田夢(mèng)青，李建芳，李國(guó)紅

(云南大學(xué)云南省生物資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650091)

韌革菌Stereum sp.YM F1.1660的化學(xué)成分研究

田夢(mèng)青，李建芳，李國(guó)紅

(云南大學(xué)云南省生物資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650091)

對(duì)韌革菌屬真菌Stereum sp.YMF1.1660發(fā)酵液的乙酸乙酯和正丁醇萃取物以及菌絲的甲醇提取物的化學(xué)成分進(jìn)行了研究，從中分離得到6個(gè)化合物，經(jīng)波譜數(shù)據(jù)分析鑒定為butyl-β-D-glucopyranoside(Ⅰ)、(3，4-dimethoxyphenyl)methanol(Ⅱ)、butyl-β-D-glucofuranoside(Ⅲ)、dibutyl phthalate(Ⅳ)、5α，8α-epidioxyergosta-6，22-dien-3-ol(Ⅴ)和6，9-epoxy-ergosta-7，22-dien-3-ol(Ⅵ)，其中化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ是首次從韌革菌屬真菌中分離得到。

韌革菌;發(fā)酵液;菌體;化學(xué)成分

韌革菌屬真菌主要分布在熱帶和亞熱帶地區(qū)，生于木屑或埋藏的腐木上。研究表明，該屬真菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物種類(lèi)豐富、結(jié)構(gòu)多樣，包括苯丙呋喃、酚類(lèi)、酮類(lèi)以及萜類(lèi)化合物，尤其能夠產(chǎn)生豐富的倍半萜類(lèi)化合物［1］。其中一些化合物表現(xiàn)出抗菌活性［2］、殺線蟲(chóng)活性［3］、抗氧化活性［4］、抗腫瘤活性［5］等。為了對(duì)韌革菌屬真菌的化學(xué)成分進(jìn)行比較全面的了解，作者對(duì)該屬真菌Stereum sp.YMF1.1660發(fā)酵液的化學(xué)成分進(jìn)行了研究，并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鑒定。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 菌株與培養(yǎng)基

菌株Stereum sp.YMF1.1660，自行保存。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基):馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，pH值自然。

馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(PDB培養(yǎng)基):馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 mL，pH值自然。

1.2 試劑與儀器

所用有機(jī)溶劑均為重蒸工業(yè)純?cè)噭?/p>

Sephadex LH-20型柱層析凝膠，Pharmacia公司; 200～300目柱層析硅膠、薄層層析(TLC)用硅膠G板，青島海洋化工廠;D101大孔吸附樹(shù)脂，天津興南允能高分子技術(shù)有限公司;Bruker DRX-500型超導(dǎo)核磁共振儀;Finnigan LCQ-Advantage型質(zhì)譜儀。

1.3 菌株的發(fā)酵及發(fā)酵液的濃縮萃取

菌株Stereum sp.YMF1.1660在PDA培養(yǎng)基上活化7 d，待菌絲長(zhǎng)滿平板、生長(zhǎng)旺盛時(shí)，將其轉(zhuǎn)接到PDB培養(yǎng)基中［裝液量為200 mL·(500 mL三角瓶)-1］，于28℃、180 r·min-1搖床培養(yǎng)5 d。再將活化菌株以5%的接種量接種于PDB培養(yǎng)基中［裝液量為250 mL ·(500 mL三角瓶)-1］，共發(fā)酵30 L，于28℃、160 r· min-1搖床培養(yǎng)12 d。

經(jīng)過(guò)發(fā)酵的培養(yǎng)物，用紗布將菌絲和發(fā)酵液分開(kāi)。發(fā)酵液減壓濃縮至2 L，用乙酸乙酯和正丁醇分別萃取數(shù)次，至萃取相中無(wú)明顯顏色為止，再將萃取物用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在50℃下濃縮至干，得到乙酸乙酯萃取物1.1660A(1.9 g)、正丁醇萃取物1.1660B(34.59 g)。菌絲在45℃烘箱中烘干，再用甲醇浸泡提取，得到甲醇提取物1.1660C(5.35 g)。

1.4 菌株發(fā)酵液乙酸乙酯萃取部分的分離

將1.9 g乙酸乙酯萃取物1.1660A上甲醇凝膠柱，得到6個(gè)組分(A1～A6)。

將組分A4(672 mg)上甲醇凝膠(70 g)柱，流速控制在每滴8～9 s，得到4個(gè)組分(A4-1～A4-4)。其中組分A4-2(357 mg)用等量硅膠拌樣，自然風(fēng)干，二氯甲烷及硅膠裝柱，干法上樣，用體積比為100∶1、50∶1的二氯甲烷-丙酮依次梯度洗脫，根據(jù)薄層層析展板、顯色合并相同餾分，得到3個(gè)組分(A4-2-1～A4-2-3)。其中組分A4-2-1(70 mg)上甲醇凝膠(40 g)柱得到2個(gè)組分(A4-2-1-1～A4-2-1-2)。將組分A4-2-1-1用等量硅膠拌樣，自然風(fēng)干，三氯甲烷及硅膠裝柱，干法上樣，用純?nèi)燃淄橄疵?，得到化合物?7 mg)。

將組分A5(840 mg)上甲醇凝膠柱得到3個(gè)組分(A5-1～A5-3)。其中A5-1(330 mg)用甲醇溶解后用硅膠拌樣，二氯甲烷及硅膠裝柱，干法上樣，用體積比為400∶1、300∶1、200∶1、50∶1、10∶1、2∶1、0∶1的二氯甲烷-丙酮依次梯度洗脫，根據(jù)薄層層析展板、顯色合并相同餾分，得到化合物Ⅱ(6 mg)。

1.5 菌株發(fā)酵液正丁醇萃取部分的分離

將34.59 g正丁醇萃取物1.1660B用D101大孔吸附樹(shù)脂柱層析，用體積比為0∶1、30∶1、60∶1、100∶1的乙醇-水依次梯度洗脫，得到4個(gè)組分(B1～B4)。

將組分B2(1.24 mg)上甲醇凝膠(140 mg)柱，流速控制在每滴8～9 s，得到3個(gè)組分(B2-1～B2-3)。其中組分B2-2(645 mg)用等量硅膠拌樣，自然風(fēng)干，乙酸乙酯及硅膠裝柱，干法上樣，用體積比為100∶1、80∶1、50∶1、20∶1的乙酸乙酯-甲醇依次梯度洗脫，得到4個(gè)組分(B2-2-1～B2-2-4)。將組分B2-2-2用等量硅膠拌樣，自然風(fēng)干，石油醚及硅膠裝柱，干法上樣，用體積比為300∶1、200∶1、100∶1、50∶1的石油醚-丙酮依次梯度洗脫，得到化合物Ⅲ(5 mg)。將組分B2-2-3(71 mg)用等量硅膠拌樣，自然風(fēng)干，石油醚及硅膠裝柱，干法上樣，用體積比為80∶1、50∶1、20∶1、10∶1的石油醚-丙酮依次梯度洗脫，得到化合物Ⅳ(5 mg)。

1.6 菌絲甲醇提取部分的分離

將5.35 g甲醇提取物1.1660C用甲醇溶解，等量硅膠拌樣，自然風(fēng)干，石油醚及硅膠裝柱，干法上樣，用體積比為100∶1、50∶1、20∶1、10∶1、5∶1、2∶1、0∶1的石油醚-丙酮依次梯度洗脫，根據(jù)薄層層析展板、顯色合并相同餾分，得到10個(gè)組分(C1～C10)。

將組分C4(53 mg)重復(fù)上2次丙酮凝膠(70 g)柱，流速控制在每滴8～9 s，得到3個(gè)組分(C4-1～C4-3)。其中組分C4-2(40 mg)用等量硅膠拌樣，自然風(fēng)干，石油醚及硅膠裝柱，干法上樣，用體積比為50∶1、30∶1、20∶1、10∶1、5∶1、2∶1、1∶1的石油醚-丙酮依次洗脫，得到4個(gè)組分(C4-2-1～C4-2-4)，將組分C4-2-2(8.5 mg)上丙酮凝膠(20 g)柱，分離得到化合物Ⅴ(4 mg)。

將組分C7(120 mg)上甲醇凝膠(70 g)柱，流速控制在每滴8～9 s，分離得到3個(gè)組分(C7-1～C7-3)。其中組分C7-2(80 mg)用等量硅膠拌樣，自然風(fēng)干，石油醚及硅膠裝柱，干法上樣，用體積比為30∶1、20∶1、10∶1、5∶1、2∶1、0∶1的石油醚-丙酮依次洗脫，分離得到化合物Ⅵ(12 mg)。

2 結(jié)果與討論

2.1 化合物Ⅰ～Ⅵ的結(jié)構(gòu)表征

化合物Ⅰ:無(wú)色油狀物;ESI-MS，m/z:237［M+ H］+;1HNMR(500 MHz，CD3OD)，δ:4.27(1H，d，J= 7.8 Hz)，3.87～3.95(2H，m)，3.70(1H，m)，3.58 (1H，m)，3.26～3.38(3H，m)，3.20(1H，m)，1.65 (2H，m)，1.45(2H，m)，0.98(3H，t，J=7.6 Hz);13CNMR(125 MHz，CD3OD)，δ:71.0(t，C-1)，33.3(t，C-2)，20.6(t，C-3)，14.6(q，C-4)，104.8(d，C-1')，75.6(d，C-2')，78.6(d，C-3')，72.1(d，C-4')，78.3(d，C-5')，63.3(t，C-6')。與文獻(xiàn)［6］報(bào)道的化合物數(shù)據(jù)相比較，確定化合物Ⅰ為butyl-β-D-glucopyranoside。

化合物Ⅱ:黃色油狀物;1HNMR(500 MHz，CDCl3)，δ:3.90(3H，s，MeO)，3.88(3H，s，MeO)，4.62 (2H，s，H-7)，6.86(1H，d，J=8.0 Hz，H-6)，6.90(1H，d，J=8.0 Hz，H-5)，6.93(1H，s，H-2);13CNMR(125 MHz，CDCl3)，δ:56.4(MeO)，56.3(MeO)，65.7(C-7)，111.0(C-5)，111.6(C-2)，129.8(C-6)，134.0(C-1)，149.1(C-4)，149.6(C-3)。與文獻(xiàn)［7］報(bào)道的化合物數(shù)據(jù)相比較，確定化合物Ⅱ?yàn)?3，4-dimethoxyphenyl)methanol。

化合物Ⅲ:無(wú)色油狀物;ESI-MS，m/z:237［M+ H］+;1HNMR(500 MHz，CD3OD)，δ:4.84(1H，m，overlap with water)，4.00(1H，m)，3.89～3.93(2H，m)，3.69～3.72(2H，m)，3.60～3.62(2H，m)，3.41(1H，m)，3.31(1H，m)，1.58(2H，t，J=5.8 Hz)，1.40(2H，q，J=7.6 Hz)，0.95(3H，t，J=7.4 Hz);13CNMR(125 MHz，CD3OD)，δ:109.8(d，C-1')，84.7(d，C-4')，83.8 (d，C-2')，79.2(d，C-3')，72.3(d，C-5')，69.0(t，C-1)，65.0(t，C-6')，33.3(t，C-2)，20.7(t，C-3)，14.6 (q，C-4)。與文獻(xiàn)［6］報(bào)道的化合物數(shù)據(jù)相比較，確定化合物Ⅲ為butyl-β-D-glucofuranoside。

化合物Ⅳ:無(wú)色油狀物;ESI-MS，m/z:579［2M+ Na］+，279［M+H］+;1HNMR(500 MHz，CDCl3)，δ: 7.71(2H，m)，7.52(2H，m)，4.30(4H，t，J=6.8 Hz)，1.73(4H，tt，J=7.1 Hz)，1.47(4H，qq，J=7.5 Hz)，0.96(6H，t，J=7.5 Hz);13CNMR(125 MHz，CDCl3)，δ:168.0(C-7)，132.7(C-1/2)，131.3(C-3/4)，129.2(C-5/6)，65.9(C-1'/1'')，31.0(C-2'/2'')，19.6(C-3'/3'')，14.1(C-4'/4'')。與文獻(xiàn)［8］報(bào)道的化合物數(shù)據(jù)相比較，確定化合物Ⅳ為dibutyl phthalate。

化合物Ⅴ:無(wú)色固體;ESI-MS，m/z:429［M+ H］+;1HNMR(500 MHz，CDCl3)，δ:6.53(1H，d，J= 8.4 Hz)，6.26(1H，d，J=8.5 Hz)，5.26(2H，m)，3.76 (1H，m)，1.01(3H，d，J=5.8 Hz)，0.94(3H，d，J= 6.7 Hz)，0.91(3H，s)，0.89(3H，d，J=6.7 Hz)，0.84 (3H，s)，0.83(3H，d，J=6.7 Hz);13CNMR(125 MHz，CDCl3)，δ:30.8(C-1)，35.0(C-2)，67.0(C-3)，39.9 (C-4)，83.4(C-5)，136.8(C-6 or C-22)，131.7(C-7)，80.7(C-8)，51.5(C-9)，37.5(C-10)，21.4(C-11)，37.8(C-12)，45.3(C-13)，52.1(C-14)，24.0(C-15)，29.1(C-16)，57.6(C-17)，13.1(C-18)，18.2(C-19)，40.3(C-20)，136.8(C-22 or C-6)，133.5(C-23)，44.3 (C-24)，34.4(C-25)，20.1(C-26)，20.4(C-27)，18.3 (C-28)。與文獻(xiàn)［9］報(bào)道的化合物數(shù)據(jù)相比較，確定化合物Ⅴ為5α，8α-epidioxyergosta-6，22-dien-3-ol。

化合物Ⅵ:白色針狀結(jié)晶;ESI-MS，m/z:413［M+ 1］+;1HNMR(500 MHz，CDCl3)，δ:0.60(3H，s)，0.83 (3H，d，J=6.5 Hz)，0.84(3H，d，J=6.5 Hz)，0.92 (3H，d，J=6.8 Hz)，1.02(3H，d，J=6.6 Hz)，1.08 (3H，s)，5.19(1H，dd，J=15.2 Hz，8.0 Hz)，5.23 (1H，dd，J=15.2 Hz，7.2 Hz)，4.07(1H，m)，3.63 (1H，m)，5.32(1H，brs);13CNMR(125 MHz，CDCl3)，δ:144.4(C-8)，135.8(C-22)，132.6(C-23)，118.0(C-7)，76.4(C-9)，74.1(C-6)，68.1(C-3)，56.4(C-17)，55.2(C-14)，44.2(C-10)，43.8(C-13)，43.2(C-24)，40.8(C-20)，39.9(C-4)，39.7(C-12)，37.6(C-5)，33.5(C-25)，31.3(C-1)，30.9(C-2)，28.3(C-16)，23.3(C-11)，22.5(C-15)，21.5(C-21)，21.2(C-21)，20.3(C-27)，20.0(C-26)，19.2(C-19)，17.6(C-28)，12.5(C-18)。與文獻(xiàn)［10］報(bào)道的化合物數(shù)據(jù)相比較，確定化合物Ⅵ為6，9-epoxy-ergosta-7，22-dien-3-ol。

2.2 化合物Ⅰ～Ⅵ的結(jié)構(gòu)式及生物活性

化合物Ⅰ～Ⅵ的結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。

圖1 化合物Ⅰ～Ⅵ的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structural formu la of com poundⅠ～Ⅵ

化合物Ⅰ(butyl-β-D-glucopyranoside)和化合物Ⅲ(butyl-β-D-glucofuranoside)是文獻(xiàn)［6］報(bào)道的人工合成化合物，首次在韌革菌屬(Stereum)真菌中分離得到。化合物Ⅱ［(3，4-dimethoxyphenyl)methanol］是Kanho等［7］用牽牛屬 (Pharbitisnil)的根對(duì)苯甲醛類(lèi)(benzaldehyde-type)和乙酰苯類(lèi)(acetophenone-type)衍生物進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化得到的，未報(bào)道其生物活性，其生物活性的篩選有待進(jìn)一步研究。化合物Ⅳ(dibutyl phthalate)是Savard等［11］從青霉菌屬菌株 Penicillium bilaii PB-50中分離得到的，可顯著提高乳腺上皮細(xì)胞的增殖和泌乳能力［12］，此化合物也是首次在韌革菌屬(Stereum)真菌中分離得到。韓珊等［13］研究發(fā)現(xiàn)，化合物Ⅳ會(huì)導(dǎo)致板栗幼苗枯萎?；衔铫?5α，8α-epidioxyergosta-6，22-dien-3-ol)是真菌中普遍存在的化合物?；衔铫?6，9-epoxy-ergosta-7，22-dien-3-ol)是陳曉梅等［10］從石斛小菇菌絲體的甲醇提取物中分離得到的，在韌革菌屬(Stereum)真菌中首次分離得到。

對(duì)所分離到的6種化合物進(jìn)行殺線蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，6種化合物均無(wú)殺線蟲(chóng)活性。

3 結(jié)論

從韌革菌屬真菌Stereum sp.YMF1.1660發(fā)酵液的乙酸乙酯和正丁醇萃取物以及菌絲的甲醇提取物中分離得到6個(gè)化合物:butyl-β-D-glucopyranoside(Ⅰ)、(3，4-dimethoxyphenyl)methanol(Ⅱ)、butyl-β-D-glucofuranoside(Ⅲ)、dibutyl phthalate(Ⅳ)、5α，8α-epidioxyergosta-6，22-dien-3-ol(Ⅴ)和6，9-epoxy-ergosta-7，22-dien-3-ol(Ⅵ)，其中化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ是首次從韌革菌屬真菌中分離得到。

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Study on Chem ical Constituents of Stereum sp.YMF1.1660

TIAN M eng-qing，LI Jian-fang，LIGuo-hong
(Key Laboratory for Conservation and Utilization of Bio-Resource，Yunnan University，Kunming 650091，China)

The chemical constituents of Stereum sp.YMF1.1660 were investigated.Six compounds including butyl-β-D-glucopyranoside(Ⅰ)，(3，4-dimethoxyphenyl)methanol(Ⅱ)，butyl-β-D-glucofuranoside(Ⅲ)，dibutyl phthalate (Ⅳ)，5α，8α-epidioxyergosta-6，22-dien-3-ol(Ⅴ)and 6，9-epoxy-ergosta-7，22-dien-3-ol(Ⅵ)were isolated from its ethyl acetate and n-butanol extract of broth and methanol extract ofmycelia.And the compoundsⅠ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ andⅥwere first isolated from Stereum sp..Their structureswere characterized and confirmed by spectroscopy analysis.

Stereum sp.;broth;mycelia;chemical constituents

R 284.1

A

1672-5425(2015)02-0029-04

版權(quán)聲明

《化學(xué)與生物工程》編輯部

10.3969/j.issn.1672-5425.2015.02.007

國(guó)家973計(jì)劃項(xiàng)目(2013CB127505)，云南省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2013FB003)

2014-11-19

田夢(mèng)青(1991-)，女，云南大姚人，碩士研究生，研究方向:微生物次生代謝產(chǎn)物，E-mail:793138039@qq.com;通訊作者:

李國(guó)紅，副研究員，E-mail:ligh@ynu.edu.cn。

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