許琪瑤，李 騫，宋 南，陳金軍，張學(xué)文

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長沙 410128)

一種重組融合抗菌肽ClavE-HD5的原核表達(dá)

許琪瑤，李 騫，宋 南，陳金軍，張學(xué)文

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長沙 410128)

根據(jù)海鞘Clavanins抗菌肽(ClavE)氨基酸序列和人HD5氨基酸序列，設(shè)計(jì)了一個融合的新抗菌肽ClavEHD5，通過PCR方法以大腸桿菌偏好密碼子合成該融合重組肽的編碼DNA，將該DNA克隆到大腸桿菌表達(dá)載體pET30α中，構(gòu)建了ClavE-HD5的融合表達(dá)質(zhì)粒。測序結(jié)果表明，克隆分子序列正確，可以表達(dá)1個12 kDa的帶標(biāo)簽融合蛋白。經(jīng)轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)菌株E.coli Rosetta(DE3)后，以IPTG誘導(dǎo)并經(jīng)Tricine-SDS-PAGE檢測發(fā)現(xiàn)，凝膠中出現(xiàn)預(yù)期大小的多肽帶，表明成功表達(dá)出重組的ClavE-HD5的融合抗菌肽。

ClavE;HD5;原核表達(dá)

防御素是一類分子量約為4.0～5.0 kDa、由29～35個氨基酸組成的陽離子小肽，含有6個保守的半胱氨酸組成的3個分子內(nèi)二硫鍵，可以使小分子防御素以緊密結(jié)構(gòu)抵抗蛋白酶的分解，進(jìn)而能在吞噬溶酶體中保持活性，是抗菌肽家族中最大的亞家族，是由生物體內(nèi)產(chǎn)生的構(gòu)成生物體先天免疫系統(tǒng)的一類防御性多肽，與干擾素、補(bǔ)體等組成了宿主的免疫防御系統(tǒng)［1-2］。防御素因具有高效殺菌、無毒、適用性廣、性能穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，逐漸成為抗菌應(yīng)用的重要物質(zhì)［3-4］。

1997年，Lee等［5］在無脊椎動物姬氏海鞘中發(fā)現(xiàn)Clavanins家族抗菌肽，Clavanins抗菌肽均由23個氨基酸組成，由于其C末端酰胺化，富含組氨酸，無半胱氨酸，因此在不同pH值環(huán)境下表現(xiàn)出不同的抗菌機(jī)制。Clavanins-E(ClavE)具有的這種廣譜pH值抗菌能力可能遠(yuǎn)優(yōu)于人類一般抗菌肽。

HD5是由小腸潘氏細(xì)胞、泌尿生殖道粘膜等上皮細(xì)胞表達(dá)的一種生物活性肽［6］，是抗菌活性最強(qiáng)的人α-防御素，能夠抑/殺多種細(xì)菌，如大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌等，也被發(fā)現(xiàn)能作用于原生動物［7］。有研究表明HD5有抗病毒的特性［8］，其抗菌譜廣、不易產(chǎn)生耐藥性、不影響腸道微生態(tài)平衡，可作為腸源性與生殖道的細(xì)菌感染和病毒性性病防治的候選新型藥物分子，具有良好的開發(fā)前景［9］。

人防御素的醫(yī)學(xué)價(jià)值和生理生化特性一直是研究者們所關(guān)注的焦點(diǎn)，它們參與機(jī)體防御活動并與許多疾病的發(fā)生、發(fā)展及治療相關(guān)。由于抗生素的廣泛使用，傳統(tǒng)抗生素在治療疾病的同時也產(chǎn)生了大量耐藥微生物，給醫(yī)治帶來困難。人防御素由于其穩(wěn)定的分子結(jié)構(gòu)以及小分子量等優(yōu)點(diǎn)，為研制新型藥物制劑提供了優(yōu)良的分子設(shè)計(jì)模板和骨架。由于人防御素獨(dú)特的作用機(jī)理，能避免微生物對其產(chǎn)生耐藥性［10-11］。

基因組學(xué)與生物信息學(xué)的發(fā)展為人防御素的研究注入了新的活力［10］。目前已實(shí)現(xiàn)了范式轉(zhuǎn)換(paradigm shift)。而HD5所含的疏水殘基是影響其活性的重要因素，主要是通過聚集病毒成團(tuán)來阻止病毒脫殼，抑制其DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞，可阻斷HIV對T細(xì)胞的感染［8，12-13］。HD5的特異性識別由可調(diào)控輔助受體的表達(dá)和特定的表面暴露的帶電殘基決定［8，14］。人α-防御素依賴于疏水性和電荷-電荷相互作用，疏水性殘基在保持防御素的三級和四級結(jié)構(gòu)以及形成用于病毒結(jié)合的界面發(fā)揮多重作用［14-15］。

大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有操作方便快捷、表達(dá)量大、成本低和適合工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。國內(nèi)外已有大量關(guān)于防御素在大腸桿菌中成功表達(dá)的報(bào)道［16］。為了擴(kuò)大HD5耐受pH值范圍，利用海鞘抗菌肽和人抗菌肽進(jìn)行重組，形成重組多肽，就有可能結(jié)合兩者的優(yōu)點(diǎn)，獲得更有應(yīng)用價(jià)值的新型抗菌肽。

作者根據(jù)海鞘抗菌肽ClavE和人HD5的氨基酸序列，以大腸桿菌偏好密碼子，設(shè)計(jì)了2種融合蛋白的編碼DNA序列，采用PCR方法合成了該DNA片段，并且構(gòu)建了大腸桿菌蛋白表達(dá)的重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化Rosetta(DE3)后誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白，以實(shí)現(xiàn)2個防御素分子在同一載體中的誘導(dǎo)表達(dá)，擬為防御素融合蛋白的研究奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 載體、菌株與試劑

原核表達(dá)載體pET30α、宿主菌株E.coli DH5α、E.coli Rosetta(DE3)，自行保存;Pfu DNA Polymerase，Thermo公司;Taq DNA Polymerase，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司;Trans2K Plus DNA Marker，北京全式金生物技術(shù)有限公司;BamHⅠ、HindⅢ、20 bp DNA Ladder，寶生物工程有限公司;瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒等，北京天根生物科技有限公司;其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 目的基因合成與擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)

以NCBI上已發(fā)表的氨基酸序列為參照，擬編碼氨基酸為 VFRYLGKIIHHVGNFVHGFSHVFCYCRTGRCATRESLSGVCEISGRLYRLCCR*，相對分子質(zhì)量6.109 kDa。對照氨基酸密碼子表，采用DNAMAN軟件設(shè)計(jì)基因序列，并且根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)搭橋PCR擴(kuò)增引物。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank上發(fā)表的ClavE氨基酸序列(序列號:O18492.1)和HD5氨基酸序列(序列號:1ZMP_A)設(shè)計(jì)如下引物:

以上引物均由上海生工生物有限公司合成。

1.4 ClavE和HD5基因的搭橋PCR擴(kuò)增

1.4.1 ClavE基因的搭橋PCR擴(kuò)增

以clavE-F、clavE-R互為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性1min;94℃ 變性30 s，68℃退火30 s;68℃ 延伸30 s，循環(huán)25次;68℃終末延伸5 min。取PCR產(chǎn)物15μL進(jìn)行3%瓊脂糖凝膠電泳。

1.4.2 HD5基因的搭橋PCR擴(kuò)增

第一輪以HD5-F1、HD5-R1互為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性1 min;94℃ 變性30 s，68℃ 退火30 s;68℃ 延伸30 s，循環(huán)25次;68℃終末延伸5 min。以第一輪PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，以HD5-F2和HD5-R2互為引物。反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性1 min;94℃ 變性40 s，52℃ 退火40 s;72℃ 延伸40 s，循環(huán)35次;72℃終末延伸7 min。取PCR產(chǎn)物15μL進(jìn)行3%瓊脂糖凝膠電泳。

1.4.3 ClavE-HD5基因的搭橋PCR擴(kuò)增

以clavE-F'、clavE-R'和HD5-F2、HD5-R2互為引物，分別擴(kuò)增ClavE和 HD5基因。然后以clavE-F'與clavE-HD5-F1互為引物擴(kuò)增ClavE基因;以clavE-R'與clavE-HD5-R1互為引物擴(kuò)增HD5基因，使ClavE和HD5擴(kuò)增至帶有雙方的堿基互補(bǔ)區(qū)域，分別記為clavE-HD5-1、clavE-HD5-2。反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性1 min;94℃ 變性30 s，68℃ 退火30 s;68℃ 延伸30 s，循環(huán)25次;68℃終末延伸5min。再以clavE-HD5-1和 clavE-HD5-2同時作為模板，以 clavE-HD5-F2、clavE-HD5-R2為引物使用降落PCR擴(kuò)增串聯(lián)基因ClavE-HD5。反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性1 min;94℃ 變性30 s，68℃ 退火30 s;68℃ 延伸30 s，循環(huán)10次;再95℃預(yù)變性1 min;94℃ 變性40 s，52℃ 退火40 s;72℃ 延伸40 s，循環(huán)35次;72℃終末延伸7 min。取PCR產(chǎn)物15μL進(jìn)行3%瓊脂糖凝膠電泳。

1.5 目的基因的純化與克隆

PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收。用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ分別酶切PCR產(chǎn)物和表達(dá)載體pET30α，回收目的基因片段及載體片段。以T4連接酶16℃過夜連接，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，取100μL菌液，涂布于含卡那霉素的LB平板上，37℃培養(yǎng)16 h，小量提取質(zhì)粒。對重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定。

1.6 目的基因的測序

將經(jīng)過鑒定正確的重組克隆質(zhì)粒pET30α-ClavEHD5送至鉑尚生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測定。應(yīng)用Jellyfish軟件對測序結(jié)果進(jìn)行分析，和原設(shè)計(jì)序列及氨基酸序列進(jìn)行比較。

1.7 重組菌制備和誘導(dǎo)表達(dá)

使用測序結(jié)果正確的陽性質(zhì)粒 pET30α-ClavEHD5轉(zhuǎn)化E.coli Rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，涂抹于含50μg·mL-1卡那霉素抗性的LB平板上，得到含陽性質(zhì)粒pET30α-ClavE-HD5的重組單菌落。挑取單個陽性菌落于含抗性的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12 h。以1∶50的比例轉(zhuǎn)接于含卡那霉素抗性的LB培養(yǎng)基中，37℃、150 r·min-1搖瓶培養(yǎng)至OD600≈0.6時，加入終濃度為1mmol·L-1的IPTG，28℃誘導(dǎo)1 h后每小時取樣一次制備蛋白電泳樣品。同時設(shè)置空載體未誘導(dǎo)和誘導(dǎo)對照。對制備樣品進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE檢測，分析表達(dá)結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

2.1 目的基因的克隆及鑒定

將ClavE、HD5、ClavE-HD5搭橋PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行3%瓊脂糖凝膠電泳，對重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR檢測，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖1。

圖1 PCR產(chǎn)物的電泳圖譜Fig.1 Electrophoretic profile of PCR product

由圖1可知:ClavE基因?yàn)?9 bp，HD5基因?yàn)?0 bp，ClavE-HD5為159 bp，基因擴(kuò)增片段大小和預(yù)期相符;篩選的5個pET3α-ClavE-HD5重組質(zhì)粒的電泳條帶與預(yù)期相符。

重組質(zhì)粒的測序結(jié)果表明，擴(kuò)增出的ClavE-HD5片段全長159 bp，編碼53個氨基酸，且含有終止密碼子，氨基酸序列與擬編碼氨基酸完全一致，表明已成功構(gòu)建克隆載體。ClavE-HD5基因序列及推測的蛋白質(zhì)序列如圖2所示。

圖2 ClavE-HD5的基因序列及推測的蛋白質(zhì)序列Fig.2 The gene sequence and its putative protein sequence of C lavE-HD5

2.2 ClavE-HD5原核誘導(dǎo)表達(dá)及分析

將重組表達(dá)菌Rosetta-pET30α-ClavE-HD5誘導(dǎo)表達(dá)所取樣品進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE電泳檢測，結(jié)果見圖3。

圖3 pET30α-C lavE-HD5原核誘導(dǎo)表達(dá)的Tricine-SDS-PAGE分析Fig.3 Tricine-SDS-PAGE Analysis of the p rokaryotic inducible expression of pET30α-ClavE-HD5

由圖3可知，空載體對照重組菌樣品在約10 kDa處出現(xiàn)一條特異性蛋白條帶。重組表達(dá)菌樣品在約12 kDa處出現(xiàn)一條特異性蛋白條帶，和預(yù)測相對分子質(zhì)量一致。說明空載體質(zhì)?？杀磉_(dá)8.2 kDa的標(biāo)簽，重組質(zhì)粒pET30α-ClavE-HD5可特異表達(dá)12 kDa的帶標(biāo)簽融合蛋白，目的蛋白分子質(zhì)量為6.1 kDa。

3 結(jié)論

根據(jù)海鞘Clavanins抗菌肽(ClavE)氨基酸序列和人HD5氨基酸序列，設(shè)計(jì)了一個融合的新抗菌肽ClavE-HD5，通過PCR方法以大腸桿菌偏好密碼子合成該融合重組肽的編碼DNA，將該DNA克隆到大腸桿菌表達(dá)載體pET30α中，構(gòu)建了ClavE-HD5的融合表達(dá)質(zhì)粒。測序結(jié)果表明，克隆分子序列正確，可以表達(dá)1個12 kDa的帶標(biāo)簽融合蛋白。經(jīng)轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)菌株 Rosetta(DE3)后，以 IPTG誘導(dǎo)并經(jīng) SDSPAGE檢測發(fā)現(xiàn)，凝膠中出現(xiàn)預(yù)期大小的多肽帶，表明成功表達(dá)出重組的ClavE-HD5的融合抗菌肽。

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Prokaryotic Expression of A Recombinant Fusion Antim icrobial Peptide ClavE-HD5

XU Qi-yao，LIQian，SONG Nan，CHEN Jin-jun，ZHANG Xue-wen
(College of Bioscience and Biotechnology，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China)

A novel recombinant fusion antimicrobial peptide ClavE-HD5 was designed according to ascidian clavanins antimicrobial peptide(ClavE)sequence and human HD5 amino acid sequence.The encoding DNA of the recombinant fusion peptide was synthesized via PCR with E.coli preference codons.The ClavE-HD5 fusion expression plasmid was constructed after the DNA sequence was cloned into expression vector pET30α.The sequencing results verified that the cloned moleculewas correctand capable of expressing a 12 kDa tag fusion protein.The peptide band of expectedmolecular weightwas observed by IPTG induction and Tricine-SDS-PAGE after the vector transformed into E.coli Rosetta (DE3)，which indicated that the recombinant fusion antimicrobial peptide ClavE-HD5 was successfully expressed.

ClavE;HD5;prokaryotic expression

Q 786

A

1672-5425(2015)02-0048-05

10.3969/j.issn.1672-5425.2015.02.012

2014-10-24

許琪瑤(1990-)，女，廣東揭陽人，碩士研究生，研究方向:細(xì)胞分子生物學(xué)，E-mail:xqyfly@163.com;通訊作者:張學(xué)文，教授，E-mail:xuewen_zhang@126.com。