王寧，段逵，宋鶴，張瀟飛，張?zhí)炷?，張文建，閆曉紅，王守志，李輝

（農(nóng)業(yè)部雞遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱150030）

雞miR-20a靶基因TP53INP1鑒定

王寧，段逵，宋鶴，張瀟飛，張?zhí)炷浚瑥埼慕?，閆曉紅，王守志，李輝

（農(nóng)業(yè)部雞遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱150030）

前期研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)miR-17-92基因簇能促進(jìn)雞前脂肪細(xì)胞增殖，但作用機(jī)制尚不清楚。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，TP53INP1是miR-17-92基因簇成員miR-17-5p和miR-20a的潛在靶基因，研究采用熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)和基因過(guò)表達(dá)技術(shù)開(kāi)展該靶基因的驗(yàn)證。結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)miR-17-92基因簇能顯著抑制TP53INP1的3' UTR報(bào)告基因活性；而轉(zhuǎn)染miR-20a抑制劑能顯著提高TP53INP1的3'UTR報(bào)告基因活性。將miRNA抑制劑分別轉(zhuǎn)染到DF1細(xì)胞和雞前脂肪細(xì)胞中，采用real-time RT-PCR方法檢測(cè)細(xì)胞TP53INP1基因表達(dá)變化。結(jié)果顯示，miR-20a抑制劑能促進(jìn)TP53INP1表達(dá)，TP53INP1是miR-20a的一個(gè)靶基因。

雞；miR-17-92基因簇；前脂肪細(xì)胞；TP53INP1；基因表達(dá)

miRNA是一類非編碼小RNA分子，通過(guò)與靶mRNA不完全堿基互補(bǔ)配對(duì)，導(dǎo)致靶基因mRNA降解或翻譯抑制，調(diào)控靶基因表達(dá)[1]。miRNA是機(jī)體發(fā)育中必不可少的小RNA分子，目前很多研究證明，miRNA參與動(dòng)物細(xì)胞發(fā)育、增殖，分化、凋亡及代謝等過(guò)程[2-3]。miRNA基因在染色體上的分布非隨機(jī)，miRNA基因緊密相鄰，排列成簇[4-5]。miR-17-92基因簇是目前受關(guān)注miRNA簇之一，該基因簇能編碼產(chǎn)生miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b和miR-92等成員，該簇miRNA成員在多種腫瘤中高表達(dá)，過(guò)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致疾病和癌癥發(fā)生[6-7]。

人體miR-17-92基因簇位于13號(hào)染色體C13orf25上[8]，該miRNA簇在動(dòng)物發(fā)育和疾病發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮重要作用，可增加成骨細(xì)胞增殖能力[9]，調(diào)節(jié)脂肪形成多個(gè)信號(hào)通路[10]。本研究前期在雞前脂肪細(xì)胞小RNA重測(cè)序中發(fā)現(xiàn)mir-17-92基因簇在雞前脂肪細(xì)胞中表達(dá)[11]，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-17-92基因簇過(guò)表達(dá)能促進(jìn)雞前脂肪細(xì)胞增殖（未發(fā)表）。但miR-17-92基因簇促進(jìn)雞脂肪細(xì)胞增殖的機(jī)制仍不清楚。

TP53INP1是一個(gè)p53誘導(dǎo)核蛋白1，TP53INP1能影響細(xì)胞進(jìn)程，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡等[12-13]。本研究生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，TP53INP1基因3'UTR存在miR-17-92基因簇成員miR-20a和miR-17-5p的集合位點(diǎn)，提示TP53INP1就是miR-17-92基因簇的靶基因[14]。為揭示miR-17-92基因簇促進(jìn)雞前脂肪細(xì)胞增殖的分子機(jī)制，本研究開(kāi)展雞miR-17-92基因簇靶基因TP53INP1鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

脂肪組織來(lái)自東北農(nóng)業(yè)大學(xué)高、低脂雙向選擇系（NEAUHLF）高脂雞，miR-17-92基因簇過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-miR-17-92、雞前脂肪細(xì)胞（ICPA）和胚胎成纖維細(xì)胞（DF1）均為農(nóng)業(yè)部雞遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存，psiCHECK2載體購(gòu)自Promega公司，miR-17-5p inhibitor、miR-20a inhibitor、miR-19a inhibitor和miR-19b inhibitor購(gòu)自上海吉瑪公司。

1.2RNA提取與反轉(zhuǎn)錄

使用Trizol提取東北農(nóng)業(yè)大學(xué)高、低脂雙向選擇系（NEAUHLF）的高脂雞脂肪組織，雞胚胎成纖維DF1細(xì)胞和ICPA細(xì)胞總RNA，以A260/A280比值在（1.8～2.0）高質(zhì)量的RNA作為模板，采用Promega反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。

1.3 載體構(gòu)建

以東北農(nóng)業(yè)大學(xué)高低脂雙向選擇系（NEAUHLF）高脂雞脂肪組織cDNA為模版，使用primer 5.0設(shè)計(jì)引物（見(jiàn)表1），采用RT-PCR擴(kuò)增TP53INP1（NM_001030946.1）的3'UTR，該片段包含miR-17-92基因簇成員結(jié)合位點(diǎn)的片段（835 bp）；將擴(kuò)增片段克隆到含有XhoⅠ和NotⅠ酶切位點(diǎn)的psi-CHECK2雙熒光素酶報(bào)告基因載體上，構(gòu)建成psi-CHECK2-TP53INP1。

表1RT-PCR引物和real-time PCR引物序列Table 1Primer sequences for RT-PCR and real-time PCR

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

DF1和前脂肪細(xì)胞均采用完全培養(yǎng)基（DMEM/ F12+10%FBS），并在37℃5%CO2條件下培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前，將細(xì)胞按照每孔1×104密度接種到六孔板，待細(xì)胞完全貼壁并生長(zhǎng)至70%～80%密度時(shí)轉(zhuǎn)染。細(xì)胞轉(zhuǎn)染參照Invitrogen脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)。將質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至六孔板細(xì)胞中；每孔加入質(zhì)粒2 μg，轉(zhuǎn)染試劑8 μL；轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，檢測(cè)熒光素酶活性。

1.5 熒光素酶活性檢測(cè)

使用Dual-Luciferase Reporter Assay System（Promega公司）分別檢測(cè)螢火蟲(chóng)熒光素酶和海腎熒光素酶活性，報(bào)告基因活性結(jié)果以螢火蟲(chóng)/海腎相對(duì)值表示，所有試驗(yàn)均重復(fù)3次并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time PCR)

使用real-time PCR儀型號(hào)為ABI 7500。反應(yīng)體系為：Roche FastStart Universal SYBR Green Master（Rox）（2×）5 μL，上、下游引物（10 μmol·L-1）各0.2 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O 3.6 μL，總體積10 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 s，95℃變性5 s，60℃復(fù)性延伸34 s，共40個(gè)循環(huán)。溶解曲線95℃15 s，60℃10 min，95℃15 s，每個(gè)樣品設(shè)3孔重復(fù)。以NONO基因?yàn)閮?nèi)參，利用2-△△Ct方法將原始Ct值轉(zhuǎn)換為相對(duì)基因表達(dá)量。所用引物序列見(jiàn)表1。

1.7 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析采用Student's t-test，運(yùn)用SAS 9.2軟件完成，數(shù)據(jù)格式表示為（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）。統(tǒng)計(jì)分析P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1TP53INP1基因3'UTR生物信息學(xué)分析

雞TP53INP1基因（NM_001030946.1）的3'UTR長(zhǎng)度是4 008 bp。應(yīng)用UCSC數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)，雞、獼猴、鼠、狗、大象及熱帶爪蟾等TP53INP1基因3'UTR基因組序列存在同源性較高區(qū)域（見(jiàn)圖1），提示該區(qū)域可能是重要的TP53INP1表達(dá)調(diào)控元件。進(jìn)一步采用在線miRNA靶基因分析軟件Targetscan分析發(fā)現(xiàn)，雞TP53INP1基因mRNA的3'UTR存在miR-17-92基因簇成員miR-17-5p和miR-20a的潛在靶結(jié)合位點(diǎn)；比較分析顯示，TP53INP1基因3'UTR的這兩個(gè)潛在miRNA結(jié)合位點(diǎn)在各物種非常保守，這兩個(gè)miRNA種子區(qū)結(jié)合序列在雞、人、鼠、豬等動(dòng)物中完全相同（見(jiàn)圖2）。

圖1TP53INP1基因3'UTR的同源性分析Fig.1Homology analysis of TP53INP1 3'UTR

圖2 雞TP53INP1 3'UTR的miR-17-92基因簇miRNA成員結(jié)合區(qū)分析Fig.2Predicted miRNA binding sites of miR-17-92 cluster in chicken TP53INP1 3'UTR

2.2miR-17-92基因簇對(duì)TP53INP1的調(diào)節(jié)作用分析

為確定miR-17-92基因簇是否靶作用于TP53INP1上的3'UTR，構(gòu)建雞TP53INP1的3'UTR熒光素酶報(bào)告基因載體（psiCHECK2-TP53INP1）（見(jiàn)圖3），酶切測(cè)序正確無(wú)誤后，將miR-17-92基因簇pcDNA3.1-miR-17-92過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和psi-CHECK2-TP53INP1質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到DF1細(xì)胞，48 h后收細(xì)胞，使用熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)定螢火蟲(chóng)/海參熒光素酶相對(duì)活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與pcDNA3.1-control相比，pcDNA3.1-miR-17-92能極顯著抑制psiCHECK2-TP53INP1熒光素酶報(bào)告基因活性達(dá)5倍以上（P＜0.01）（見(jiàn)圖4）。這表明miR-17-92家族成員可能直接調(diào)控TP53INP1表達(dá)。

圖3psiCHECK2-TP53INP1載體雙酶切驗(yàn)證Fig.3Identification of psiCHECK2-TP53INP1 plasmid by double enzyme digestion with XhoⅠand NotⅠ

圖4miR-17-92基因簇對(duì)psiCHECK2-TP53INP1報(bào)告基因活性影響Fig.4Effect of miR-17-92 cluster overexpression on relative luciferase activity of psiCHECK2-TP53INP1

2.3miR-20a對(duì)TP53INP1的調(diào)節(jié)作用

生物信息學(xué)分析顯示，miR-17-92基因簇中miR-17-5p，miR-20a均靶作用于TP53INP1，為確定這兩個(gè)miRNA成員是否作用于TP53INP1，利用miR-17-5p和miR-20a的inhibitor與psiCHECK2-TP53 INP1共轉(zhuǎn)染到DF1細(xì)胞中，測(cè)定相對(duì)熒光活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與inhibitor NC相比，miR-17-5p inhibitor和miR-20a inhibitor均能提高報(bào)告基因活性，其中miR-20a達(dá)到顯著水平（P＜0.05）（見(jiàn)圖5），結(jié)果表明miR-20a可能靶作用于TP53INP1。

圖5 轉(zhuǎn)染miR-17-5p inhibitor和miR-20a inhibitor對(duì)psiCHECK2-TP53INP1報(bào)告基因活性影響Fig.5Effect of miR-17-5p inhibitor and miR-20a inhibitors on reporter activity of psiCHECK2-TP53INP1

為進(jìn)一步驗(yàn)證miR-17-5p和miR-20a是否靶作用于TP53INP1，使用miR-17-5p、miR-20a、miR-19a和miR-19b的inhibitor，轉(zhuǎn)染到DF1細(xì)胞中，以miRNA inhibitor NC作為陰性對(duì)照，24和48 h后使用real-time RT-PCR檢測(cè)TP53INP1在DF1細(xì)胞中的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與miRNA inhibitor NC相比，轉(zhuǎn)染miR-20a inhibitor顯著提高TP53INP1表達(dá)水平，而轉(zhuǎn)染miR-17-5p、miR-19a和miR-19b的inhibitor對(duì)TP53INP1的mRNA表達(dá)水平未發(fā)生顯著變化（P＞0.05）（見(jiàn)圖6）。此結(jié)果與報(bào)告基因分析結(jié)果一致，說(shuō)明在DF1細(xì)胞中雞miR-20a靶作用于TP53INP1。

采用同樣方法，分析miR-17-5p，miR-19a，miR-19b，miR-20a的inhibitor，對(duì)雞前脂肪細(xì)胞內(nèi)源性TP53INP1表達(dá)影響，結(jié)果與DF1細(xì)胞結(jié)果一致，轉(zhuǎn)染miR-20a的inhibitor顯著提高細(xì)胞TP53INP1表達(dá)水平（P＜0.05）。但轉(zhuǎn)染miR-17-5p、miR-19a和miR-19b的inhibitor后，未發(fā)現(xiàn)TP53INP1表達(dá)水平發(fā)生顯著變化（P＞0.05）（見(jiàn)圖7）。同樣也說(shuō)明在前脂肪細(xì)胞中只有miR-20a對(duì)TP53INP1表達(dá)有調(diào)控作用。

圖6 轉(zhuǎn)染miR-17-5p、miR-17-9a和miR-20a的inhibitor對(duì)DF1細(xì)胞中內(nèi)源性TP53INP1表達(dá)影響Fig.6Effect of miR-17-5p，miR-17-9a and miR-20a inhibitors on relative TP53INP1mRNA expression in DF1 cells

圖7 轉(zhuǎn)染miR-17-5p和miR-20a的inhibitor對(duì)雞前脂肪細(xì)胞中內(nèi)源性TP53INP1表達(dá)的影響Fig.7Effect of miR-17-5p and miR-20a inhibitors on relative TP53INP1 mRNA expression in ICPA cells

3 討論與結(jié)論

本研究采用生物信息學(xué)、報(bào)告基因技術(shù)證實(shí)TP53INP1是miR-17-92基因簇miR-20a的一個(gè)靶基因。miR-20a結(jié)合位點(diǎn)在人、鼠、雞等動(dòng)物TP53INP1基因3'UTR高度保守，推測(cè)TP53INP1是miR-17-92基因簇的重要保守靶基因。多個(gè)研究支持這一推測(cè)[6-14]。

TP53INP1具有抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用。在人體宮頸癌細(xì)胞研究中發(fā)現(xiàn)，miR-20a/ miR-17-5p靶作用于TP53INP1基因，促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖[13-15]；在人體胃癌研究中發(fā)現(xiàn)，miR-20a/ miR-17-5p靶作用于p21和TP53INP1，從而促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖[6]。農(nóng)業(yè)部雞遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室之前研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)miR-17-92基因簇促進(jìn)雞前脂肪細(xì)胞增殖，但機(jī)制仍不清楚。本研究證實(shí)，miR-17-92基因簇成員miR-20a靶作用于TP53INP1。考慮到miR-17-92基因簇靶基因眾多，推測(cè)miR-17-92基因簇可能至少部分通過(guò)抑制TP53INP1基因表達(dá)，從而促進(jìn)雞前脂肪細(xì)胞增殖。后續(xù)將以拯救試驗(yàn)確認(rèn)miR-20a是否作用于TP53INP1而促進(jìn)細(xì)胞增殖。

與人TP53INP1研究結(jié)果不同，發(fā)現(xiàn)雞miR-20a能靶向作用于TP53INP1，但miR-17-5p對(duì)TP53INP1并無(wú)明顯作用。雞miR-17-5p和miR-20a種子區(qū)相同，但miR-17-5p對(duì)雞TP53INP1無(wú)明顯作用，推測(cè)miRNA作為一個(gè)反式作用因子，在發(fā)揮調(diào)控時(shí)還需其他蛋白、非編碼RNA等參與，在不同細(xì)胞中其靶基因并不完全相同[16-17]。

TP53INP1基因是miR-20a的靶基因；抑制其表達(dá)，miR-17-92基因簇可能是通過(guò)靶向抑制TP53INP1表達(dá)，促進(jìn)雞脂肪細(xì)胞增殖。

[1]Ambros V.MicroRNA：Tiny regulators with great potential[J].Cell, 2001(7)：823-826.

[2]Wienholds E,Plasterk R H A.MicroRNA function in animal development[J].Febs Letters,2005,26：5911-5922.

[3]Alvarez-Garcia I,Miska E A.MicroRNA functions in animal development and human disease[J].Development,2005,21：4653-4662.

[4]Lai E C,Tomancak P,Williams R W,et al.Computational identification of Drosophila microRNA genes[J].Genome Biol,2003(7)：42.

[5]Lagos-Quintana M,Rauhut R,Meyer J,et al.New microRNAs from mouse and human[J].Rna-a Publication of the Rna Society, 2003(2)：175-179.

[6]Wang M,Gu H B,Qian H,et al.miR-17-5p/20a are important markers for gastric cancer and murine double minute 2 participates in their functional regulation[J].European Journal of Cancer,2013(8)：2010-2021.

[7]Ventura A,Young A G,Winslow M M,et al.Targeted deletion reveals essential and overlapping functions of the miR-17 similar to 92 family of miRNA clusters[J].Cell,2008(5)：875-886.

[8]Diosdado B,van de Wiel M,Droste J S T S,et al.MiR-17-92 cluster is associated with 13q gain and c-myc expression during colorectal adenoma to adenocarcinoma progression[J].British Journal of Cancer,2009(4)：707-714.

[9]Zhang C G,Zhu Q L,Zhou Y,et al.N-Succinyl-chitosan nanoparticles coupled with low-density lipoprotein for targeted ostholeloaded delivery to low-density lipoprotein receptor-rich tumors [J].International Journal of Nanomedicine,2014,9(1)：2919-2932.

[10]Hilton C,Neville M J,Karpe F.MicroRNAs in adipose tissue：Their role in adipogenesis and obesity[J].International Journal of Obesity,2013(3)：325-332.

[11]Yao J,Wang Y,Wang W,et al.Solexa sequencing analysis of chicken pre-adipocyte microRNAs[J].Biosci Biotechnol Biochem,2011(1)：54-61.

[12]Okamura S,Arakawa H,Tanaka T,et al.p53DINP1,a p53-inducible gene,regulates p53-dependent apoptosis[J].Mol Cell,2001 (1)：85-94.

[13]Tomasini R,Samir A A,Carrier A,et al.TP53INP1s and homeodomain-interacting protein kinase-2(HIPK2)are partners in regulating p53 activity[J].Journal of Biological Chemistry,2003, 39：37722-37729.

[14]Yan X H,Wang Z P,Wang N.Characterization of the structure, function and regulation of the chicken mir-17-92 cluster[J].Zoological Research,2012,33(5)：455-462.

[15]Tomasini R,Seux M,Nowak J,et al.TP53INP1 is a novel p73 target gene that induces cell cycle arrest and cell death by modulatingp73transcriptionalactivity[J].Oncogene,2005,55：8093-8104.

[16]Schober A,Nazari-Jahantigh M,Wei Y,et al.MicroRNA-126-5p promotes endothelial proliferation and limits atherosclerosis by suppressing Dlk1[J].Nat Med,2014(4)：368-376.

[17]Tan W Q,Li Y,Lim S G,et al.miR-106b-25/miR-17-92 clusters：Polycistrons with oncogenic roles in hepatocellular carcinoma [J].World Journal of Gastroenterology,2014,20：5962-5972.

Identification ofTP53INP1 as a targets gene of chicken miR-20a

The previous studies showed that overexpression of miR-17-92 cluster promoted the chicken preadipocyte proliferation,however,the underlying molecular mechanism remains unclear. Bioinformatics analysis found thatTP53INP1 was a potential target gene of miR-17-5p and miR-20a encoded by the miR-17-92 cluster.In the present study,we verified this bioinformatics analysis result using a luciferase reporter assay and miRNA overexpression and knockdown.The results showed that miR-17-92 cluster significantly decreasedTP53INP1 3?UTR luciferase reporter activity;transfection of miR-20a inhibitor significantly decreasedTP53INP1 3?UTR luciferase reporter activity.Real-time RT-PCR expression analysis showed that transfection of miR-20a inhibitor increased the endogenousTP53INP1 expression in DF1cells and immortalized chicken preadipocytes.Taken together,these data suggest thatTP53INP1 is a target gene of miR-20a.

chicken;miR-17-92 cluster;preadipocytes;TP53INP1;gene expression

S831；Q786

A

1005-9369（2015）09-0069-06

時(shí)間2015-9-23 9：38：13[URL]http：//www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20150923.0938.018.html

王寧,段逵,宋鶴,等.雞miR-20a靶基因TP53INP1鑒定[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2015,46(9):69-74.

Wang Ning,Duan Kui,Song He,et al.Identification ofTP53INP1 as a targets gene of chicken miR-20a[J].Journal of Northeast Agricultural University,2015,46(9):69-74.(in Chinese with English abstract)

2015-04-20

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31372299）；國(guó)家863課題（2011AA100301）

王寧（1964-），男，教授，博士，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)閯?dòng)物遺傳育種與繁殖。E-mail：wangning@neau.edu.cn

/WANGNing,DUAN Kui,SONG He,ZHANG Xiaofei,ZHANG Tianmu,ZHANG Wenjian,YAN Xiaohong, WANG Shouzhi,LI Hui

(Key Laboratory of Chicken Genetics and Breeding,Ministry of Agriculture, School ofAnimal Sciences and Technology,NortheastAgricultural University,Harbin 150030,China)