周東興，徐明明，遲婷婷，王維晨，王兵，劉佳斌，寧玉翠

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，哈爾濱150030）

蚯蚓糞中異養(yǎng)脫硫菌篩選及效果測定

周東興，徐明明，遲婷婷，王維晨，王兵，劉佳斌，寧玉翠

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，哈爾濱150030）

利用初篩和復(fù)篩結(jié)合方法從蚯蚓糞中篩選出六株高效異養(yǎng)脫硫菌種S2、S3、S5、S6、S7、S10。經(jīng)硫化氫降解率測試結(jié)果表明，培養(yǎng)25 d，與CK相比H2S釋放量分別降低44.50%、53.48%、37.99%、16.41%、30.67%、41.14%。將不同菌株復(fù)配，其中S2+S3+S5、S2+S3+S7菌種組合H2S釋放量最低，較對照降低71.53%、65.01%。表明脫硫菌有效降低H2S釋放量，三個菌株復(fù)合除臭效果好于單個菌株，可為生物脫硫法研究提供理論依據(jù)。

蚯蚓糞；硫化氫；生物除臭

惡臭是當(dāng)今世界七種典型公害（大氣污染、水質(zhì)污染、土壤污染、噪聲污染、振動、地面下沉、惡臭）之一[1]，已引起廣泛關(guān)注。其中硫化氫是典型的惡臭氣體代表。硫化氫是強烈的神經(jīng)毒物，對粘膜有強烈刺激作用，高濃度時可直接抑制呼吸中樞引起迅速窒息致死[2-5]。

生物脫硫法具有處理效率高、可降解復(fù)雜成分的惡臭氣體、無二次污染等優(yōu)點[6-7]。在水、微生物和氧存在條件下，利用微生物代謝作用氧化分解發(fā)臭物質(zhì)，達(dá)到凈化氣體目的[8-9]。生物除臭法在微生物作用下進(jìn)行，高效除臭微生物分離與篩選有助于生物除臭技術(shù)發(fā)展。Maestre等研究已發(fā)現(xiàn)多株自養(yǎng)型和異養(yǎng)型脫硫菌，自養(yǎng)脫硫菌中的硫桿菌屬、無色硫細(xì)菌和光合細(xì)菌等應(yīng)用較為常見[10-12]；異養(yǎng)脫硫菌則種類繁多。梁美生等對各菌種脫硫能力測定結(jié)果表明，異養(yǎng)菌生長速度快、周期短，對于含量較低的硫化物降解效果較好；自養(yǎng)菌生長周期長，脫硫作用緩慢，去除效率低。短時間內(nèi)異養(yǎng)菌脫硫能力高于自養(yǎng)菌，適合大量培養(yǎng)[13]。蚯蚓糞因其天然的疏松多孔結(jié)構(gòu)具有吸附臭氣作用。王樹乾等研究表明，蚯蚓糞中含有大量微生物，能夠通過自身代謝作用將惡臭物質(zhì)生物降解[14]。近年來，我國對蚯蚓糞的農(nóng)業(yè)利用研究較多，而蚯蚓糞中除臭微生物的篩選鮮見報道[15]。本試驗利用蚯蚓糞除臭特性，篩選高效脫硫菌株，將得到菌種復(fù)配，對復(fù)合菌株對硫化氫的降解能力進(jìn)行測試，在去除惡臭污染同時，實現(xiàn)“以廢治廢”的目的，為生物脫硫法研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種來源

用于分離篩選菌種的試驗材料為蚯蚓處理城市污泥得到的蚯蚓糞。

1.2 培養(yǎng)基

脫硫菌選擇培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏2 g，NaCl 5 g，Na2S 2 g，蒸餾水1 L，pH 6.5～7.5。加入瓊脂溶化后制成固體培養(yǎng)基[13]。本試驗所用培養(yǎng)基均在上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠生產(chǎn)的立式壓力蒸汽滅菌器中完成滅菌。

1.3 菌種富集馴化

取10 g新鮮蚯蚓糞于100 mL三角瓶中，放入直徑2 mm玻璃珠5顆，用于分散細(xì)胞，加入90 mL無菌水，震蕩30 min制成菌懸液。將10 mL菌懸液加入100 mL液體選擇培養(yǎng)基中，30℃、120 r·min-1培養(yǎng)5 d后，移取10 mL到新的100 mL選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d，如此每隔5 d轉(zhuǎn)到新的培養(yǎng)基，連續(xù)馴化30 d，得到富集菌液。

1.4 分離純化

取1 mL富集菌液作梯度稀釋，將10-4、10-5、10-6菌液0.1 mL分別接種到脫硫菌固體選擇培養(yǎng)基平板上，每個梯度3次重復(fù)，于30℃倒置培養(yǎng)5 d。選取單個菌落反復(fù)劃線純化，直至顯微鏡下觀察無雜菌得到純菌株。將所有分離得到的菌種接入液體選擇培養(yǎng)基中，30℃、120 r·min-1培養(yǎng)3 d制成菌液[16]。

1.5 菌種篩選

初篩：將5 mL菌液接入裝有50 g新鮮雞糞的1 000 mL廣口瓶中，同時接種5 mL無菌水作為對照，雙層塑料膜密封。置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔3、5、8、11、15 d用感官法初步判定菌株除臭效果，將除臭能力明顯的菌株進(jìn)行復(fù)篩試驗[17]。

復(fù)篩：將50 g新鮮雞糞加入1 000 mL廣口瓶中，接種5 mL純化得到菌液，每個菌種3次重復(fù)，同時接種5 mL無菌水作為對照。在每個廣口瓶中放一個盛有20 mL堿性鋅氨絡(luò)鹽吸收液的50 mL小燒杯（用于吸收H2S氣體）。廣口瓶蓋蓋后用雙層塑料膜密封。置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔3、5、8、11、15、20、25 d檢測H2S釋放量。選出H2S釋放量較少的菌種用于后續(xù)研究。

1.6 脫硫性能分析方法

H2S檢測：堿性鋅氨絡(luò)鹽吸收——亞甲基藍(lán)比色法[18]；

SO42-測定：鉻酸鋇分光光度法[19]。

1.7 菌種拮抗試驗

將復(fù)篩得到的菌種兩兩交叉劃線，30℃培養(yǎng)3 d，觀察交叉處菌落生長情況，是否有拮抗現(xiàn)象。

1.8 菌種鑒定

利用光學(xué)顯微鏡鑒定菌落形態(tài)，根據(jù)文獻(xiàn)[20-21]進(jìn)行生理生化鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 初篩結(jié)果

表1表明，分離篩選出的菌株除臭效果有所不同，與對照相比，基本上均具有除臭作用，14株菌株中S2、S3、S5、S6、S7、S10具有較好除臭效果。

2.2 復(fù)篩結(jié)果

將初篩得到的菌種復(fù)篩，結(jié)果見圖1。

H2S釋放量在前11 d一直呈現(xiàn)上升趨勢，第11天時達(dá)到最高峰，之后呈現(xiàn)下降趨勢，第25天接種S2、S3、S10、S7處理中硫化氫釋放量已比較低。H2S釋放量從高到低依次為CK、S6、S7、S5、S10、S2、S3，與CK相比H2S釋放量分別降低16.40%、30.67%、37.99%、41.14%、44.50%、53.48%。

復(fù)篩試驗驗證前初篩試驗結(jié)果可靠性，同時也說明感官評價局限性，因為菌種S10在初篩試驗中表現(xiàn)出與菌種S3同樣除臭效果，而化學(xué)檢測H2S含量卻相對較高，未能達(dá)到理想效果。推測原因是臭氣成分較復(fù)雜，感官評價結(jié)果不精確。

2.3 脫硫產(chǎn)物測定

對復(fù)篩菌種菌液進(jìn)行脫硫產(chǎn)物測定，結(jié)果如圖2所示。

相關(guān)研究表明，還原態(tài)無機(jī)硫在培養(yǎng)液中的微生物作用，氧化最終生成硫酸根離子[22]，因此脫硫液中硫酸根離子增量也能間接反映脫硫菌脫硫效率。經(jīng)20 h培養(yǎng)，脫硫液中SO42-離子產(chǎn)生量從低到高依次為CK、S6、S7、S10、S5、S2、S3，與脫硫菌脫硫效率基本一致，由此可見，脫硫菌作用下S2-主要被氧化成SO42-。

表1 菌種初篩試驗結(jié)果(接種15 d)Table 1Result of preliminary screening of strains(Inoculant 15 d)

圖1 不同菌株對H2S釋放的影響Fig.1Effect of different strains on H2S emission

圖2 不同菌液中SO42-含量Fig.2Effect of SO42-incremental concentration in nutrient solution for different strain

2.4 菌種拮抗試驗

將復(fù)篩得到菌種進(jìn)行交叉劃線試驗，結(jié)果表明，各菌種在交叉處生長良好，均無拮抗現(xiàn)象。

2.5 不同菌株復(fù)配對H2S釋放量影響

將互不拮抗的菌株復(fù)配，結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同菌株復(fù)配對H2S釋放量影響Fig.3Effect of complex formulation of different strains on H2S emission

組合1、4、2復(fù)配去除H2S效果較好，總釋放量較對照分別降低71.53%、65.01%、53.01%。組合6菌種復(fù)配雖然使H2S降解率達(dá)到49.73%，但最后H2S釋放量仍然相對較高，組合3、組合5雖彼此無拮抗作用，但菌種復(fù)配效果不佳。

2.6 菌株鑒定

由表2可知，菌株初鑒定，S2為芽孢桿菌屬，S3為黃單胞菌屬，S5為假單胞菌屬。

表2 菌株形態(tài)及生理生化鑒定Table 2Individual colony and physiological and chemical characteristics of strains

3 討論

蚯蚓糞具有高孔隙度和比表面積，是臭氣高效吸附劑，蚯蚓糞中含大量微生物，對臭氣物質(zhì)具有良好吸收凈化功能[23]。早在1978年日本研制蚯蚓糞粒除臭小型裝置，經(jīng)污水廠實際應(yīng)用證實蚯蚓糞粒除臭作用，并命名為“蚯蚓糞粒除臭劑”[24]。韓立軍等研究報道，蚯蚓糞中所含微生物可促進(jìn)臭氣中NH3、H2S分解，隨蚯蚓糞添加量增加去除效果提高[25]。用蚯蚓糞作為墊料，可有效改善肉雞舍環(huán)境條件，使肉雞舍內(nèi)NH3、H2S含量明顯降低[26]。尚麗勤將篩選出的互補拮抗除臭微生物進(jìn)行菌種復(fù)配，脫硫復(fù)合菌株使得H2S平均釋放量與CK相比釋放量降低46.26%[27]。

本研究從蚯蚓糞中篩選出具有脫硫效果異養(yǎng)除臭菌。將篩選菌種復(fù)配，使H2S降解率比對照降低71.53%。與其他除臭微生物研究相比，在材料選擇方面，蚯蚓糞具有原料豐富、成本低的優(yōu)點；在菌株篩選方面，異養(yǎng)脫硫菌與自養(yǎng)脫硫菌相比具有生長周期短、繁殖快、效率高等優(yōu)點，更適用于H2S微生物降解；在脫硫效果方面，三株脫硫菌組成的復(fù)合菌株脫硫效果均高于單菌株，使H2S降解率達(dá)到71.53%。

4 結(jié)論

a.篩選得到六株脫硫效果較好的菌種S3、S2、S10、S5、S7、S6，使H2S釋放量與CK相比分別降低53.48%、44.50%、41.14%、37.99%、30.67%、16.41%。

b.S2、S3與S5組合效果最好，與對照相比H2S降解率達(dá)到71.53%。

c.經(jīng)初步鑒定S2為芽孢桿菌屬，S3為黃單胞菌屬，S5為假單胞菌屬。

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Screening and effect testing of heterotrophic degrading hydrogensulfide bacteria of earthworm cast/

ZHOU Dongxing,XU Mingming,CHI Tingting, WANG Weichen,WANG Bing,LIU Jiabin,NING Yucui
(School of Resources and Environmental Sciences,NortheastAgricultural University,Harbin 150030,China)

Six strains of high-efficiency heterotrophic degrading hydrogen sulfide bacteria S2,S3,S5, S6,S7,S10 were isolated by combing preliminary screening and secondary screening from earthworm cast. The results showed that hydrogen sulfide degradation rate testing indicated:they could decrease H2S emission by 44.50%,53.48%,37.99%,16.41%,30.67%and 41.14%compared with the control group in 25 days.Composited strains of S2+S3+S5 and S2+S3+S7 performed a good effect,decreased H2S emission by 71.53%and 65.01%.It showed that degrading hydrogen sulfide strains could decrease H2S emission effectively,the desulfurization of three strains complex formulation was better than single strain of degrading hydrogen sulfide.The results above provided reference for biological deodorization researching.

earthworm cast;hydrogen sulfide;biological deodorization

S767.5

A

1005-9369（2015）09-0059-05

時間2015-9-23 9：38：08[URL]http：//www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20150923.0938.006.html

周東興,徐明明,遲婷婷,等.蚯蚓糞中異養(yǎng)脫硫菌篩選及效果測定[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2015,46(9):59-63.

Zhou Dongxing,Xu Mingming,Chi Tingting,et al.Screening and effect testing of heterotrophic degrading hydrogen sulfide bacteria of earthworm cast[J].Journal of Northeast Agricultural University,2015,46(9):59-63.(in Chinese with English abstract)

2014-10-17

科技部科技成果轉(zhuǎn)化項目（2013GB2B200134）；黑龍江省重大攻關(guān)項目（GA11B501）

周東興（1972-），男，教授，博士，博士生導(dǎo)師，研究方向為廢棄物資源化利用。E-mail：zhboshi@163.com