陳鷗 王建軍

周圍神經(jīng)缺損是臨床常見的致殘性疾病，其常用治療方法是自體神經(jīng)移植［1］。但自體神經(jīng)移植存在一些局限性，包括供區(qū)功能障礙、感覺缺失、神經(jīng)瘤形成以及長距離神經(jīng)缺損時自體神經(jīng)來源有限［2-3］。為克服這些缺點(diǎn)，研究者開始關(guān)注異體神經(jīng)移植。但是，異體神經(jīng)移植需要面臨排斥反應(yīng)的問題。Hudson 等［4］用化學(xué)去細(xì)胞神經(jīng)治療大鼠坐骨神經(jīng)缺損，未發(fā)生強(qiáng)烈的排斥反應(yīng)，但這種方法的治療效果與自體神經(jīng)移植比較仍有較大的差距，主要原因在于修復(fù)過程中缺少促進(jìn)神經(jīng)生長的細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子，比如雪旺細(xì)胞、神經(jīng)生長因子等。近年來，很多研究利用去細(xì)胞神經(jīng)和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSCs)、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞及它們誘導(dǎo)分化的雪旺細(xì)胞等種子細(xì)胞共同移植修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)缺損，并取 得 了 一 定 的 進(jìn) 展［5-7］。如Wang 等［8］通 過BMSCs 和去細(xì)胞神經(jīng)聯(lián)合移植治療大鼠坐骨神經(jīng)缺損，取得了優(yōu)于單純使用去細(xì)胞神經(jīng)的效果。體外研究中發(fā)現(xiàn)，BMSCs 和T 細(xì)胞共培養(yǎng)后，可以促進(jìn)調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的分泌和成熟［9-10］。但在利用去細(xì)胞神經(jīng)移植治療神經(jīng)缺損的過程中，聯(lián)合移植BMSCs 對T 細(xì)胞亞群有何影響還少有報(bào)道。因此，本研究旨在觀察BMSCs 和去細(xì)胞神經(jīng)聯(lián)合移植修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)缺損的過程中，大鼠外周血T 細(xì)胞亞群的變化，從而確定BMSCs 在此過程中的免疫調(diào)節(jié)作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

選擇健康雄性SD 大鼠15 只及雄性Wistar 大鼠15 只，體質(zhì)量均為150 ～200 g，月齡均為2 個月(均購自溫州醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心)。SD 大鼠作為受體，用于制作坐骨神經(jīng)缺損動物模型及分離雪旺細(xì)胞。Wsitar 大鼠作為供體，用于提供去細(xì)胞神經(jīng)。所有實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)溫州醫(yī)學(xué)院動物倫理委員會批準(zhǔn)通過。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 制備去細(xì)胞神經(jīng)

取15 只Wistar 大鼠，10%水合氯醛(上海碧云天公司)腹腔注射麻醉(0.4 mL/100 g)，無菌條件下切取約2.0 cm 長的右側(cè)坐骨神經(jīng)共15 條。參照Hudson 等［4］的方法，使用蒸餾水、sulfobetaine-10、sulfobetaine-16 和Triton-200(均購自上海碧云天公司)等依次浸泡萃取，以獲取去細(xì)胞神經(jīng)。

1.2.2 坐骨神經(jīng)缺損模型的建立及雪旺細(xì)胞的分離培養(yǎng)

SD 大鼠常規(guī)消毒后手術(shù)切取1.5 cm 長的坐骨神經(jīng)一段，斷端回縮后造成2.0 cm 坐骨神經(jīng)缺損。同時采用Lao 等［11］的方法分離培養(yǎng)大鼠雪旺細(xì)胞，將上述切取的坐骨神經(jīng)放入含10%胎牛血清(美國Hyclone 公司)的DMEM/F12 培養(yǎng)基(美國Gibco 公司)。清除神經(jīng)外膜及周圍神經(jīng)結(jié)締組織，仔細(xì)地將神經(jīng)分成單束并剪碎，放入含有0.25%胰蛋白酶和0.03%膠原蛋白酶(美國Sigma 公司)的2 mL PBS 中。37 ℃消化60 min 后，加入DMEM/F12 培養(yǎng)基終止消化，并用200 目篩網(wǎng)過濾。濾出液1 000 ×g離心5 min，即得細(xì)胞沉淀，加入DMEM/F12 培養(yǎng)基重懸浮后，將所得細(xì)胞以1 ×104個/mL密度種入培養(yǎng)瓶中，常規(guī)培養(yǎng)并通過免疫方法鑒定是否為雪旺細(xì)胞。

1.2.3 去細(xì)胞神經(jīng)的細(xì)胞植入

將鑒定成功的雪旺細(xì)胞及大鼠BMSCs(廣州賽業(yè)生物有限公司)傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)3 代后，用0.25%胰蛋白酶消化后制成密度為1.0 ×107/mL 的雪旺細(xì)胞，以備植入。如需同時植入雪旺細(xì)胞和BMSCs，則將兩種細(xì)胞按等比例混合后制成混合細(xì)胞懸液。用25 μL 微量注射器，每隔0.4 mm 向去細(xì)胞神經(jīng)注射2 μL 細(xì)胞懸液，將相應(yīng)細(xì)胞植入。處理好的去細(xì)胞神經(jīng)置于含15%胎牛血清和1%青鏈霉素的DMEM/F12 培養(yǎng)基中過夜。

1.2.4 分組和坐骨神經(jīng)修復(fù)方案

將15 只坐骨神經(jīng)缺損的SD 大鼠隨機(jī)分為3 組，每組5 只。去細(xì)胞神經(jīng)組，僅采取單純?nèi)ゼ?xì)胞神經(jīng)移植修復(fù)缺損;去細(xì)胞神經(jīng)+雪旺細(xì)胞組，采用植入雪旺細(xì)胞的去細(xì)胞神經(jīng)移植修復(fù)缺損;去細(xì)胞神經(jīng)+雪旺細(xì)胞+BMSCs 組，采用同時植入雪旺細(xì)胞和BMSCs 的去細(xì)胞神經(jīng)移植修復(fù)缺損。去細(xì)胞神經(jīng)的植入方法為使用8-0 普羅靈縫線端端吻合去細(xì)胞神經(jīng)的兩端與受體SD 大鼠坐骨神經(jīng)的2 個斷端。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞比例

分別在移植前和移植后3、7、14 d 4 個時間點(diǎn)采集受體SD 大鼠尾靜脈血50 μL，用淋巴細(xì)胞分離液(美國eBioscience 公司)分離出外周血單個核細(xì)胞。加入CD4-FITC 抗體(美國eBioscience 公司)2 μL及CD25-PE 抗體(美國eBioscience 公司)2 μL，4 ℃避光孵育30 min，用預(yù)冷PBS 溶液洗滌細(xì)胞，1 000 ×g 離心5 min，去上清液。加入專用破膜固定液(美國eBioscience 公司)1 mL，置于4 ℃冰箱避光孵育30 min，1 000×g 離心5 min，去上清液。加入專用緩沖液(美國eBioscience 公司)1 mL，1 000 ×g 離心5 min，去上清液。加入Foxp3 抗體(美國eBioscience公司)2 mL，輕輕震蕩搖勻后置于4 ℃避光孵育30 min。加入專用Buffer 緩沖液(美國eBioscience公司)1 mL，1 000 ×g 離心5 min，去上清液。加入PBS 緩沖液400 μL 重懸浮細(xì)胞，震蕩后進(jìn)行流式細(xì)胞儀(FACSCalibur，美國BD 公司)檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SSPS 16.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較、同組內(nèi)多個時間點(diǎn)兩兩比較均采用LSD-t 檢驗(yàn)。P ＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

如表1 ～3 所示，移植前去細(xì)胞神經(jīng)組、去細(xì)胞神經(jīng)+雪旺細(xì)胞組及去細(xì)胞神經(jīng)+雪旺細(xì)胞+BMSCs 組受體SD 大鼠CD4+、CD25+及CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞比例差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P 均＞0.05)。移植后，各組3 種T 細(xì)胞比例均呈逐漸上升趨勢，移植后14 d 達(dá)到峰值，與移植前、移植后3 d 及移植后7 d 相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P 均＜0.05)。移植后14 d，去細(xì)胞神經(jīng)組CD4+、CD25+及CD4+CD25+Foxp3+T 細(xì)胞比例分別為(39.9±1.9)%、(9.15 ±0.17)%及(2.37 ±0.09)%;去細(xì)胞神經(jīng)+雪旺細(xì)胞組CD4+、CD25+及CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞比例分別為(41.0 ±1.7)%、(10.11 ±0.15)%及(2.47 ±0. 05)%;去細(xì)胞神經(jīng)+ 雪旺細(xì)胞組+BMSCs 組CD4+、CD25+及CD4+CD25+Foxp3+T 細(xì)胞比例分別為(38.1 ±1.6)%、(8.19 ±0.13)%及(2.79 ±0.12)%，可見移植后14 d 去細(xì)胞神經(jīng)+雪旺細(xì)胞+BMSCs 組的CD4+及CD25+T 細(xì)胞比例均低于去細(xì)胞神經(jīng)組和去細(xì)胞神經(jīng)+ 雪旺細(xì)胞組(P 均＜0.05)，而CD4+CD25+Foxp3+T 細(xì)胞比例高于去細(xì)胞神經(jīng)組和去細(xì)胞神經(jīng)+ 雪旺細(xì)胞組(P ＜0.05)。

表1 采用不同坐骨神經(jīng)修復(fù)方案的三組受體大鼠去細(xì)胞神經(jīng)移植前后CD4 + T 細(xì)胞比例

表1 采用不同坐骨神經(jīng)修復(fù)方案的三組受體大鼠去細(xì)胞神經(jīng)移植前后CD4 + T 細(xì)胞比例

注:與移植前相比，aP ＜0.05;與移植后3 d 相比，bP ＜0.05;與移植后7 d 相比，cP ＜0.05;與去細(xì)胞神經(jīng)組相比，dP ＜0.05;與去細(xì)胞神經(jīng)+雪旺細(xì)胞組相比，eP ＜0.05

表2 采用不同坐骨神經(jīng)修復(fù)方案的三組受體大鼠去細(xì)胞神經(jīng)移植前后CD25 + T 細(xì)胞比例

表2 采用不同坐骨神經(jīng)修復(fù)方案的三組受體大鼠去細(xì)胞神經(jīng)移植前后CD25 + T 細(xì)胞比例

注:與移植前相比，aP ＜0.05;與移植后3 d 相比，bP ＜0.05;與移植后7 d 相比，cP ＜0.05;與去細(xì)胞神經(jīng)組相比，dP ＜0.05;與去細(xì)胞神經(jīng)+雪旺細(xì)胞組相比，eP ＜0.05

表3 采用不同坐骨神經(jīng)修復(fù)方案的三組受體大鼠去細(xì)胞神經(jīng)移植前后CD4 +CD25 +Foxp3 + T 細(xì)胞比例

表3 采用不同坐骨神經(jīng)修復(fù)方案的三組受體大鼠去細(xì)胞神經(jīng)移植前后CD4 +CD25 +Foxp3 + T 細(xì)胞比例

注:與移植前相比，aP ＜0.05;與移植后3 d 相比，bP ＜0.05;與移植后7 d 相比，cP ＜0.05;與去細(xì)胞神經(jīng)組相比，dP ＜0.05;與去細(xì)胞神經(jīng)+雪旺細(xì)胞組相比，eP ＜0.05

3 討 論

化學(xué)萃取去細(xì)胞神經(jīng)免疫原性較低，是目前實(shí)驗(yàn)研究應(yīng)用較多的組織工程學(xué)神經(jīng)支架，但是化學(xué)萃取去細(xì)胞神經(jīng)支架單獨(dú)用于修復(fù)周圍神經(jīng)缺損的效果較自體神經(jīng)仍有不足，因此在化學(xué)去細(xì)胞神經(jīng)中種植種子細(xì)胞，共同促進(jìn)周圍神經(jīng)再生，成為了研究熱點(diǎn)。目前，大多數(shù)研究為向去細(xì)胞神經(jīng)中種植自體雪旺細(xì)胞。雪旺細(xì)胞是神經(jīng)細(xì)胞周圍的重要組成細(xì)胞，對于神經(jīng)細(xì)胞(包括胞體、軸突及樹突)再生有重要作用。研究認(rèn)為自體雪旺細(xì)胞植入異體去細(xì)胞神經(jīng)橋接物修神經(jīng)缺損有利于早期軸突再生及再生軸突數(shù)量的增加［12］。但是利用自體組織分離培養(yǎng)出種子細(xì)胞及其衍生細(xì)胞會造成供區(qū)的組織損傷，且來源有限。而利用異體組織分離培養(yǎng)種子細(xì)胞及其衍生細(xì)胞雖來源充足且廣泛，但無法消除抗原性，可能引發(fā)神經(jīng)移植后免疫排斥反應(yīng);而應(yīng)用免疫抑制劑又存在引起各種全身性并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)。

神經(jīng)移植后的免疫排斥反應(yīng)主要由T 細(xì)胞介導(dǎo)。T 細(xì)胞按照功能可分為輔助性T 細(xì)胞、效應(yīng)性T 細(xì)胞以及調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞。CD4+T 細(xì)胞是具有細(xì)胞免疫功能的效應(yīng)性T 細(xì)胞，CD25+T 細(xì)胞為活化的CD4+T 細(xì)胞，二者均代表免疫激活狀態(tài)，反映免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生。CD4+CD25+Foxp3+T 細(xì)胞是調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞，是T 淋巴細(xì)胞中唯一起負(fù)性免疫調(diào)節(jié)作用的亞群［13-14］，但其調(diào)節(jié)機(jī)制尚不完全明確。目前認(rèn)為可能和以下途徑有關(guān):(1)細(xì)胞接觸途徑，通過細(xì)胞表面膜分子CTLA-4 和TGF-β 與效應(yīng)性T 細(xì)胞相應(yīng)配體結(jié)合，抑制效應(yīng)性T 細(xì)胞分泌IL-2;(2)通過分泌TGF-β 等抑制性細(xì)胞因子，發(fā)揮負(fù)性免疫調(diào)節(jié)作用;(3)通過下調(diào)抗原提呈物質(zhì)如MHC-Ⅰ，MHC-Ⅱ等，間接發(fā)揮負(fù)性免疫調(diào)節(jié)作用;(4)通過分泌顆粒蛋白酶B 和穿孔素導(dǎo)致NK 細(xì)胞和CD8+T 細(xì)胞的凋亡［15-18］。

綜上所述，在向去細(xì)胞神經(jīng)植入雪旺細(xì)胞的同時，如能同時植入調(diào)節(jié)T 細(xì)胞免疫的種子細(xì)胞，則可能減輕或解決神經(jīng)移植后的免疫排斥反應(yīng)問題。BMSCs 是由骨髓中分離培養(yǎng)的干細(xì)胞，能多向分化為多種細(xì)胞。由于BMSCs 表面不表達(dá)或者低表達(dá)MHC-Ⅱ，因此在自體移植時免疫原性較低［19］。近年來，English 等［20］研究發(fā)現(xiàn)將BMSCs 和CD4+T 細(xì)胞共培養(yǎng)后，CD4+T 細(xì)胞Foxp3 表達(dá)升高，將CD4+T細(xì)胞重新純化分離培養(yǎng)后，其Foxp3 表達(dá)下降，這意味著BMSCs 可能具有增加調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞比例的作用。現(xiàn)已有研究在去細(xì)胞神經(jīng)移植修復(fù)坐骨神經(jīng)的過程中應(yīng)用BMSCs，并且發(fā)現(xiàn)同時植入BMSCs，神經(jīng)修復(fù)的效果更佳［21］，但其機(jī)制僅涉及BMSCs 的營養(yǎng)因子提供功能，并未涉及免疫調(diào)節(jié)功能。實(shí)際上，關(guān)于BMSCs 植入在神經(jīng)修復(fù)過程中是否發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，還少有報(bào)道。本研究中，接受神經(jīng)移植后，各組受體SD 大鼠的CD4+、CD25+及CD4+CD25+Foxp3+T 細(xì)胞比例呈增高趨勢，提示移植物具有一定的免疫原性，引起了免疫激活。去細(xì)胞神經(jīng)+雪旺細(xì)胞+BMSCs 組CD4+及CD25+T 細(xì)胞的比例最低，但CD4+CD25+Foxp3+T 細(xì)胞的比例最高，因此，我們認(rèn)為在神經(jīng)移植過程中，BMSCs 具有增強(qiáng)免疫耐受的作用，其機(jī)制為BMSCs 增加調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞比例從而抑制免疫活性。

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