劉立新，高月林，張羽男，張楠楠

(1.黑龍江省教育廳生物藥制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，佳木斯大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007；2.黑龍江農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

黃酮類化合物對(duì)耐藥金黃葡萄球菌mecA基因的影響①

劉立新1，高月林2，張羽男1，張楠楠1

(1.黑龍江省教育廳生物藥制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，佳木斯大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007；2.黑龍江農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

目的:研究黃酮類化合物對(duì)人工誘導(dǎo)的耐藥金黃葡萄球菌的耐藥基因mecA的mRNA表達(dá)水平的影響。方法:采用紙片法測(cè)定黃酮類化合物對(duì)耐藥金黃葡萄球菌的逆轉(zhuǎn)作用；利用RT-PCR法測(cè)定耐藥基因mecA的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果:耐藥金黃葡萄球菌分別被蘆丁、姜黃素、木犀草素、槲皮素和芹菜素作用后，耐藥基因mecA的相對(duì)表達(dá)量分別為0.55，0.79，0.76，0.92，和0.84。結(jié)論:黃酮類化合物能降低金黃葡萄球菌的耐藥基因mecA的表達(dá)，能對(duì)抗金黃葡萄球菌的耐藥性。

黃酮類化合物；金黃葡萄球菌；耐藥基因

近年來(lái)，由于抗生素的廣泛應(yīng)用及不合理使用，導(dǎo)致臨床上常見(jiàn)的一些病原菌產(chǎn)生嚴(yán)重的耐藥性，且其耐藥水平不斷提高，并出現(xiàn)了多重耐藥菌株，這給人類和動(dòng)物的健康帶來(lái)極大的危脅，耐藥菌感染已成為目前醫(yī)學(xué)領(lǐng)域面臨的一大挑戰(zhàn)。因此，研制和發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)細(xì)菌耐藥性的藥物成為醫(yī)藥學(xué)研究領(lǐng)域刻不容緩的問(wèn)題之一。 許多研究發(fā)現(xiàn)[1]，一些中藥能不同程度地逆轉(zhuǎn)細(xì)菌的耐藥性，提高細(xì)菌對(duì)抗生素的敏感性。目前，對(duì)于中藥耐藥抑制劑的研究主要集中于復(fù)方制劑或單方中藥上，而對(duì)于中藥有效成分逆轉(zhuǎn)細(xì)菌耐藥性機(jī)制方面研究的較少。在本實(shí)驗(yàn)中，主要應(yīng)用體外抑菌試驗(yàn)篩選對(duì)耐藥金黃色葡萄球菌有抑菌作用的黃酮類化合物，通過(guò)測(cè)定其耐藥基因相對(duì)表達(dá)量的多少，從而探討黃酮類化合物逆轉(zhuǎn)金黃葡萄球菌耐藥性的分子機(jī)制，為研究開(kāi)發(fā)作用效果好，毒副作用小的新型細(xì)菌耐藥抑制劑提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 材料、試劑和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

質(zhì)控菌株：金黃葡萄球菌ATCC2592，由佳木斯大學(xué)生命學(xué)院饋贈(zèng)。

1.1.2 藥物

蘆丁、姜黃素、槲皮素、木犀草素、芹菜素購(gòu)自佳木斯市廣源化玻批發(fā)部。克拉維酸(北京華業(yè)寰宇化工有限公司)。

1.1.3 試劑

瓊脂糖粉、水解酪蛋白、牛肉浸膏、胰蛋白胨和MH培養(yǎng)基均購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司。TRIzol(Invitrogen公司)，Prime ScriptTM RT reagent Kit(TaKaRa公司)。

1.1.4 儀器

SW-CJ-2DD單人雙面凈化工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)，PYX-DH450電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海璽恒實(shí)業(yè)有限公司)，HZQ-A恒溫培養(yǎng)搖床(HZQ-A恒溫培養(yǎng)搖床)，Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR System(Applied Biosystems，USA)。

1.2 方法

1.2.1 耐藥菌株的誘導(dǎo)及鑒定

1.2.1.1 細(xì)菌的培養(yǎng)及最小抑菌濃度(MIC值)的測(cè)定

將細(xì)菌接種于平板培養(yǎng)基上，待長(zhǎng)出菌落后，挑出單個(gè)菌落接種于2mL M-H培養(yǎng)液，37℃恒溫震蕩培養(yǎng)4～6h，使其生長(zhǎng)濁度達(dá)9×108個(gè)mL-1。放入4 ℃冰箱備用。MIC值的測(cè)定采用試管二倍稀釋法[2]。

1.2.1.2 耐藥菌株的誘導(dǎo)

耐藥菌株的誘導(dǎo)方法參考文獻(xiàn)[3]：將過(guò)夜生長(zhǎng)的細(xì)菌培養(yǎng)液接種于含1/2MIC青霉素的M-H瓊脂培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)12～16h，挑取單個(gè)菌落接種于M-H培養(yǎng)液，恒溫培養(yǎng)12～16h，然后將菌液接種于含1×MIC青霉素的M-H瓊脂培養(yǎng)基，恒溫培養(yǎng)12～16h，依此類推，逐漸將M-H瓊脂培養(yǎng)液中的藥物濃度提高，直至細(xì)菌的MIC值提高至≥256倍。

1.2.1.3 耐藥菌株鑒定

將自行誘導(dǎo)的耐藥菌株均接種于平板培養(yǎng)基上，24h后，挑取單個(gè)菌落接種于M-H培養(yǎng)液，37℃恒溫震蕩培養(yǎng)4～6h，使其生長(zhǎng)濁度達(dá)9×108個(gè)mL-1。將菌液接種到M-H瓊脂培養(yǎng)平板上，然后貼上1μg青霉素紙片，37℃恒溫培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。

1.2.1.4 生物學(xué)鑒定

按全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程進(jìn)行[4]。

1.2.2 逆轉(zhuǎn)耐藥性實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 最低抑菌濃度(MIC值)的測(cè)定

測(cè)定方法參考文獻(xiàn)[2]。

1.2.2.2 藥敏試驗(yàn)

分別將蘆丁、姜黃素、槲皮素、木犀草素、芹菜素配制成低于MIC值的藥液，挑取耐藥金黃葡萄球菌菌株于各濃度藥液中，37℃恒溫培養(yǎng)時(shí)間12～18h后，將菌液接種于平板培養(yǎng)基上，繼續(xù)37℃恒溫培養(yǎng)時(shí)間12～18h后，挑取單個(gè)菌落制成菌液，用無(wú)菌棉簽蘸取菌液均勻地涂布在M-H平板培養(yǎng)基上，待菌液稍干貼上青霉素藥敏紙片，同時(shí)設(shè)立不加藥物的耐藥金黃葡萄球菌組，敏感菌組和，經(jīng)克拉維酸處理的耐藥金黃葡萄球菌組。

1.2.3 qRT-PCR法檢測(cè)mecA的mRNA水平

1.2.3.1 RNA的提取

按1.2.2.2方法將受試菌液處理后，將所有實(shí)驗(yàn)菌株按照經(jīng)典的TRIZOL法提取總RNA[5]。

1.2.3.2 RNA的反轉(zhuǎn)錄成cDNA

采用Fermentas公司的反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄體系見(jiàn)表1。

表1 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系

體系中最后加入M-MuLV，先混勻其他的反應(yīng)物，37℃水浴5～10min，然后加入反轉(zhuǎn)錄酶，再混勻后，40℃水浴1h，75℃ 10min，最后放置冰浴3min,即為模板cDNA。

1.2.3.3 mRNA檢測(cè)

應(yīng)用7300 Real-Time PCR System 和SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒進(jìn)行熒光定量RT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為20μL，冰上配制反應(yīng)液，反應(yīng)液組成見(jiàn)表2，所用引物序列為：上游引物mecAF：5’ GTAGAAATGACTGAACGTCCGATAA 3’；下游引物mecAR：5’ CCAATTCCACATTGTTTCCGTCTAA 3’。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)液組成

PCR反應(yīng)條件為：95℃，30s；預(yù)變性，95℃，5s；60℃，31s；循環(huán)40次。

實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR所測(cè)得各基因的CT值同內(nèi)參基因β-actin的CT值相比較， 計(jì)算該基因的相對(duì)表達(dá)量，所用計(jì)算公式為：相對(duì)表達(dá)量=2-ΔΔCT其中 ΔCT=ΔCTNΔCTβ-actin(N為目的基因)

2 結(jié)果

2.1 耐藥菌株的體外誘導(dǎo)及鑒定結(jié)果

經(jīng)不濃度的青霉素梯度處理經(jīng)過(guò)88次傳代，成功地獲得了大于256×MIC耐藥菌株。體外誘導(dǎo)的耐藥菌株的鑒定結(jié)果見(jiàn)表3，表4。

表3 耐藥菌的藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表4 不同菌株生化鑒定結(jié)果

藥敏實(shí)驗(yàn)表明體外誘導(dǎo)的耐藥菌株的菌株抑菌環(huán)結(jié)果都小于10mm，生物學(xué)鑒定血漿凝固酶陽(yáng)性，V-P陽(yáng)性，麥芽糖、甘露醇產(chǎn)酸，DNA酶陽(yáng)性，鑒定結(jié)果為具有耐藥性的金黃葡萄球菌菌株。

2.2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

將各黃酮類化合物配制成低于MIC值濃度，分別為：蘆丁0.2 mg·mL-1，姜黃素0.2mg·mL-1，槲皮素0.45mg·mL-1，木犀草素0.45mg·mL-1，芹菜素0.35mg·mL-1，分別和耐藥金黃葡萄球菌作用24h后藥敏試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)，圖1。結(jié)果可見(jiàn)，蘆丁、姜黃素和槲皮素組與耐藥菌對(duì)照組相比抑菌環(huán)直徑差異顯著(*P<0.05)；并且蘆丁與耐藥菌對(duì)照組相比，差異極顯著(**P<0.01)，說(shuō)明逆轉(zhuǎn)金黃葡萄球菌耐藥性效果較好；與其他各黃酮類化合物組別效果不顯著(P>0.05)。

圖1 黃酮類化合物對(duì)耐藥菌的影響 表5 藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果

組別抑菌環(huán)直(mm)組別抑菌環(huán)直徑(mm)耐藥金黃葡萄球菌組9.12±1.03蘆 丁16.32±1.12*敏感菌組22.38±1.25**姜黃素12.9±2.10*經(jīng)克拉維酸組18.29±1.09**木犀草素10.2±1.10槲皮素13.22±1.06*芹菜素9.37±1.53

注：*P<0.05，**P<0.01與耐藥菌對(duì)照組相比。

2.3 mecA的mRNA的表達(dá)

將蘆丁、姜黃素、槲皮素、木犀草素和芹菜素分別配制成低于MIC值的藥液，取2mL藥液分別盛于5個(gè)試管中，并取挑取耐藥金黃葡萄球菌接種于各試管中，37℃恒溫培養(yǎng)時(shí)間24h后，提取總RNA，熒光定量RT-PCR分析耐藥基因mRNA的表達(dá)變化。如圖2所示，經(jīng)黃酮類化合物培養(yǎng)的耐藥金黃葡萄球菌耐藥基因mecA的mRNA的相對(duì)表達(dá)量降低，蘆丁、姜黃素、槲皮素分別將與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)，且蘆丁與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)。

圖2 黃酮類化合物對(duì)mecA的mRNA的表達(dá)的影響 表6 mecA的mRNA的表達(dá)

組別mRNA的相對(duì)水平組別mRNA的相對(duì)水平耐藥金黃葡萄球菌組1.00±0.03姜黃素0.76±0.12經(jīng)克拉維酸組0.32±0.05**木犀草素0.92±0.10槲皮素0.79±0.09芹菜素0.84±0.11蘆 丁0.55±0.06**

注：*P<0.05，**P<0.01與耐藥菌對(duì)照組相比。

3 結(jié)論

金黃色葡萄球菌是臨床上常見(jiàn)的致病性較強(qiáng)的細(xì)菌，自從青霉素問(wèn)世后，金黃色葡萄球菌引起的感染性疾病受到較大的控制，但隨著青霉素的大量和廣泛使用，一些金黃色葡萄球菌產(chǎn)生了耐藥性。耐藥的金黃色葡萄球菌已成醫(yī)院感染的重要病原菌之一[6]。我國(guó)中藥資源豐富，有著很大的潛力和廣闊的應(yīng)用前景。中藥由于具有有效成分多，毒副作用小，殘留少、作用靶位多、作用范圍廣以及不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，已成為研究者們篩選耐藥抑制劑的最佳選擇，為解決細(xì)菌耐藥性難題開(kāi)辟了捷徑。本課題選取不同的黃酮類化合物為受試對(duì)象進(jìn)行研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)將耐藥金黃葡萄球菌經(jīng)過(guò)黃酮類化合物處理陪養(yǎng)24h后，耐藥基因mecA的相對(duì)表達(dá)量降低了，并且對(duì)抗生素的敏感性提高了，尤其以蘆丁的效果更明顯。結(jié)果表明黃酮類化合物能對(duì)抗細(xì)菌的耐藥性。

[1]秦睿嶺,徐占云,李春紅,等.抗耐藥菌中藥的研究進(jìn)展[J].養(yǎng)禽與禽病防治,2010,3:3-4

[2]劉立新,高月林,王朝興,等. 黃酮化合物對(duì)金黃葡萄球菌β-內(nèi)酰胺酶活性的影響[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2013,44(3):119-122

[3]曲鵬.AcrAB外輸泵介導(dǎo)的雞沙門氏菌耐藥性研究[D]. 2008,東北農(nóng)業(yè)大學(xué)

[4]李春玲,丁永坤,王懷兵. 醫(yī)院內(nèi)感染耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的鑒定及耐藥性調(diào)查[J]. 職業(yè)與健康,2003,29(5):42

[5]Gomez MI,Lee A,Reddy B，et al.Staphylococcus aureus Protein A induces airway epithelial inflammatory responses by activating T NFR1 Nat[J].Med，2004，10：842-848

[6]李宏,郭麗曼,姜振環(huán),等.我院多重耐藥菌感染監(jiān)測(cè)與預(yù)防控制措施[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2012,35(2)：90-91

The effects of flavonoids on mecA gene of Drug-resistant staphylococcus aureus

LIULi-xin1,GAOYue-lin2,ZHANGYu-nan1,ZHANGNan-nan1

(1.The Key Laboratory for Biological Drug of the Education Department Heilongjiang, College of Pharmacy, Jiamusi University, Jiamusi 154007, China; 2. Heilongjiang Agricultural Vocational and Technical College, Jiamusi 154007, China)

Objective: To study the effects of flavonoids on the expression levels of mecA of Drug-resistant staphylococcus aureus. Methods: The reversal effects of drug-resistant staphylococcus aureus were determined by K-B paper methods. The expression levels of mecA were determined by RT-PCR method. Results: Rutin, curcumin,luteolin, quercetin and celery were acted on staphylococcus aureus, respectively which showed that the expression levels of mecA were 0.55，0.79，0.76 ，0.92 and 0.84. Conclusion: Flavonoids can reduce the meca gene expression of drug-resistance Staphylococcus aureus, and it can compete against drug resistance of Staphylococcus aureus.

flavonoids;staphylococcus aureus; Drug-resistant gene

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目，編號(hào)：12521560。

劉立新(1978～)女，黑龍江佳木斯人，在讀博士研究生，講師。

R378.1+1

A

1008-0104(2015)01-0004-03

2014-09-09)