李洪辛,姜洪彬,劉姝男,狄良嬌,洪鐵

(吉林大學 藥學院 藥理研究室,吉林 長春 130021)

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綠原酸對小鼠變應(yīng)性鼻炎的作用及其機制研究

李洪辛,姜洪彬,劉姝男,狄良嬌,洪鐵Δ

(吉林大學 藥學院 藥理研究室,吉林 長春 130021)

目的 研究綠原酸對小鼠變應(yīng)性鼻炎的治療作用及其機制。方法 采用腹腔注射抗原佐劑混懸液對小鼠進行全身致敏，以10%卵清蛋白(ovalbumin,OVA)生理鹽水溶液滴鼻進行局部攻擊，建立小鼠變應(yīng)性鼻炎模型。局部攻擊前30 min連續(xù)10 d給予不同劑量的綠原酸(50、100、200 mg/kg)，觀察其對變應(yīng)性鼻炎模型小鼠行為學、小鼠鼻腔灌洗液細胞因子含量、血清組胺、IgE及細胞因子含量的影響。結(jié)果 綠原酸可減少小鼠噴嚏及抓鼻次數(shù)，減少小鼠鼻腔分泌物量，明顯降低AR小鼠的脾臟指數(shù)，增加胸腺指數(shù)，增加小鼠鼻腔灌洗液IFN-γ的含量，降低小鼠鼻腔灌洗液IL-4的含量，顯著降低AR小鼠血清組胺、IgE、IL-4、IL-5和IL-10的含量，增加IFN-γ的含量，升高IFN-γ/ IL-4的值，下調(diào)AR小鼠鼻黏膜組織IL-4、IL-5和IL-10的mRNA的表達，上調(diào)IFN-γ mRNA的表達。結(jié)論 綠原酸對OVA誘導的變應(yīng)性鼻炎具有治療作用，其作用機制可能與調(diào)節(jié)Th1與Th2細胞平衡有關(guān)。

綠原酸；變應(yīng)性鼻炎；組胺；IgE；細胞因子

變應(yīng)性鼻炎(allergic rhinitis，AR)又稱過敏性鼻炎，是易感個體接觸變應(yīng)原后，導致的以免疫球蛋白E(immunoglobulin E，IgE)介導為開端，伴隨炎癥介質(zhì)的釋放及多種免疫活性細胞和細胞因子參與的鼻粘膜慢性炎癥性疾病。AR也是耳鼻喉科常見病、多發(fā)病，臨床表現(xiàn)為流涕、鼻癢、鼻塞和噴嚏等，并可誘發(fā)哮喘、結(jié)膜炎、咽炎和中耳炎等疾病[1-2]，嚴重影響患者生活質(zhì)量[3]。流行病學研究表明AR在全世界范圍內(nèi)的發(fā)病區(qū)域分布廣泛，且發(fā)病率呈逐漸增加的趨勢，尤其以工業(yè)化國家更為顯著[4]。

目前，AR動物模型的建立主要通過變應(yīng)原的全身基礎(chǔ)致敏和局部激發(fā)致敏。常用的致敏原包括卵清蛋白、甲苯-2,4二異氰酸酯(TDI)、真菌、花粉等[5]。其中以卵清蛋白(ovalbumin, OVA)最為常用,它不僅具有重復性強、動物存活率高的特點,而且其臨床癥狀和病理改變均與人類過敏性鼻炎相似，該動物模型為研究AR的主要模型。

綠原酸(chlorogenic acid)亦稱咖啡鞣酸，廣泛存在于金銀花等忍冬科植物中。研究表明綠原酸對新城疫病毒、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的增殖活性具有抑制作用[6-7]，能夠降低血清和肝臟組織中膽固醇的含量，對心血管疾病具有保護作用[8]。同時還證實了綠原酸對免疫系統(tǒng)具有調(diào)節(jié)功能[9]，對透明質(zhì)酸酶具有抑制作用，抗炎作用明顯[10]。但是綠原酸對于過敏性疾病的治療未見報道，本文旨在對綠原酸經(jīng)OVA誘導的AR小鼠的藥效和作用機制進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 清潔級雌性BALB/c小鼠60只，體質(zhì)量18～22 g，由吉林大學動物實驗中心提供。動物批號：SCXK(吉)-2011-0003。

1.1.2 試劑與藥物 OVA(99M10230，Sigma分裝，純度>90%)。Al(OH)3，(天津市光復精細化工研究所生產(chǎn))。氯雷他定片(loratadine，規(guī)格10 mg/片，上海先靈葆雅制藥有限公司生產(chǎn)，國藥準字H20020561)。綠原酸(上海源葉生物科技公司提供，批號：RA0426FA14，純度為99%)。

小鼠IgE試劑盒(SX01002)、小鼠IL-4試劑盒(SXR030)、小鼠IFN-γ試劑盒(SXB001)、小鼠IL-5試劑盒、小鼠IL-10試劑盒購于上海森雄科技實業(yè)有限公司。

1.1.3 儀器 臺式離心機(TG1-16B，上海安亭科學儀器廠)；酶標儀(Model 680，美國伯樂公司)；電子天平(BS124S，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 造模方法：參照劉建文[11]方法，每只小鼠每次腹腔注射抗原佐劑混懸液0.1 mL[含OVA 50 μg，Al(OH)35 mg]，隔天1次，共7次，正常組以等量Al(OH)3及生理鹽水代替。全身致敏結(jié)束后，用10% OVA生理鹽水溶液滴鼻進行局部攻擊，每側(cè)鼻孔各10 μL，每天1次，共10次，正常組以等量生理鹽水代替。

1.2.2 分組給藥：將60只小鼠隨機分為6組，分別為正常對照組、模型組、陽性對照組、綠原酸低劑量組、綠原酸中劑量組、綠原酸高劑量組。綠原酸低、中、高劑量組分別以50、100、200 mg/kg灌胃，陽性對照組以氯雷他定85 mg/kg灌胃給藥，給藥濃度為20 mL/kg，正常對照組以等體積的蒸餾水代替藥物。給藥30 min后，以上各組均給予10% OVA生理鹽水溶液滴鼻，每天1次，共10次。

1.2.3 檢測指標

① 綠原酸對AR小鼠行為學的影響 給藥30 min后，以10% OVA溶液滴鼻，觀察且記錄每只鼠10 min內(nèi)，噴嚏、抓鼻次數(shù)。

抓鼻均以前足抓鼻為準。連續(xù)不斷的抓鼻，間歇期<30 s，記“+++”；間歇期30-60s，記“++”；間歇期60～90 s，記“+”；無抓鼻動作或間歇期≥90 s，記“-”；“+”記做5次。

② 綠原酸對AR小鼠鼻腔分泌物的影響 鼻腔分泌物重量：將濾紙剪成2 cm×0.1 cm的形狀，在10% OVA生理鹽水溶液滴鼻攻擊結(jié)束后反復汲取鼻腔內(nèi)液體，記錄鼻腔分泌物重量，以mg計。

③ 綠原酸對AR小鼠臟器指數(shù)的影響 實驗結(jié)束后取小鼠胸腺和脾臟稱重，計算臟器指數(shù)。脾臟指數(shù)=胸腺重(mg)/體質(zhì)量(10 g)；脾臟指數(shù)=脾重(mg)/體質(zhì)量(10 g)；

④ 綠原酸對AR小鼠鼻腔灌洗液中IL-4、IFN-γ的影響 實驗結(jié)束后處死小鼠，將1 mL預(yù)冷的PBS經(jīng)導管注入鼻咽部，收集雙側(cè)鼻孔流出液，后經(jīng)離心取上清，在-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。采用ELISA法分別檢測小鼠鼻腔灌洗液中IL-4和IFN-γ的含量。于酶標儀450 nm處讀取吸光度值，根據(jù)標準曲線計算IL-4和IFN-γ濃度值。

⑤ 綠原酸對AR小鼠血清組胺、IgE及IL-4、IFN-γ、IL-5和IL-10的影響 實驗結(jié)束后小鼠取血，分離血清，采用ELISA法檢測小鼠血清中組胺、IgE、IL-4、IFN-γ、IL-5和IL-10含量，于酶標儀450 nm處讀取吸光度值。

⑥ 綠原酸對AR小鼠鼻黏膜組織中IL-4、IFN-γ、IL-5和IL-10的含量的影響 實驗結(jié)束后，分離取出小鼠鼻粘膜組織，提取RNA，測定OD260和OD280，用 OD260/OD280的比值來反映RNA 的純度，總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再以cDNA為模板，加入相應(yīng)的引物，擴增合成目的片段。檢測 AR小鼠鼻黏膜組織中IL-4、IFN-γ、IL-5和IL-10的表達。引物設(shè)計如下：IL-4上游引物序列為：5’-TCAACCCCCAGCTAGTTGTC-3’，下游引物序列為：5’-CGAGCTCACTCTCTGTGGTG-3’；IFN-γ上游引物序列為：5’-CA-CGGCACAGTCATTGAAAG-3’，下游引物序列為：5’-GCTGA-TGGCCTGATTGTCTT-3’；IL-5上游引物序列為：5’-TGACCG-CCAAAAAGAGAAGT-3’，下游引物序列為：5’-GCATTTGCAGT-TTTGTGGTGG-3’；IL-10上游引物序列為：5’-TCATGGC-CTTGTAGACACCT-3’，下游引物序列為：5’-CATACTGCTAA-CCGACTCCT-3’；β-actin上游引物序列為：5’-CATCCTGCGT-CTGGACCTGG-3’，下游引物序列為：5’-TAATGTCACGCAC-GATTTCC-3’。

2 結(jié)果

2.1 綠原酸對AR小鼠行為學影響 與正常組相比，模型組小鼠噴嚏和抓鼻次數(shù)隨時間延長明顯升高，表明OVA能顯著升高小鼠噴嚏和抓鼻次數(shù)(P<0.001)；與模型組相比，綠原酸可以明顯減少小鼠噴嚏和抓鼻次數(shù)(P<0.05)。見圖1、圖2。小鼠第6、8、10天的噴嚏和抓鼻次數(shù)見表1、表2。

圖1 綠原酸對AR小鼠噴嚏次數(shù)的影響###P<0.001，與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，與模型組比較Fig.1 Effect of chlorogenic acid on the number of sneezing in AR mice###P<0.001，compared with control group；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001， compared with model group

圖2 綠原酸對AR小鼠抓鼻次數(shù)的影響###P<0.001，與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，與模型組比較Fig.2 The effect of chlorogenic acid on the number of rubbing nasal in AR mice###P<0.001，compared with control group；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001， compared with model group

組別只數(shù)噴嚏次數(shù)(10min)第6天第8天第10天正常對照組105.30±0.645.70±0.795.60±0.89模型組1041.80±3.98###53.10±4.01###57.60±3.74###陽性對照組1026.40±1.47***20.60±1.59***13.40±1.44***綠原酸低劑量組1037.00±3.66*40.30±2.34***29.80±2.23***綠原酸中劑量組1032.80±2.39**37.70±2.51***26.50±2.66***綠原酸高劑量組1032.80±3.44***35.60±3.25***26.80±3.46***

###P<0.001，與正常組比較，compared with control group；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，與模型組比較，compared with model group

組別只數(shù)抓鼻次數(shù)(10min)第6天第8天第10天正常對照組105.28±1.005.90±0.795.60±0.76模型組1040.00±4.67###47.00±2.58###50.00±1.53###陽性對照組1027.32±1.04***20.00±1.29***16.40±3.24***綠原酸低劑量組1033.00±3.46*32.30±2.07***25.60±2.46***綠原酸中劑量組1032.00±2.09**31.40±2.49***23.50±2.01***綠原酸高劑量組1032.76±1.08***25.60±3.20***20.80±1.32***

###P<0.001，與正常組比較，compared with control group；*P<0.05，**P<0.01，與模型組比較，compared with model group

2.2 綠原酸對AR小鼠鼻腔分泌物的影響 與正常組相比，模型組小鼠鼻腔分泌物重量明顯升高(P<0.001)，提示OVA能顯著升高小鼠鼻腔分泌物重量；與模型組相比，綠原酸高劑量組鼻腔分泌物重量明顯降低(P<0.05)。見表3。

組別只數(shù)鼻腔分泌物重量(mg)第7天第8天第9天第10天正常對照組106.00±0.826.40±0.726.70±1.266.10±1.03模型組1019.00±1.61###20.00±1.42###21.10±1.26###20.90±1.16###陽性對照組1013.70±1.03**14.30±1.37**15.50±1.33**16.20±1.20**綠原酸低劑量組1018.30±1.6919.30±1.4120.50±1.1319.20±0.79綠原酸中劑量組1017.40±0.9118.40±1.1419.50±0.9018.90±0.78綠原酸高劑量組1014.30±1.12*15.30±1.23*16.60±1.06*16.50±1.06*

###P<0.001，與正常組比較，compared with control group；*P<0.05，**P<0.01，與模型組比較，compared with model group

2.3 綠原酸對AR小鼠臟器指數(shù)的影響 與正常組相比，模型組小鼠脾臟指數(shù)明顯升高，而胸腺指數(shù)明顯降低(P<0.001)，提示OVA能顯著升高小鼠脾臟指數(shù)和降低胸腺指數(shù)；與模型組相比，綠原酸各劑量組均能不同程度的降低小鼠脾臟指數(shù)，升高胸腺指數(shù)。見表4。

組別只數(shù)脾指數(shù)(mg/10g)胸腺指數(shù)(mg/10g)正常對照組1032.56±1.7923.1±1.3模型組1050.48±3.11###10.4±0.4###陽性對照組1034.32±1.06***16.2±0.9***綠原酸低劑量組1045.29±3.24*12.4±0.7*綠原酸中劑量組1043.28±3.08**13.2±1.0**綠原酸高劑量組1038.49±2.59***15.6±1.3***

###P<0.001，與正常組比較，compared with control group；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，與模型組比較，compared with model group

2.4 綠原酸對小鼠鼻腔灌洗液中IL-4、IFN-γ含量的影響 與正常組相比，模型組小鼠鼻腔灌洗液IFN-γ的含量明顯下降(P<0.001)，IL-4的含量明顯升高(P<0.001)；與模型組相比，綠原酸高劑量組和中劑量組可以升高小鼠鼻腔灌洗液IFN-γ的含量(P<0.005)，降低小鼠鼻腔灌洗液IL-4的含量(P<0.005)。見表5。

表5 綠原酸對AR小鼠鼻腔灌洗液IL-4、IFN-γ含量的影響Tab.5 The effect of chlorogenic acid on the content of IL-4 and IFN-γ in nasal lavage fluid in AR ±s)

###P<0.001，與正常組比較，compared with control group；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，與模型組比較，compared with model group

2.5 綠原酸對小鼠血清組胺和IgE含量的影響 與正常組相比，模型組小鼠血清組胺和IgE的含量明顯升高(P<0.001)；與模型組相比，綠原酸高劑量組和中劑量組可以降低小鼠血清IgE的含量(P<0.05)，綠原酸各劑量組均可降低小鼠血清組胺的含量(P<0.05)。見表6。

表6 綠原酸對AR小鼠血清組胺和IgE含量的影響Tab.6 The effect of chlorogenic acid on the content of histamine and IgE in serum in AR mice

###P<0.001，與正常組比較，compared with control group；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，與模型組比較，compared with model group

2.6 綠原酸對小鼠血清中IL-4、IFN-γ、IL-5和IL-10含量的影響 與正常組相比，模型組小鼠血清IFN-γ的含量明顯下降(P<0.001)，IL-4、IL-5和IL-10的含量明顯升高(P<0.001)；與模型組相比，綠原酸高劑量組和中劑量組可以升高小鼠血清IFN-γ的含量(P<0.05)，降低小鼠血清IL-4、IL-5和IL-10的含量(P<0.05)，同時IFN-γ/IL-4升高(P<0.05)。見表7和表8。

表7 綠原酸對AR小鼠血清IL-4、IFN-γ含量的影響Tab.7 The effect of chlorogenic acid on the content of IL-4 and IFN-γ in serum in AR mice

###P<0.001，與正常組比較，compared with control group；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，與模型組比較，compared with model group

表8 綠原酸對AR小鼠血清IL-5和IL-10含量的影響Tab.8 The effect of chlorogenic acid on the content of IL-10, IL-5 and IL-10 in serum in AR mice

###P<0.001，與正常組比較，compared with control group；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，與模型組比較，compared with model group

2.8 綠原酸對小鼠鼻黏膜組織IL-4 mRNA、IFN-γ mRNA、IL-5 mRNA和IL-10 mRNA表達的影響 與正常組相比，模型組IL-4、IL-5和IL-10的mRNA相對表達量顯著升高，IFN-γ的mRNA相對表達量顯著降低(P<0.001)。與模型組相比，綠原酸可以顯著降低IL-4、IL-5和IL-10的mRNA相對表達量(P<0.01，P<0.05)，升高IFN-γ的mRNA相對表達量(P<0.001)。

圖3 綠原酸對小鼠鼻黏膜組織IL-4 mRNA、IFN-γ mRNA、IL-5 mRNA和IL-10 mRNA表達的影響A.IL-10/β-actin的相對表達量；B.IL-5/β-actin的相對表達量；C. IFN-γ/β-actin的相對表達量；D.IL-4/β-actin的相對表達量###P<0.001與正常組比較；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，與模型組比較Fig.3 Effects of chlorogenic acid on expression of cytokines mRNA in rat tissue samplesA.Relative expression of IL-10/β-actin；B.Relative expression of IL-5/β-actin；C.Relative expression of IFN-γ/β-actin；D.Relative expression of IL-4/β-actin###P<0.001，compared with control group；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，compared with model group

3 討論

變應(yīng)性鼻炎是臨床常見的變態(tài)反應(yīng)性疾病，以鼻癢、噴嚏、流涕為主要癥狀。變應(yīng)性鼻炎的發(fā)病機制是花粉等變應(yīng)原進入機體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，當變應(yīng)原再次攻擊機體時誘導機體產(chǎn)生肥大細胞脫顆粒，血清IgE水平增加，引起一系列的生化反應(yīng)[12]。臨床常用的抗變應(yīng)性鼻炎的藥物主要有抗組胺藥、過敏反應(yīng)介質(zhì)阻滯劑、糖皮質(zhì)激素、白三烯受體拮抗劑和免疫調(diào)節(jié)劑等。

通過實驗，發(fā)現(xiàn)在一定時間內(nèi)觀察AR動物的噴嚏次數(shù)、抓鼻次數(shù)、鼻腔分泌物的重量能夠較直觀的反應(yīng)藥物對AR的治療作用。并且本研究首次對AR小鼠鼻腔分泌物的重量進行了分析，結(jié)果表明，綠原酸灌胃后，能有效緩解AR小鼠的鼻部癥狀，明顯減少AR小鼠的噴嚏次數(shù)、抓鼻次數(shù)和鼻腔分泌物重量。

變應(yīng)原進入機體后，刺激機體產(chǎn)生特異性的IgE抗體，并通過Fc段與具有相應(yīng)IgE FcεR的MC或嗜堿性粒細胞結(jié)合，促使免疫細胞脫顆粒，以及釋放生物活性物質(zhì)(如組胺、激肽原酶等)[13]，進而引起過敏性鼻炎。本實驗發(fā)現(xiàn)綠原酸可以降低AR小鼠血清中組胺和IgE的含量，提示綠原酸可能通過抑制肥大細胞脫顆粒和抑制小鼠體內(nèi)IgE，進而達到緩解癥狀的目的。

在變應(yīng)性鼻炎反應(yīng)中，Th0細胞分化成Th1和Th2細胞，并產(chǎn)生不同的細胞因子，其中Th1細胞主要分泌IFN-γ，Th2細胞大量分泌 IL-4、IL-5、IL-13和 IL-10[14]。IFN-γ可以抑制嗜酸性粒細胞在氣道的浸潤，在變應(yīng)性鼻炎反應(yīng)中起負調(diào)節(jié)作用[15]。IL-4是Th2細胞的特征細胞因子，刺激B細胞產(chǎn)生抗體，肥大細胞脫顆粒釋放炎性介質(zhì), 肥大細胞特異性與IgE交聯(lián),參與體液免疫[16]。IL-10是由單核細胞產(chǎn)生的抗炎細胞因子，少部分由淋巴細胞產(chǎn)生，雖然IL-10與過敏性鼻炎沒有直接的關(guān)系，但是IL-10的產(chǎn)生減少可能會上調(diào)Th1細胞因子的產(chǎn)生[17]。IL-5在EOS的分化、成熟、黏附、浸潤和凋亡過程中發(fā)揮極其重要的作用[18]。本實驗研究通過對AR小鼠血清IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-13和 IL-10的含量測定，同時利用RT-PCR法檢測鼻黏膜組織中IFN-γ mRNA、IL-4 mRNA、IL-5 mRNA、IL-13 mRNA和 IL-10 mRNA的表達，發(fā)現(xiàn)綠原酸可以增加AR小鼠血清IFN-γ的含量，降低IL-4、IL-5、IL-13和 IL-10的含量，同時上調(diào)IFN-γ的表達，下調(diào)IL-4、IL-5、IL-13和 IL-10的表達，提示綠原酸可能通過調(diào)節(jié)Th1和Th2細胞因子的分泌來調(diào)節(jié)Th1/Th2的平衡，從而抑制AR小鼠的炎癥反應(yīng)。

綜上所述，本研究證明了綠原酸對變應(yīng)性鼻炎的治療作用，其作用機制可能與調(diào)節(jié)Th細胞分泌細胞因子有關(guān)。

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(編校：譚玲)

Effect and mechanism of chlorogenic acid in allergic rhinitis mice

LI Hong-xin,JIANG Hong-bin,LIU Shu-nan, DI Liang-jiao,HONG TieΔ

(Department of Pharmacology, School of Pharmacy, Jilin University, Changchun 130021, China)

ObjectiveTo study the effect and mechanism of chlorogenic acid in allergic rhinitis(AR) mice. MethodsThe model of AR mice was induced by intraperitoneal injection of adjuvant suspension on every other day for 7 times, and then by nasal drip of 10% OVA for 10 days. After administration with 50, 100, 200 mg/kg of chlorogenic acid for 30 min, AR mice were attacked locally for 10 days. Behavior analysis were observed and the effect of chlorogenic acid on the contents of cytokines, IgE and histamine by ELISA in AR mice were determined. ResultsChlorogenic acid decreased the number of nose-scratching events in 10min, the weight of nosal draingage, the index of spleen, the content of IL-4 in nasal lavage fluid(NLF) and the contents of cytokines, IgE and histamine in serum; while increased the index of thymus, the content of IFN-γ in NLF, the contents of IFN-γ in serum and the rate of IFN-γ/ IL-4. The data showed a statistically significant up-regulation of IFN-γ mRNA expressions and down-regulation of IL-4 mRNA, IL-5 mRNA, IL-10 mRNA expressions after adiminstration of chlorogenic acid. ConclusionChlorogenic acid might exert the effect in AR mice through regulating the balance of Th1 and Th2.

chlorogenic acid; allergic rhinitis; histamine; IgE; cytokine

李洪辛，女，碩士，研究方向：免疫藥理學，E-mail：lihx13@mails.jlu.edu.cn；洪鐵，通訊作者，男，博士，教授，研究方向：免疫藥理學，E-mail：hongtie@jlu.edu.cn。

R765.21

A

1005-1678(2015)06-0001-05