姚志敏，劉艷華，戴培剛，向德虎，張興偉，趙韜智，王志德

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所／煙草遺傳改良與生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，山東青島266001）

煙草（Nicotianatabacum）為茄科（Solanaceae）煙屬植物，多為草本，少數(shù)為灌木或喬木，多為一年生，也有多年生。栽培煙草包括普通煙草和黃花煙草，起源于南美洲，而野生煙主要分布于美洲和大洋洲［1］。煙草是重要的模式植物，其染色體上有許多標(biāo)記基因，是進(jìn)行遺傳學(xué)研究的重要材料，而且可作為生物反應(yīng)器將其他作物的抗癌、抗艾滋病及其它有益人類健康的基因?qū)霟煵?，從轉(zhuǎn)基因煙草中提取抗癌、抗艾滋病及其它有益物質(zhì)。煙草還是重要的葉用經(jīng)濟(jì)作物，此外在食品和藥物資源開發(fā)方面有著巨大的潛在用途。

煙草野生資源中存在著許多優(yōu)異基因，如抗病抗蟲和有益活性成份基因，是進(jìn)行種屬間遠(yuǎn)緣雜交，開展煙草種質(zhì)創(chuàng)新、拓寬遺傳背景的重要基礎(chǔ)材料。在煙草種質(zhì)資源繁殖更新過程中，我們發(fā)現(xiàn)大多煙草野生種結(jié)實(shí)率、發(fā)芽率等都低于栽培品種，而目前對野生煙的繁育特性研究較少，其繁殖更新主要參照栽培種的更新方法，致使有些野生種質(zhì)繁殖更新困難，影響了野生種質(zhì)優(yōu)異基因的開發(fā)與利用，研究野生種的繁育特性對其繁殖更新、煙草種質(zhì)創(chuàng)新以及遺傳研究具有十分重要的意義［2］。

植物有性生殖過程中，有效傳粉是生殖成功的基礎(chǔ)?；ǚ郾仨氃诰哂谢盍r(shí)通過有效的傳粉媒介到達(dá)適宜的接受柱頭才能完成傳粉過程。對花粉活力及柱頭可授性的研究已引起不少學(xué)者的關(guān)注，花卉、樹木及藥用植物等［3－6］已有大量該方面的研究報(bào)道。目前國外已有不少學(xué)者對煙草花粉管萌發(fā)伸長、花粉與柱頭超微結(jié)構(gòu)及親和機(jī)制等［7－11］進(jìn)行了大量研究，國內(nèi)學(xué)者也已對煙草栽培種的花粉活力、授粉時(shí)期及結(jié)實(shí)性等［12－15］進(jìn)行了相關(guān)研究，但對野生種花粉活力、柱頭可授性及結(jié)實(shí)性的研究較少。本研究以具有代表性的繁種困難種質(zhì)花煙草（N．a(chǎn)lata）和哥西氏煙草（N．gossei）為研究對象，以栽培種K326為對照，利用TTC、聯(lián)苯胺－過氧化氫法、顯微觀察以及人工授粉等方法，對煙草野生種的花粉活力與柱頭可授性及繁育方式進(jìn)行了研究，探討煙草野生種的繁育特性，旨在為野生種的繁殖更新及開發(fā)利用提供物質(zhì)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料和方法

1．1 材 料

2013年10月將來源于國家煙草中期庫的野生煙草種質(zhì)花煙草（N．a(chǎn)lata）、哥西氏煙草（N．gossei）以及栽培品種K326播種于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所溫室內(nèi)，經(jīng)育苗、假植、移栽管理，于煙草花期進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1．2 方 法

1．2．1 花粉活力檢測 采用TTC（2，3，5－triphenyl tetrazolium chloride）法［16－17］測定花粉活力。于盛花期采集花粉，并記錄當(dāng)時(shí)溫度，將采集的花粉撒在干潔的載玻片上，滴加1～2滴0．5% TTC溶液，攪勻后迅速蓋上蓋片，放入內(nèi)有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，置于37℃黑暗條件下，30 min 后觀察染色結(jié)果。被染成紅色的為有活力的花粉，不染色或染色淺的為無活力的花粉。一個(gè)視野下的花粉活力百分比按如下公式計(jì)算：

花粉活力百分比＝變紅花粉數(shù)／花粉總數(shù)×100%

每個(gè)材料取10朵花，觀察9個(gè)視野，花粉活力取平均值，重復(fù)6次。

1．2．2 柱頭可授性檢測 采用聯(lián)苯胺－過氧化氫法［18－19］檢測3個(gè)煙草材料的柱頭可授性。于盛花期每天9：00～11：00采集20朵花，共采集4d，將柱頭浸入含有聯(lián)苯胺－過氧化氫反應(yīng)液（1%的聯(lián)苯胺∶3%的過氧化氫∶水＝4∶11∶22）的凹面載玻片的凹陷處。根據(jù)聯(lián)苯胺溶液呈色情況以及是否有氣泡產(chǎn)生確定柱頭可授性等級，分級標(biāo)準(zhǔn)為［19］：0級，不變色，無氣泡產(chǎn)生，無可授性；1 級，輕微變色，有幾個(gè)氣泡，具有輕微可授性；2級，呈淺藍(lán)色，有較少氣泡，具有低可授性；3級，呈淺藍(lán)色，有較多氣泡，具有較低可授性；4級，呈藍(lán)色，有大量連續(xù)小氣泡，具有高可授性；5級，呈深藍(lán)色，有連續(xù)大氣泡，具有更高可授性。每個(gè)材料檢測80個(gè)柱頭，統(tǒng)計(jì)不同可授性級別的柱頭數(shù)量，采用卡方檢驗(yàn)，比較各個(gè)材料柱頭可授性的差異。

1．2．3 花粉胚珠比及雜交指數(shù) （1）花粉胚珠比P／O參考Cruden［20］的方法，取一枚剛剛開裂的花藥，將花粉全部轉(zhuǎn)移到裝有1 mL 蒸餾水的離心管中，振蕩2min后形成均勻花粉液，用移液槍吸取1 μL滴加于載玻片上，在顯微鏡10倍視野下觀察花粉數(shù)，重復(fù)10次計(jì)數(shù)，取平均值記為m。每朵花的花粉量P＝m×1000×5（煙草花朵為5 枚雄蕊）。同時(shí)取下子房置于載玻片上解剖，在顯微鏡10倍視野下觀察并統(tǒng)計(jì)胚珠數(shù)O?；ǚ叟咧楸龋≒／O）＝每朵花的花粉量／胚珠數(shù)。每個(gè)材料重復(fù)5 次，P／O取均值。P／O＜5．4時(shí)，其繁育系統(tǒng)為閉花受精；P／O為5．4～31．9 時(shí)，繁育系統(tǒng)為專性自交；P／O為31．9～244．7 時(shí)，繁育系統(tǒng)為兼性自交；P／O為244．7～2 588．0時(shí)，繁育系統(tǒng)為兼性異交；P／O為＞2 588．0時(shí)，繁育系統(tǒng)為專性異交。

（2）雜交指數(shù)（OCI） 參考Dafni［17］的方法，測量煙草花冠直徑、花朵大小，并觀測開花行為。每個(gè)煙草材料測量5朵花，重復(fù)5次測量。根據(jù)花徑大小、花藥散粉與柱頭可授期之間的時(shí)間間隔及花藥與柱頭的空間位置情況，分別賦值，進(jìn)而估算出雜交指數(shù)OCI值并評判其繁育系統(tǒng)，具體為：花徑＜1 mm，賦值為0；1～2mm，賦值為1；2～6mm，賦值為2；＞6mm，賦值為3。花藥開裂散粉與柱頭可授期無時(shí)間間隔，賦值為0；有時(shí)間間隔，賦值為1?；ㄋ幣c柱頭同一高度或柱頭略低于花藥，可自然散粉于柱頭，賦值為0；花藥與柱頭空間位置發(fā)生明顯分離，賦值為1。雜交指數(shù)OCI值為三者累計(jì)值，OCI＝0時(shí)，繁育系統(tǒng)為閉花受精；OCI＝1時(shí)，繁育系統(tǒng)為專性自交；OCI＝2時(shí)，繁育系統(tǒng)為兼性自交；OCI＝3 時(shí)，繁育系統(tǒng)為自交親和，有時(shí)需要傳粉者；OCI＝4時(shí)，繁育系統(tǒng)為異交為主，部分自交親和，需要傳粉者。

1．2．4 人工授粉試驗(yàn) （1）不同開花天數(shù)柱頭可授性檢測 采用授粉套袋并統(tǒng)計(jì)結(jié)籽率的方法檢測不同開花天數(shù)的柱頭可授性，選擇開花前2d的花蕾，去雄并套袋，并采集盛花期的花粉，分別在開花前2 d、1d及花后0d、1d、2d、3d、4d對已去雄的柱頭授粉套袋，授粉時(shí)以柱頭表層布滿花粉為宜。種子成熟后及時(shí)采收并統(tǒng)計(jì)單果結(jié)籽率，單果結(jié)籽率＝平均單果結(jié)籽數(shù)／單果胚珠數(shù)，文中簡稱結(jié)籽率。試驗(yàn)重復(fù)3 次，取均值。人工授粉在每天9：00～11：00進(jìn)行，子房明顯膨大時(shí)，去掉紙袋保證果實(shí)正常發(fā)育。

（2）不同煙草材料繁育方式檢測 選擇整齊一致的開花前2d的花蕾，做以下授粉處理，每處理設(shè)3次重復(fù)：①不做任何處理，檢測自然授粉情況；②不去雄，直接單花套袋，檢測自然條件下單花自交結(jié)實(shí)情況；③去雄后，不套袋，檢測自然條件下異花授粉情況；④去雄后人工輔助授異株異花花粉，并套袋，檢測雜交親和性；⑤去雄后人工輔助授同株異花花粉，并套袋，檢測自交親和性；⑥去雄后不授粉，直接套袋，檢測是否存在無融合生殖現(xiàn)象。記錄結(jié)實(shí)情況，并統(tǒng)計(jì)出座果數(shù)與座果率。座果數(shù)即為結(jié)有種子的果實(shí)數(shù)目，座果率＝座果數(shù)／試驗(yàn)花數(shù)。

1．3 統(tǒng)計(jì)方法

使用SAS 9．2 統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)方差分析及卡方檢驗(yàn)，用Excel 2007分析結(jié)果并作圖。

2 結(jié)果與分析

2．1 不同煙草材料間花粉活力分析

由圖1可以看出，哥西氏煙草花粉活力最高，K326略高于花煙草。對3種材料的花粉活力做方差分析，結(jié)果表明哥西氏煙草與K326、花煙草間的花粉活力差異均達(dá)顯著水平，而K326與花煙草間花粉活力無顯著差異。哥西氏煙草、K326與花煙草的花粉活力分別為74．9%、52．2%、45．3%。

圖1 不同煙草材料間花粉活力差異Fig．1 Differences of pollen viability between different tobacco resources

表1 各級柱頭可授性的頻率分布Table 1 Frequency distribution for grades of stigma receptivity

2．2 不同煙草材料花粉活力日變化分析

由圖2可知，9：00～16：00哥西氏煙草花粉活力均高于K326和花煙草，13：00前花煙草的花粉活力高于K326，13：00～16：00K326高于花煙草。一天內(nèi)3 種煙草花粉活力均出現(xiàn)2 個(gè)峰值，分別在13：00與15：00左右，而2種野生煙活力最高值出現(xiàn)在13：00 左 右，K326 最高值則在15：00左右。9：00哥西氏煙草與花煙草花粉活力達(dá)到40%以上，且上午一直保持在較高水平。12：00之前K326花粉活力一直處于較低水平，至13：00達(dá)到44．50%。溫度是影響花粉活力的一個(gè)重要因素［21］，氣溫日變化對煙草花粉活力日變化情況有一定影響。上午哥西氏煙草與K326 花粉活力隨溫度升高呈上升趨勢，花煙草變化趨勢平緩。由于午后13：00～14：00溫度過高，達(dá)到40℃左右，3種煙草花粉活力均急劇下降；14：00后溫度不斷降低，花粉活力于14：00～15：00間有所回升，15：00～16：00再次呈現(xiàn)出下降的趨勢。

圖2 不同煙草材料花粉活力及氣溫日變化Fig．2 The pollen viability of different tobacco resources and temperature daily change

2．3 不同煙草材料間柱頭可授性分析

從表1中可知，3個(gè)煙草材料的柱頭均具有可授性，且不同材料間柱頭可授性有明顯差異，K326柱頭在低可授性3級以下有較少分布，集中分布于高可授性4和5級?；煵葜^可授性主要分布在低可授性1、2、3級，哥西氏煙草可授性多分布在2、3級，二者均較少表現(xiàn)高可授性4和5 級。這說明栽培品種K326柱頭可授性高，而花煙草和哥西氏煙草這2個(gè)野生種柱頭可授性偏低。

運(yùn)用卡方法分析不同煙草材料間的柱頭可授性差異，結(jié)果如表2所示。哥西氏煙草、K326、花煙草柱頭可授性的卡方檢驗(yàn)達(dá)顯著水平（P＜0．01），說明3種煙草材料間的柱頭可授性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。K326分別與花煙草、哥西氏煙草做卡方檢驗(yàn)，均達(dá)到顯著水平，K326柱頭可授性顯著高于花煙草和哥西氏煙草。對2種野生煙的柱頭可授性做卡方檢驗(yàn)，P＝0．585 8，未達(dá)顯著水平，表明這2種野生煙的柱頭可授性強(qiáng)弱差異不顯著。

2．4 不同開花天數(shù)柱頭可授性變化分析

柱頭可授性在開花過程中是不斷變化的，在不同開花時(shí)間分別給3種煙草授各自盛花期的花粉，結(jié)籽率隨開花時(shí)間的變化可以反映柱頭可授性的變化情況。開花前2d的柱頭還未完全發(fā)育成熟，柱頭可授性處于較低水平，3種煙草的結(jié)籽率也較低（圖3）。K326開花后1d的結(jié)籽率達(dá)到最高93．94%，柱頭可授性最高，隨后K326 柱頭可授性迅速降低。K326開花前1d至開花后1d，柱頭可授性強(qiáng)，結(jié)籽率高，是雜交授粉的最佳時(shí)期。哥西氏煙草柱頭在開花前1d已具有較高可授性，開花當(dāng)天達(dá)到最高后下降，但下降趨勢平緩，至開花后4d仍具有較高的柱頭可授性，其柱頭高出花藥近5 mm，很難完成自花授粉，這樣保持較長時(shí)間的柱頭高可授性可以提高借助外部傳粉媒介完成授粉的幾率?；煵葜^成熟較為緩慢，自開花前2d至花后1d結(jié)籽率一直較低，至開花后2d才達(dá)到較高水平，花后3d達(dá)到最高，隨后迅速下降，因此花煙草的最佳授粉時(shí)間宜選在花后2～3d。

表2 不同煙草材料間柱頭可授性的卡方檢驗(yàn)Table 2 Chi－square test of stigma receptivity among different tobacco resources

2．5 花粉胚珠比P ／O 與雜交指數(shù)OCI 的估算

2．5．1 花粉胚珠比P／O由表3可知，栽培品種K326單花花粉量（P）約為237 520，每朵花的胚珠數(shù)（O）約為1 440，K326 的花粉胚珠比（P／O）估算為164．85，依據(jù)Cruden［20］的標(biāo)準(zhǔn)，P／O為31．9～244．7時(shí)，繁育系統(tǒng)為兼性自交，故判斷K326的繁育系統(tǒng)為兼性自交類型；野生煙花煙草花粉胚珠比P／O的估算值為821．09，其繁育系統(tǒng)判斷為兼性異交；哥西氏煙草的花粉胚珠比P／O約為281．09，其繁育系統(tǒng)為兼性異交。

圖3 開花前后不同時(shí)間授粉對煙草結(jié)籽率的影響Fig．3 Different pollination times before and after flowering influence on tobacco seed setting rate

2．5．2 雜交指數(shù)OCI試驗(yàn)調(diào)查可知，K326花冠直徑約為3cm，大于6mm，賦值為3；在柱頭可授期內(nèi)花藥開裂散粉，無時(shí)間間隔，賦值為0；花后雄蕊略高于雌蕊柱頭，花粉可散落于柱頭，開花前部分花藥有散粉現(xiàn)象，柱頭已有授粉的可能，其賦值為0。依據(jù)Dafni［17］的評判標(biāo)準(zhǔn)，K326 的OCI值累計(jì)為3，判斷其繁育習(xí)性為自交親和，但存在一定的異交現(xiàn)象?；煵莼◤綖?．5cm 左右，賦值為3；柱頭可授期內(nèi)有花藥開裂散粉，無時(shí)間間隔，賦值為0；開花后雌蕊柱頭高于花藥1mm 以上，雌雄器官在空間位置上發(fā)生分離，賦值為1?；煵莸碾s交指數(shù)OCI累計(jì)為4，其繁育系統(tǒng)評判為以異交為主，部分自交親和，需要傳粉者。哥西氏煙草花冠直徑約為2．5cm，賦值為3；雌蕊柱頭先于花藥成熟，在柱頭可授期內(nèi)花藥散粉，賦值為0；開花后雌蕊與雄蕊在空間位置上發(fā)生明顯分離，柱頭高出花藥近5 mm，賦值為1。哥西氏煙草雜交指數(shù)OCI累計(jì)值為4，繁育習(xí)性以異交為主，但自交親和。

2．6 不同煙草材料繁育特性分析

表4結(jié)果顯示，花煙草、哥西氏煙草不去雄不套袋自然授粉的座果率很低，只有16．7%和13．3%，遠(yuǎn)低于栽培品種K326，去雄、套袋、同株或異株異花授粉時(shí)2種野生煙的座果率均明顯提高，說明人工輔助授粉可以提高兩種野生煙的座果率?；煵?、哥西氏煙草及K326在去雄不套袋的條件下有一定的結(jié)果率，說明3種煙草自然條件下均存在異花授粉現(xiàn)象。不去雄直接套袋時(shí)2種野生煙單花自交結(jié)實(shí)率極低甚至不結(jié)果，可能是由于自交不親和或缺乏有效的傳粉媒介造成的。哥西氏煙草人工輔助同株異花授粉即自交時(shí)座果率達(dá)到96．7%，且單果結(jié)籽率高達(dá)98．18%，說明哥西氏煙草自交親和，單花自交不結(jié)實(shí)現(xiàn)象是由于其柱頭與花藥空間位置分離，存在傳粉障礙且缺乏有效的傳粉媒介而導(dǎo)致無法完成授粉造成的?；煵萑斯ぽo助下的自交座果率僅有45．0%，相對于自然授粉時(shí)雖有提高，但明顯低于人工輔助異株異花授粉即異交時(shí)的座果率81．5%，而且花煙草自交時(shí)的結(jié)籽率為78．74%，比自然授粉時(shí)明顯提高，但低于異交時(shí)的結(jié)籽率，異交結(jié)籽率高達(dá)96．55%，說明花煙草以異交為主，自交親和性較差，存在部分自交不親和的現(xiàn)象，同時(shí)花煙草的柱頭與花藥存在空間傳粉障礙且自然條件下缺少有效的傳粉機(jī)制，致使花煙草結(jié)實(shí)性較差。栽培品種K326自然條件下的自花授粉座果率77．8%，遠(yuǎn)高于自然異花授粉座果率25．0%，說明K326以自花授粉為主，但存在自然異交現(xiàn)象。

表3 花粉胚珠比胚P／OTable 3 Pollen ovule ratio P／O

表4 3種煙草不同繁育方式下的結(jié)實(shí)率Table 4 Seed setting rate of 3tobacco resources under different breeding methods

3 討 論

3．1 煙草花粉生活力及柱頭可授性

花粉活力一方面受遺傳因素的影響，表現(xiàn)在不同類型間、品種間的花粉活力不盡相同［12，22］。不同類型煙草間花粉活力存在差異，但結(jié)實(shí)率高的K326花粉活力沒有顯著高于2個(gè)野生種，所以花粉活力不是造成這兩種野生煙結(jié)實(shí)性差的關(guān)鍵因素?；ǚ刍盍€會(huì)受到環(huán)境因素的影響，由于午后溫度過高導(dǎo)致該時(shí)間段內(nèi)煙草花粉活力下降，與湯日圣等［23］報(bào)道的高溫導(dǎo)致水稻花粉活力降低的研究結(jié)果相符。栽培煙雜交育種時(shí)，應(yīng)在13：00及15：00左右進(jìn)行雜交授粉，此時(shí)花粉量充足且花粉活力較高，可以更高效地進(jìn)行授粉工作。而野生煙哥西氏煙草與花煙草的花粉在上午已有較高活力，對其人工授粉可選在上午進(jìn)行。

柱頭具有可授性是植物生殖成功的前提保證［24］，而不同植物的柱頭可授性不同，不同品種間可授性［25］也存在一定的差異。煙草柱頭為濕柱頭，表面分泌物可以粘住花粉，與柱頭可授性相關(guān)［26－27］，野生煙及栽培煙親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，柱頭分泌物差異較大，造成可授性存在差異。繁育力除了與花粉活力有關(guān)外，還明顯受到柱頭可授性的影響，K326柱頭可授性高于花煙草、哥西氏煙草，可能是K326相較于兩種野生煙結(jié)實(shí)性好的一個(gè)原因。此外，柱頭可授性與開花時(shí)間有關(guān)［28］，開花時(shí)間影響柱頭的成熟度，所以對可授性具有明顯影響，煙草柱頭可授性即隨開花時(shí)間呈先升后降的變化趨勢。柱頭可授期及最佳授粉時(shí)期在植物生殖過程中十分重要，很大程度上影響著傳粉率［29］，而且確定最佳授粉時(shí)期有助于建立高效的雜交或自交技術(shù)?；煵?、哥西氏煙草及K326在開花前2d至花后4d均具有柱頭可授性，但可授性強(qiáng)弱發(fā)生著變化，選擇最佳授粉時(shí)期進(jìn)行授粉可以提高結(jié)實(shí)率。野生煙花煙草在花后2～3d才有較強(qiáng)的柱頭可授性，最佳授粉時(shí)間宜選在花后2～3d，哥西氏煙草自開花前1d至花后4d保持著較高的可授性，是其授粉的適宜時(shí)期，而栽培品種K326宜選在開花前1d至花后1d進(jìn)行授粉。

3．2 煙草繁育習(xí)性

花粉胚珠比P／O和雜交指數(shù)OCI及授粉試驗(yàn)均表明K326繁育系統(tǒng)為兼性自交，以自花授粉為主，有一定的異交率，這與顏洪合［15］通過套袋自交與自然授粉的方法對紅花煙草的研究結(jié)果一致。煙草栽培種繁殖更新時(shí)應(yīng)采用套袋自交以防止由于昆蟲或風(fēng)力傳粉造成的品種混雜。P／O與OCI表明花煙草、哥西氏煙草以異交為主，部分自交親和，但需要傳粉者。在自然授粉條件下，花煙草、哥西氏煙草開花后自然脫落，座果率極低，從授粉試驗(yàn)結(jié)果來看造成這兩種野生煙結(jié)實(shí)性差的原因有所差別：花煙草的柱頭略高于花藥，傾向于異交，但部分花朵的花藥散粉后可接觸到柱頭下沿，可以完成自花授粉，所以花煙草結(jié)實(shí)性差不僅因?yàn)橹^與花藥的空間分離，主要由其部分自交不親和造成。而哥西氏煙草的柱頭明顯高于花藥，存在自花授粉的空間障礙，在外界傳粉媒介效率極低的自然條件下無法完成授粉受精，就會(huì)導(dǎo)致自然授粉結(jié)實(shí)率低的現(xiàn)象。所以野生煙花煙草、哥西氏煙草繁殖更新時(shí)需要建立有效的傳粉機(jī)制如增加傳粉昆蟲及人工輔助授粉等提高異交率，且針對花煙草的自交不親和可以采取蕾期授粉、混合授粉及施用生長調(diào)節(jié)物質(zhì)或其它化學(xué)物質(zhì)等方法［30－32］以提高其結(jié)實(shí)率。另外，兩種野生煙胚珠數(shù)僅約為K326的1／3，對繁殖更新中采收足夠量種子增加困難，故種子成熟后應(yīng)及時(shí)采收。

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