果較強(qiáng)。Brown[9]的研究發(fā)現(xiàn)納米材料的細(xì)胞毒性與粒子的直徑相關(guān)，顆粒較大時(shí)，粒子的細(xì)胞毒性明顯降低[10]。Ahamed等[11]認(rèn)為納米銀粒子誘導(dǎo)毒性的機(jī)制是粒子對(duì)細(xì)胞膜、線(xiàn)粒體和遺傳物質(zhì)的影響，但納米銀粒子經(jīng)涂層或者表面處理后的毒性明顯減小，這是由于減少了粒子與細(xì)胞成分直接接觸的機(jī)會(huì)。Ag+、稀土離子半徑相對(duì)于TiO2非常微小，小團(tuán)簇的化學(xué)形態(tài)較均勻地分散在納米TiO2顆粒的表面，形成包覆層。因此這種具有特殊核殼結(jié)構(gòu)的納米顆粒，大大增強(qiáng)了生物安全性、比表面積、抗菌性。

當(dāng)細(xì)菌吸附于二氧化鈦表面時(shí)，活性氧O2-和自由基·OH能穿透細(xì)菌的細(xì)胞壁，阻斷其呼吸系統(tǒng)以及電子傳輸系統(tǒng)，從而有效地殺滅細(xì)菌；微量銀離子可以與菌體中酶蛋白的巰基強(qiáng)烈結(jié)合，使蛋白質(zhì)凝固，破壞細(xì)胞合成酶的活性,使細(xì)胞喪失分裂增殖能力而死亡；稀土Sm3+不僅可以激活光催化抗菌,還可以溶出抗菌。Ag+及Sm3+的摻入對(duì)二氧化鈦進(jìn)行了表面改性，由于Sm3+電對(duì)所具有的勢(shì)能級(jí)高于TiO2，有效地使光生電子與空穴的分離，降低了其復(fù)合率，從而提高了TiO2光催化活性和抗菌作用。

4 結(jié)論

通過(guò)研究利用超臨界流體干燥(SCFD)結(jié)合溶膠-凝膠(Sol-gel)組合技術(shù)合成的無(wú)機(jī)納米抗菌劑Sm/Ag/TiO2的表征分析、TEM觀(guān)察以及抗菌性檢測(cè)，證明在摩爾比例為2:2:100時(shí)，，粒子的分散性較好、比表面積提高，并且在可見(jiàn)光下與口腔常見(jiàn)菌作用時(shí)，此種材料表現(xiàn)出良好的抗菌性。

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The characteristics and antibacterial activity of a rare-earth samarium/silver/titanium dioxide inorganic nanomaterials

WUJiang1,ZHANGGuo-liang1,LIUJie2,GONGZhong-ping3,ZHENGJi-hui3,LüYu-guang3

(1.School of Stomatology, Jiamusi University,Jiamusi 154002, China;2.The Affiliated Hospital of Medical College, Qingdao University,Qingdao 266000, China;3.College of Pharmacy, Jiamusi University,Jiamusi 154007, China)

Objective: To study the characteristics and antibacterial activities of an inorganic nanomaterials Sm/Ag/TiO2. Methods: The Sm/Ag/TiO2particle distribution was detected by XRD analysis and TEM observation measurement. By liquid dilution and bacteriostatic ring, the test is to evaluate the antibacterial activity effects of Sm/Ag/TiO2with the molar ratio of 2:2:100 on staphylococcus aureus and white beads coccus. Results:①The average particle diameter of Sm/Ag/TiO2was 14.62 nm；Ag and Sm ions were dispersed on the surface of TiO2in a highly dispersed and amorphous form. Thus, the intensity was stronger.②The image shows that the size of the particle was 12 nm using the scherer formula.③When the optimal mole ratio is 2:2:100, the bacteriostatic circle diameter was 16 mm, the minimum bacteriostatic concentration 200μg/mL, the minimum bactericidal concentration 2×104μg/mL.Conclusion: The inorganic nanomaterials Sm/Ag/TiO2had high specific surface area with good dispersibility and antimicrobial properties.

inorganic nanomaterials; samarium/silver/titanium dioxide; characterization analysis; antibacterial

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究面上項(xiàng)目，編號(hào)：12541821。

吳江(1980～)女，黑龍江雞西人，醫(yī)學(xué)碩士，主治醫(yī)師。

呂玉光(1965～)男，黑龍江佳木斯人，博士，教授，碩士研究生導(dǎo)師。E-mail： yuguanglv@163.com。

O611.5

A

1008-0104(2015)01-0001-03

2014-09-28)