左 璐，方 芳，楊 軍，隋小芳，張志國，雷力力

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

佳木斯地區(qū)健康人群與高血壓患者CYP3A4*1G基因多態(tài)性分析①

左 璐，方 芳，楊 軍，隋小芳，張志國，雷力力

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

目的：通過比較本地區(qū)健康人與高血壓患者CYP3A4*1G基因多態(tài)性的差異，探討CYP3A4*1G基因多態(tài)性與高血壓病的易感關(guān)系。方法 ：采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)方法檢測本地區(qū)健康人與高血壓患者的CYP3A4*1G基因型分布及等位基因頻率，通過χ2檢驗(yàn)來比較本地區(qū)健康人與高血壓患者基因型分布差異和等位基因頻率差異。結(jié)果：高血壓患者與健康人的基因分布及等位基因頻率差異有顯著性和高度顯著性(P<0.05和P<0.01)。結(jié)論：高血壓病的發(fā)生與CYP3A4*1G的堿基變異具有相關(guān)性。

高血壓；CYP3A4*1G；基因多態(tài)性；PCR-RFLP

高血壓是一種由環(huán)境因素和遺傳因素共同決定的多基因疾病。它與遺傳因素、民族和地區(qū)差異的相關(guān)性研究報(bào)道很多[1～3]，尤其是與藥物相關(guān)基因多態(tài)性的關(guān)聯(lián)及其藥物相關(guān)基因多態(tài)性分型用于指導(dǎo)臨床的可能性探討[4～6]現(xiàn)已受到重視。 藥物代謝相關(guān)基因細(xì)胞色素CYP450中的CYP3A含量占有較大的比例且以多種形式存在，占CYP450家族的30%，人體內(nèi)約有50%的藥物都是經(jīng)由CYP3A的代謝。CYP3A4位于細(xì)胞色素CYP450的CYP3A亞族中，主要位于人的肝臟和小腸中。國內(nèi)外學(xué)者陸續(xù)報(bào)道CYP3A4基因存在多態(tài)性，CYP3A4*1G (20230G>A)是2004年發(fā)現(xiàn)的CYP3A4等位基因，在中國漢族人群中的發(fā)生頻率約為22.1%～37%[7]。本研究采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)方法檢測本地區(qū)健康人與高血壓患者的CYP3A4*1G基因型分布及等位基因頻率，分析CYP3A4*1G基因多態(tài)性與高血壓病的關(guān)系。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

聚合酶鏈反應(yīng)PCR儀(S1000 Thermal Cycler)：美國BIO-RAD公司；凝膠成像分析儀(Tacan360)：上海領(lǐng)成生物科技有限公司；電泳儀(Powerpac Uniwer Supply)：美國BIO-RAD公司；電泳槽(JY-SPFL)：北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；HC-2518R高速離心機(jī)：安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司。

1.2 試劑

DNA提取純化試劑盒，GeneJETTM Genomic DNA Purification Kit(美國Fermentas公司)；Taq DNA聚合酶Hot Start Green PCR Master Min 2×(美國Fermentas公司)、引物合成(上海生工生物工程有限公司)；限制性內(nèi)切酶 SmaⅠ、Rsa Ⅰ、HphⅠ(Fermentas公司)；Gene Ruler(Fermentas公司)、瓊脂糖Regular agarose G-10(西班牙)、GelRedTM Nucleic Acid Gel Stain(美國)、Tris(Sgma公司)、EDTA(Sigma公司)。

2 方法

2.1 標(biāo)本來源

隨機(jī)選取健康體檢人員中心電圖、胸透、血尿常規(guī)、肝腎功能均正常人員體檢剩余血球(含部分血漿)；高血壓患者標(biāo)本來源于佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院高血壓患者血清藥物濃度測定后剩余血液。

2.2 CYP3A4*1G基因型檢測方法

2.2.1 血液基因DNA提取：按DNA提取試劑盒說明書提取。

2.2.2 擴(kuò)增(PCR)下游引物：5′- CACCCTGATGTCCAGCAGAAACT - 3′；上游引物：5′- AATAGAAAGCAGATGAACCAGAGCC - 3′。

CYP3A4*1G擴(kuò)增體系：提取DNA2μL,引物各1μL，Hotstar酶10μL，水10μL。

2.2.3 PCR條件： 95℃預(yù)變性4min，95℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，72℃末延伸5min，35個(gè)循環(huán)。

2.2.4 CYP3A4*1G酶切及電泳：內(nèi)切酶：FastDigest RsaI，其酶切位點(diǎn)為;5'...G T↓A C...3'3'...C A↑T G...5' 。37℃酶切5min，然后取出立即置水浴65℃滅活20min。用2%瓊脂糖凝膠，電壓145V，電泳60min。

2.2.5 酶切結(jié)果分析 野生型純合子 C/C為：217、70bp；雜合子C/T為：217、70、287bp；突變型純合子T/T為：287bp。擴(kuò)增產(chǎn)物酶切電泳圖見圖1。經(jīng)毛細(xì)管電泳測序，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。見圖2。

3 結(jié)果

本地健康人66 例和高血壓患者69例基因型及基因頻率見表1。

圖1 CYP3A4*1G酶切

注：l為Marker， 5、6為CC型野生純合子，由下至上為215bp、72 bp兩個(gè)片段，4、8為TT型突變純合子287bp片段，2、3、7、9為CT型突變雜合子由下至上為287bp、215 bp和72 bp片

圖2 CYP3A4*1G基因測序經(jīng)圖譜 H. 野生純合子CC型 I. 突變雜合子CT型 J. 突變純合子TT型 表1 本地健康人和高血壓患者CYP3A4*1G基因型及等位基因分布頻率

CC,頻率(%)CT,頻率(%)TT頻率(%)C,頻率(%)T,頻率(%)高血壓患者42(60.87)25(36.23)2(2.90)109(78.99)29(21.01)健康人20(30.30)44(66.67)2(3.03)84(63.64)48(36.36)報(bào)道[8]163(50.30)142(43.83)19(5.86)468(72.22)180(27.78)

數(shù)據(jù)使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理，本地健康人與高血壓患者CT等位基因概率χ2檢驗(yàn)，χ2=7.8，P<0.01，CCCTTT三種基因型經(jīng)χ2檢驗(yàn)，χ2=12.98，P<0.01，高血壓患者與本地健康人基因型分布及等位基因頻率有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

高血壓患者與河南健康人CT等位基因概率χ2檢驗(yàn)，χ2=2.67，P>0.05，CCCTTT三種基因型經(jīng)χ2檢驗(yàn)，χ2=2.92，P>0.05，高血壓患者與河南健康人基因型分布及等位基因頻率沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

本地健康人與河南健康人CT等位基因概率χ2檢驗(yàn)，χ2=3.91，0.01

從統(tǒng)計(jì)結(jié)果看出：健康人與高血壓患者等位基因頻率有高度顯著性，說明高血壓病的發(fā)生與CYP3A4*1G的堿基變異具有相關(guān)性。

4 討論

CYP3A4*1G基因多態(tài)性對疾病的易感關(guān)系尚未見報(bào)道。但國內(nèi)外學(xué)者對CYP3A4*1G基因多態(tài)性與一些藥物代謝的關(guān)系進(jìn)行了研究，認(rèn)為CYP3A4*1G基因突變可以影響氨氯地平的降壓療效[8]，還可以影響枸櫞酸芬太尼的代謝[9]，與抗癲癇藥卡馬西平、丙戊酸鈉、拉莫三嗪及苯巴比妥耐藥性無關(guān)[10]，本實(shí)驗(yàn)采用應(yīng)用的是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RELP) 法進(jìn)行基因檢測。與傳統(tǒng)的技術(shù)相比，此法更加靈敏、準(zhǔn)確并且操作更簡便，可以同時(shí)對大量樣本進(jìn)行檢測。對檢測CYP3A4*1G基因的部分樣本采用毛細(xì)管電泳法進(jìn)行測序，毛細(xì)管電泳法與聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RELP)法檢測結(jié)果完全一直。證明了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RELP)法用于CYP3A基因檢測是可行的。

高血壓是多基因的遺傳病，近幾年來，國內(nèi)學(xué)者對高血壓基因多態(tài)性現(xiàn)象進(jìn)行了大量的研究。本研究通過對69例高血壓患者與66例健康人CYP3A4*1G基因檢測結(jié)果分析，CYP3A4*1G在本地區(qū)健康人與患者中基因型分布及等位基因頻率有顯著性差異，CYP3A4*1G在本地區(qū)健康人與河南健康人等位基因頻率差異有顯著性；基因型分布有有高度顯著性。CYP3A4*1G在高血壓患者與河南健康人基因型分布及等位基因頻率沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

說明高血壓病的發(fā)生于CYP3A4*1G基因變異具有相關(guān)性。但由于本研究高血壓病例較少，由于缺少突變純合子組，就此說明CYP3A4*1G基因是高血壓的易感基因尚早，還有待于擴(kuò)大病例進(jìn)一步研究。

[1]劉圣航，楊軍，張志國，等.原發(fā)性高血壓患者CYP2D6*10不同基因型的心率震蕩及美托洛爾的干預(yù)作用[J].心血管康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志,2014,23(1):23-26

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[7]任欣偉，楊衛(wèi)紅，李彥鵬.河南漢族人群CYP3A4*1G和CYP3AP*13多態(tài)性及不平衡分析[J].中國新藥與臨床雜志，2010,29(8)：602-605

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The polymorphisms analysis of healthy people and hypertension patients with CYP3A4*1G gene in Jiamusi

ZUOLu,FANGFang,YANGJun,SUIXiao-fang,ZHANGZhi-guo,LEILi-li

(The First Affiliated Hospital of Jiamusi University,Jiamusi 154003,China)

Objective: To explore the relationship between CYP3A4*1G gene polymorphisms and the Hypertension pathogenesis, by comparing the differences of CYP3A4*1G Gene polymorphisms in patients with hypertension and healthy populations in Jiamusi. Method: Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) method was applied to detect the genotype distribution and the allele frequencies of CYP3A4*1G in patients with hypertension and healthy people; and to compare the differences between them according to Chi-square criterion. Results:There existed significant differences in the gene distribution and allele frequencies of CYP3A4*1G in patients with hypertension and healthy people (P<0.05,P<0.01).Conclusion:The hypertension pathogenesis is related with the base variations of CYP3A4*1G.

CYP3A4*1G; hypertension; gene polymorphism; PCR-RFLP

1.黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目，編號：2011-86； 2.紫禁城國際藥師論壇專題科研課題，編號：ZJC-2012-30。

左璐(1986～)女，黑龍江雙鴨山人，在讀碩士研究生。

雷力力(1958～)女，黑龍江佳木斯人，學(xué)士，主任藥師，碩士研究生導(dǎo)師。E-mail:leill888@126.com。

R544.1

B

1008-0104(2015)01-0007-03

2014-10-17)