胡立志，陳昊，孫立斌，張萍，齊良俊，孫樹坤，解桂東，于殿宇

（1.國家大豆工程技術(shù)研究中心，哈爾濱150050；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱150030）

真空無溶劑體系中酯化和酯交換生物合成甾醇酯

胡立志1，陳昊1，孫立斌2，張萍1，齊良俊2，孫樹坤1，解桂東2，于殿宇2

（1.國家大豆工程技術(shù)研究中心，哈爾濱150050；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱150030）

使用固定化脂肪酶Lipozyme IM和Novozym 435作為催化劑，以轉(zhuǎn)換率為指標(biāo)，在真空度30 mbar、80℃、無溶劑和無添加水的反應(yīng)條件下，探討反應(yīng)時(shí)間、酶添加量、甾醇添加量對酯交換生物合成甾醇酯的影響，通過響應(yīng)面分析對固定化脂肪酶Lipozyme IM作為催化劑條件進(jìn)行優(yōu)化。最佳反應(yīng)條件為：反應(yīng)溫度80℃、真空度30 mbar、反應(yīng)時(shí)間48 h、酶添加量1.0%、甾醇添加量6.3%，轉(zhuǎn)換率為97.65%。使用固定化脂肪酶Lipozyme IM作為催化劑條件下，甾醇與油酸甲酯進(jìn)行酯交換，即使重復(fù)使用10次后仍保持90%以上轉(zhuǎn)換率，脂肪酶Novozym 435仍保持40%以上轉(zhuǎn)換率。

脂肪酶；酯化和酯交換；植物甾醇；植物甾醇酯；脂肪酸

植物甾醇是一種甾體化合物，具有重要生理功能，在降低膽固醇、抗癌、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等方面功效明顯。甾醇是甾族化合物中一類，由于其常態(tài)為固態(tài)，所以又稱作固醇，主要以游離、高級脂肪酸酯、苷三種形式存在于動物、植物和微生物體內(nèi)，至今已發(fā)現(xiàn)100多種植物甾醇，含量較豐富的主要有β-谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇和菜籽甾醇[1-2]。植物甾醇可有效降低血液中膽固醇含量，降低心腦血管疾病發(fā)生。植物甾醇具有抗癌、抗動脈粥樣硬化、抗氧化和抗炎等功效，被廣泛應(yīng)用于制藥、保健品、化妝品、動植物生長激素及化工、紡織等各領(lǐng)域[3-4]。雖然植物甾醇具有降低血清膽甾醇水平功效，但游離植物甾醇在水和油脂中的低溶解性限制其在食品中實(shí)際應(yīng)用[5-6]。植物甾醇酯在植物油脂中含量非常少，但具有更優(yōu)脂親和性和更佳的降膽固醇效果，這不僅方便甾醇在含脂食品中傳遞，生物利用率高，溶解度好，還可改善產(chǎn)品外觀及口感[7-8]。臨床試驗(yàn)表明，成人每天攝入1.3 g以上植物甾醇酯即可達(dá)到顯著降低膽固醇目的[9-10]。

甾醇酯通過相應(yīng)甾醇與脂肪酸酯化、脂肪酸甲酯或三酰甘油酯交換、脂肪酸鹵化物或脂肪酸酐反應(yīng)制取[10-12]。Katsunori等、裘愛泳等分別采用脂肪酶催化甾醇與不飽和脂肪酸在含水溶劑體系中反應(yīng)生產(chǎn)甾醇酯[13-14]，關(guān)于植物油脂與植物甾醇在真空和無溶劑體系中反應(yīng)合成植物甾醇酯的研究較少。

本試驗(yàn)在真空、無溶劑、無添加水反應(yīng)條件下，使用固定化脂肪酶Lipozyme IM和Novozym 435作為催化劑，生物合成植物甾醇酯，對油酸、油酸甲酯和三油酸甘油酯與植物甾醇發(fā)生酯化和酯交換反應(yīng)合成植物甾醇酯的方法進(jìn)行研究，在真空和不同脂肪酶條件下，比較反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、脂肪酶添加量、甾醇添加量、脂肪酶使用次數(shù)等試驗(yàn)條件下對酯化和酯交換反應(yīng)的影響，為實(shí)際生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

甾醇、油酸、油酸甲酯和三油酸甘油酯及固定化脂肪酶Lipozyme IM均購自Sigma公司；固定化脂肪酶Novozym 435購自諾維信公司，其他試劑藥品均為分析純。

1.2 方法

精確稱量一定量的植物甾醇、油酸或油酸甲酯或三油酸甘油酯及脂肪酶Novozym 435或Lipozyme IM，通過磁力攪拌在有螺旋蓋真空管中進(jìn)行40、60和80℃及不同反應(yīng)條件試驗(yàn)，真空度30 mbar，反應(yīng)完成后，3 000～4 000 r·min-1條件下離心20 min，取上層反應(yīng)物。

1.3 轉(zhuǎn)換率測定

反應(yīng)過程中每隔2 h收集樣品，注入氣相色譜并使用下列公式計(jì)算轉(zhuǎn)換率（%）。

谷甾醇和谷甾醇酯使用標(biāo)準(zhǔn)試劑確定，峰面積與濃度成比例。

2 結(jié)果與分析

2.1 反應(yīng)溫度對轉(zhuǎn)換率的影響

結(jié)果見圖1，2。

圖1 溫度對油酸和油酸甲酯與甾醇酯化和酯交換轉(zhuǎn)換率的影響(使用酶Novozym 435)Fig.1Effect of temperature on the conversion rate of phytosterol with oleic acid and transesterification with methyl oleate using Novozym 435

圖2 溫度對油酸、油酸甲酯及三油酸甘油酯與甾醇酯化和酯交換轉(zhuǎn)換率的影響(使用酶Lipozyme IM)Fig.2Effect of temperature on the conversion rate of phytosterol with oleic acid and transesterification with methyl oleate or triolein using Lipozyme IM

反應(yīng)溫度是影響轉(zhuǎn)換率的主要因素。在真空和不同溫度條件下，采用固定化脂肪酶Novozym 435和Lipozyme IM催化，研究甾醇與不同酰基供體在酯化反應(yīng)和酯交換反應(yīng)中的轉(zhuǎn)換率。由圖1可知，使用酶Novozym 435催化條件下，反應(yīng)溫度對油酸和油酸甲酯與甾醇酯化和酯交換轉(zhuǎn)換率影響結(jié)果顯示，反應(yīng)溫度對轉(zhuǎn)換率影響顯著，40和60℃條件下轉(zhuǎn)換率明顯升高，80℃反應(yīng)條件下，油酸與甾醇酯化轉(zhuǎn)換率達(dá)到88.7%，油酸甲酯與甾醇酯交換轉(zhuǎn)換率達(dá)到99.2%，轉(zhuǎn)換率增加隨溫度升高而增加，使用酶Lipozym IM催化條件下，反應(yīng)溫度對油酸、油酸甲酯和三油酸甘油酯的酯化和酯交換轉(zhuǎn)換率影響結(jié)果一致（見圖2）。

2.2 反應(yīng)時(shí)間對轉(zhuǎn)換率的影響

結(jié)果見圖3。

圖3 時(shí)間對油酸、油酸甲酯及三油酸甘油酯與甾醇酯化和酯交換的轉(zhuǎn)換率影響(使用酶Lipozyme IM)Fig.3Effect of time on the conversion rate of phytosterol with oleic acid and transesterification with methyl oleate or triolein using Lipozyme IM

反應(yīng)時(shí)間是影響轉(zhuǎn)換率的主要因素。反應(yīng)時(shí)間過短，酯化和酯交換反應(yīng)不完全；反應(yīng)時(shí)間過長，影響品質(zhì)，造成資源浪費(fèi)。由圖3可知，在使用酶Lipozym IM催化條件下，反應(yīng)時(shí)間對油酸和油酸甲酯及三油酸甘油酯與甾醇酯化和酯交換轉(zhuǎn)換率影響顯著，隨時(shí)間增加，轉(zhuǎn)換率快速上升，反應(yīng)時(shí)間24 h，達(dá)到較高轉(zhuǎn)換率，其中油酸與谷甾醇酯化率達(dá)到63.5%，油酸甲酯與甾醇酯酯交換率達(dá)到97.3%，三油酸甘油酯與甾醇酯酯交換率達(dá)到90.1%。反應(yīng)時(shí)間48 h后，轉(zhuǎn)換率分別緩慢增加到各自最高值。

2.3 酶添加量對轉(zhuǎn)換率的影響

結(jié)果見圖4。

圖4 酶催化劑量對轉(zhuǎn)換率的影響Fig.4Effect of enzyme dosage on conversion rate

由圖4可知，在真空度30 mbar和溫度80℃，使用固定化脂肪酶Novozym 435和Lipozyme IM為催化劑，采用油酸甲酯作為酰基供體的條件下，不同酶添加量（0.4%、0.6%、0.8%、1.0%和1.2%）對油酸甲酯與甾醇酯交換轉(zhuǎn)換率影響結(jié)果顯示，在酶添加量1.0%條件下,兩種酶催化效果相近，最高酯交換率均達(dá)到約98%，試驗(yàn)結(jié)果顯示，酶用量0.4%～1.0%時(shí)，轉(zhuǎn)換率隨脂肪酶添加量增加而增加。

2.4 甾醇添加量對轉(zhuǎn)換率的影響

結(jié)果見圖5。

圖5 甾醇添加量對轉(zhuǎn)換率的影響Fig.5Effect of phytosterol dosage on conversion rate using Lipozyme IM

由圖5可知，在真空度30 mbar和溫度80℃，使用固定化脂肪酶Lipozyme IM作為催化劑條件下，甾醇添加量對酯交換轉(zhuǎn)換率影響結(jié)果表明，甾醇添加量2.0%～7.0%時(shí)，對酯交換轉(zhuǎn)換率有顯著影響，即酯交換轉(zhuǎn)換率隨甾醇添加量增加而顯著增加，6.0%添加量達(dá)到較高轉(zhuǎn)換率。

2.5 二次回歸方程建立與分析

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上采用中心組合設(shè)計(jì)（Box-Benhnken），以反應(yīng)時(shí)間（A）、加酶量（B）和甾醇添加量（C）為自變量，以轉(zhuǎn)換率（R1）為響應(yīng)值設(shè)計(jì)3因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)。自變量水平編碼見表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表2。

表1 因素水平編碼Table 1Code of factors and levels

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果Table 2Design proposal and experiment result of response surface

利用Design Expert 7.0.0軟件對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

表3 方差分析結(jié)果Table 3Test results of variance analysis

通過對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到轉(zhuǎn)換率（R1）對自變量反應(yīng)時(shí)間（A）、酶添加量（B）和甾醇添加量（C）的回歸方程為：

R1=97.67-0.21A-0.14B+0.73C-0.048AB+0.95 AC-0.22BC-1.03A2-1.13B2-1.36C2

由表3可知，方程因變量與自變量之間線性關(guān)系明顯，該模型回歸顯著（P＜0.0001）失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），該模型R2=96.61%，R2Adj=92.26%，說明該模型與試驗(yàn)擬合良好。圖6～8分別是反應(yīng)時(shí)間（h）、酶添加量（%）和甾醇添加量（%）交互作用對轉(zhuǎn)換率的響應(yīng)曲面圖。

由圖6可知，隨反應(yīng)時(shí)間及酶添加量增加，轉(zhuǎn)換率均呈現(xiàn)先升高后緩慢下降。由此可見，轉(zhuǎn)換率極值出現(xiàn)在試驗(yàn)范圍內(nèi)，在反應(yīng)時(shí)間約為48 h，酶添加量1.0%～1.2%時(shí)，轉(zhuǎn)換率在97%以上。

由圖7可知，隨反應(yīng)時(shí)間與甾醇添加量增加，轉(zhuǎn)換率均呈現(xiàn)先升高后緩慢下降趨勢。由此可見，轉(zhuǎn)換率極值出現(xiàn)在試驗(yàn)范圍內(nèi)，在反應(yīng)時(shí)間約為48 h，酶添加量0.55%～0.65%時(shí)，轉(zhuǎn)換率在97%以上。

由圖8所示，隨酶添加量與甾醇添加量增加，轉(zhuǎn)換率均呈現(xiàn)先升高后緩慢下降趨勢。由此可見，轉(zhuǎn)換率極值出現(xiàn)在試驗(yàn)范圍內(nèi)，在酶添加量1.0%，甾醇添加量0.55%～0.65%時(shí)，轉(zhuǎn)換率在97%以上。

圖6 反應(yīng)時(shí)間與酶添加量影響轉(zhuǎn)換率的響應(yīng)面Fig.6Response surface and contour of effect of A and B on conversion rate

圖7 反應(yīng)時(shí)間與甾醇添加量交互影響轉(zhuǎn)換率的響應(yīng)面Fig.7Response surface and contour of effect of A and C on conversion rate

圖8 酶添加量與甾醇添加量交互影響轉(zhuǎn)換率的響應(yīng)面Fig.8Response surface and contour of effect of B and C on conversion rate

應(yīng)用響應(yīng)面優(yōu)化分析方法對回歸模型進(jìn)行分析，尋找最優(yōu)響應(yīng)結(jié)果見表4。

表4 響應(yīng)面尋優(yōu)結(jié)果Table 4Results of response surface optimization

為檢驗(yàn)響應(yīng)面方法所得結(jié)果可靠性，按照上述整理值進(jìn)行試驗(yàn)，轉(zhuǎn)換率為97.65%。預(yù)測值與試驗(yàn)值之間擬合良好，證實(shí)模型有效。

2.6 酶重復(fù)使用次數(shù)對轉(zhuǎn)換率的影響

結(jié)果見圖9。

圖9 脂肪酶Novozym 435和Lipozyme IM重復(fù)使用的穩(wěn)定性Fig.9Stability of repeated using time of lipase Novozym435 and Lipozyme IM

由圖9可知，在真空度30 mbar和80℃，使用固定化脂肪酶Novozym 435和Lipozyme IM為催化劑條件下，研究脂肪酶重復(fù)使用對酯交換反應(yīng)程度的影響。在重復(fù)使用過程中Novozyme 435重復(fù)使用10次仍保留40%活性。Lipozyme IM酶經(jīng)過10次酯交換反應(yīng)，仍保留大部分活性。

3 討論

目前國內(nèi)學(xué)者關(guān)于植物甾醇酯合成方法和工藝研究主要集中在有機(jī)介質(zhì)或者以水為溶劑時(shí)植物甾醇酯合成工藝方法和條件。張敏等選擇脂肪酶Lipozyme 435為催化劑，叔丁醇（分子篩脫水）為溶劑，以酯化率為目標(biāo)，確定合成二酯最佳反應(yīng)條件為：脂肪酶Lipozyme 435用量100 g·L-1，單酯濃度50 mmol·L-1，單酯與赤蘚糖醇物質(zhì)的量比1.0∶3.5，反應(yīng)溫度55℃，反應(yīng)時(shí)間120 h，該條件下酯化率可達(dá)81.6%[12]。也有以超臨界流體萃取作為酶催化反應(yīng)介質(zhì)，為能夠得到食品級植物甾醇酯產(chǎn)品，通常采取無溶劑酯交換法合成。因此，植物油脂與植物甾醇在真空和無溶劑體系中反應(yīng)合成植物甾醇酯的研究具有重要意義。

化學(xué)法制備植物甾醇酯具有易實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)和工藝條件簡單的優(yōu)勢，但反應(yīng)溫度相對較高，易產(chǎn)生產(chǎn)品褐變、副反應(yīng)等，導(dǎo)致植物甾醇品質(zhì)下降等。采用酶法合成方法具有催化反應(yīng)過程溫和環(huán)境友好，可節(jié)省能耗，還可避免副反應(yīng)發(fā)生以及無毒安全特點(diǎn)[15]。馬媛等利用甾烷醇與亞油酸，無溶劑條件下采用直接酯化法合成亞油酸甾烷醇酯，優(yōu)化得出最佳合成工藝：反應(yīng)時(shí)間5 h，反應(yīng)溫度150℃，亞油酸與甾烷醇物質(zhì)的量比3∶1，催化劑用量3%，此條件下，亞油酸甾烷醇酯酯化率可達(dá)到81.23%[16]。酶法合成植物甾醇酯，催化反應(yīng)過程溫和，環(huán)境友好，但植物甾醇酯酶法合成成本較高，難于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化，如何降低生產(chǎn)成本并保持高效生產(chǎn)尚待于深入研究。

4 結(jié)論

本研究在真空、無溶劑、無添加水反應(yīng)條件下，使用固定化脂肪酶Lipozyme IM和Novozym 435作為催化劑，生物合成植物甾醇酯，對油酸、油酸甲酯和三油酸甘油酯與植物甾醇發(fā)生酯化和酯交換反應(yīng)合成植物甾醇酯的方法進(jìn)行探索。本研究結(jié)果表明，一定范圍內(nèi)，酯化和酯交換反應(yīng)程度強(qiáng)烈隨參數(shù)增加而增加。在最佳反應(yīng)條件下，即反應(yīng)溫度80℃、真空度30 mbar、反應(yīng)時(shí)間48 h、酶添加量1.0%、甾醇添加量6.3%，轉(zhuǎn)換率為97.65%。植物甾醇與油酸酯化或與油酸甲酯或三油酸甘油酯酯交換反應(yīng)幾乎全部轉(zhuǎn)換為相應(yīng)長鏈?；?，脂肪酶經(jīng)過10次酯交換反應(yīng)重復(fù)使用，仍保留較高活性。

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Synthesis of phytosteryl esters by esterification and transesterification in vacuo and without solvent using lipases/

HU Lizhi1,CHEN Hao1,SUN Libin2, ZHANG Ping1,QI Liangjun2,SUN Shukun1,XIE Guidong2,YU Dianyu2
(1.The National Research Centre of Soybean Engineering and Technology,Harbin 150050,China;2.School of Food Science, NortheastAgricultural University,Harbin 150030,China))

Phytosteryls has been converted in high extent to the corresponding long-chain acyl esters via esterification with oleic acid or transesterification with methyl oleate or trioleoylglycerol using immobilized lipases Lipozyme IM and Novozym 435 as biocatalysts in vacuo 30 mbar and without adding water or solvent,at 80℃.This paper had investigated the effect of temperature,time and phytosterol dosage on conversion.By the response surface analysis,the optimum operating parameters of synthesis of phytosteryl esters by esterification and transesterification were as follows:reaction temperature of 80℃,vacuum of 30 mbar,reaction time of 48 h,enzyme dosage of 1.0%,phytosteryl dosage of 6.3%,the conversion rate was 97.65%.Transesterification of phytosteryls and fatty acid methyl ester using immobilized lipases Lipozyme IM as biocatalysts,lipases Lipozyme IM remained the conversion rate of more than 90%even after 10 times of repeated use.Lipase Novozym 435 remained the conversion rate of more than 40%.

lipases;esterification and transesterification;phytosteryls;phytosteryl esters;fatty acids

TQ645.9+8

A

1005-9369（2015）09-0038-06

時(shí)間2015-9-23 9：38：06[URL]http：//www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20150923.0938.002.html

胡立志,陳昊,孫立斌,等.真空無溶劑體系中酯化和酯交換生物合成甾醇酯[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2015,46(9):38-43.

Hu Lizhi,Chen Hao,Sun Libin,et al.Synthesis of phytosteryl esters by esterification and transesterification in vacuo and without solvent using lipases[J].Journal of Northeast Agricultural University,2015,46(9):38-43.(in Chinese with English abstract)

2015-04-08

黑龍江省級基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)課題項(xiàng)目(DADOU2014-2)

胡立志（1956-），男，教授，博士，研究方向?yàn)橛椭庸ず屠?。E-mail：hlz035d832n@yeah.net