倪志堅(jiān)，王紹花，劉飛，朱希強(qiáng),Δ

(1.山東大學(xué) 藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250012；2.山東省藥學(xué)科學(xué)院 博士后工作站，山東 濟(jì)南 250101)

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乳鏈菌肽生物合成及高產(chǎn)菌株選育的研究進(jìn)展

倪志堅(jiān)1，王紹花2，劉飛2，朱希強(qiáng)1,2Δ

(1.山東大學(xué) 藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250012；2.山東省藥學(xué)科學(xué)院 博士后工作站，山東 濟(jì)南 250101)

乳鏈菌肽(Nisin)是乳酸乳球菌(Lactococcuslactis，L.lactis)的某些亞種在生長過程中產(chǎn)生的一種天然活性多肽類細(xì)菌素。由于其具有優(yōu)越的抑菌活性，現(xiàn)已作為一種高效、無毒的綠色食品添加劑廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)。然而目前Nisin主要通過乳酸菌發(fā)酵生產(chǎn)，其工業(yè)化產(chǎn)率較低，尚不能滿足龐大的市場(chǎng)需求，因此合理構(gòu)建高產(chǎn)Nisin菌株意義重大。本文主要綜述了以Nisin生物合成關(guān)鍵基因的功能表達(dá)及其調(diào)控機(jī)制為主線的分子成熟途徑，并對(duì)Nisin高產(chǎn)菌株的研究狀況作了概述，為實(shí)踐進(jìn)一步高產(chǎn)菌株的研究提供了方向，對(duì)Nisin的工業(yè)化放大生產(chǎn)具有一定指導(dǎo)意義。

乳鏈菌肽；生物合成；關(guān)鍵基因；調(diào)控；高產(chǎn)菌株

乳鏈菌肽，又稱乳酸鏈球菌素，屬于羊毛硫抗生素(lantibiotics)家族。成熟的活性Nisin單體分子由34個(gè)氨基酸組成，其典型特征是分子結(jié)構(gòu)中含有多種稀有氨基酸，這些非編碼氨基酸的存在不僅側(cè)面反映了Nisin形成過程的特殊性，而且與Nisin穩(wěn)定性及其生物功能密切相關(guān)[1]。一般情況下，Nisin對(duì)大多數(shù)革蘭氏陽性菌及其芽孢的生長和繁殖具有強(qiáng)烈的抑制作用，而且在人體消化道內(nèi)蛋白酶作用下能夠被迅速降解而不影響腸道內(nèi)正常菌落結(jié)構(gòu)，現(xiàn)已成為一種公認(rèn)的安全天然生物食品添加劑，并在全球范圍廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)，同時(shí)在生物醫(yī)藥和輕工業(yè)等領(lǐng)域也極具廣闊的應(yīng)用前景[2]。

1 Nisin生物合成的關(guān)鍵基因分析

1988年，Buchman等[3]首次克隆出編碼Nisin的基因并開始對(duì)其合成機(jī)理進(jìn)行了深入研究?，F(xiàn)已基本確定Nisin生物合成的基因由一段控制其合成、成熟、調(diào)控及免疫的nisABTCIPRKFEG基因簇所構(gòu)成，約14kb，位于染色體的1個(gè)約70kb的接合型轉(zhuǎn)座子上。這11個(gè)基因的表達(dá)各不相同，且功能復(fù)雜，但活性Nisin的產(chǎn)生需要該基因簇中所有基因的共同作用[4]。

1.1 Nisin的結(jié)構(gòu)基因 nisA是Nisin前體的結(jié)構(gòu)基因，負(fù)責(zé)編碼Nisin前體肽。該肽分子由57個(gè)氨基酸構(gòu)成，包括N-端23個(gè)氨基酸組成的前導(dǎo)序列和C-端34個(gè)氨基酸組成的成熟Nisin分子的前身(見圖1A)。Nisin前體的前導(dǎo)肽可以被修飾和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白所識(shí)別，即Nisin前體分子必須在其前導(dǎo)肽的引導(dǎo)下經(jīng)歷翻譯后修飾和加工過程，才能形成成熟活性Nisin分子[4]。1993年Kuipers等[4]通過構(gòu)建一個(gè)缺失4bp的結(jié)構(gòu)基因(△nisA)，研究了Nisin在nisA缺失和完整存在下的表達(dá)情況，結(jié)果nisA缺失菌株沒有生成Nisin的任何結(jié)構(gòu)，這表明了nisA的表達(dá)依賴于其自身結(jié)構(gòu)的完整性。但向培養(yǎng)基中加入少量活性Nisin后，nisA的轉(zhuǎn)錄又能開始；隨后又通過構(gòu)建nisA啟動(dòng)子與報(bào)道基因gusA的融合子，并轉(zhuǎn)入適當(dāng)受體，結(jié)果得到了gusA基因的表達(dá)產(chǎn)物，且表達(dá)水平與加入Nisin的量直接相關(guān)，從而證實(shí)了nisA啟動(dòng)子的可誘導(dǎo)性，并提示了Nisin合成系統(tǒng)潛在的復(fù)雜調(diào)控機(jī)制。此外，Sailaja等[5]報(bào)道指出nisA啟動(dòng)子還可以被外加半乳糖誘導(dǎo)啟動(dòng)，進(jìn)一步研究表明該誘導(dǎo)機(jī)制是通過一個(gè)結(jié)合在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)-107bp處TCT重復(fù)序列上的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子所介導(dǎo)的，且這個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子與Nisin介導(dǎo)的誘導(dǎo)機(jī)制也有關(guān)聯(lián)。

圖1 Nisin結(jié)構(gòu)變化圖A：Nisin前體；B：完全修飾的Nisin前體；C：成熟Nisin★：可被修飾的氨基酸；黑色箭頭：N-端氨基酸的加工；白色箭頭：前導(dǎo)肽的切割位點(diǎn)Fig.1 Schematic changes of Nisin structureA：Nisin precursor；B：fully modified Nisin precursor；C：mature Nisin★：residues that will be modified；Black arrow：processing of the N-terminal residue；white arrow：the processing site of the leader peptide

1.2 Nisin的成熟基因

1.2.1 nisBC基因:nisBC是Nisin前體的修飾基因。其中nisB編碼1個(gè)脫水酶蛋白(NisB)，由993個(gè)氨基酸組成。NisB具有兩性跨膜的α-螺旋結(jié)構(gòu)，該區(qū)域可以和細(xì)胞膜結(jié)合，使NisB定位于細(xì)胞膜上，從而發(fā)揮其特定功能：將Nisin前體分子中的絲氨酸脫水形成脫氫丙氨酸，同時(shí)將蘇氨酸脫水形成β-甲基脫氫丙氨酸。Ra等[6]實(shí)驗(yàn)表明，nisB基因的缺失會(huì)直接造成Nisin產(chǎn)物的消失及菌株免疫力的急劇降低。

nisC編碼一個(gè)含414個(gè)氨基酸的環(huán)化酶蛋白(NisC)，它主要參與Nisin前體分子中脫水氨基酸殘基與半胱氨酸形成硫醚橋的過程。NisC也定位于細(xì)胞膜上，它對(duì)Nisin前體的翻譯后修飾作用至關(guān)重要，敲除nisC基因后，經(jīng)NisB脫水處理后的Nisin前體就不能形成硫醚橋，導(dǎo)致Nisin抑菌活性完全喪失。Li等[7]對(duì)nisC基因進(jìn)行體內(nèi)過表達(dá)并純化后發(fā)現(xiàn)NisC在水中能以單體形式存在，光譜分析顯示該蛋白含有鋅元素，這種異源產(chǎn)生的NisC蛋白在體外也能使已脫水的Nisin前體肽成環(huán)，并且產(chǎn)物切掉前導(dǎo)肽后具有完全成熟的Nisin活性。而鋅元素的存在，可能與NisC的環(huán)化功能密切相關(guān)，這一點(diǎn)在后來Okeley的研究[8]中已經(jīng)得到證實(shí)。

1.2.2 nisT基因:nisT位于nisB的下游，編碼1個(gè)含600個(gè)氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(NisT)，負(fù)責(zé)完全修飾的Nisin前體的跨膜運(yùn)輸。NisT與ABC(ATP-binding cassette)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族有強(qiáng)烈的同源性，是耗能運(yùn)輸?shù)鞍?，?個(gè)結(jié)構(gòu)域：其C-端含有ATP結(jié)合的特征結(jié)構(gòu)序列，可以結(jié)合ATP；N-端的α-螺旋形成跨膜結(jié)構(gòu)域，能使NisT鑲嵌在細(xì)胞膜上。Siegers等[9]發(fā)現(xiàn)NisB對(duì)NisT的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能有輔助作用，進(jìn)一步研究顯示NisB、NisC和NisT之間不僅有相互作用，而且在細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)側(cè)形成了一個(gè)膜相關(guān)的酶復(fù)合體(NisBC2T2)，包含1分子的NisB，2分子的NisC和2分子的NisT，從而保證了Nisin前體的翻譯后修飾及分泌工作的高效性。nisT敲除實(shí)驗(yàn)顯示[6]培養(yǎng)基中檢測(cè)不到Nisin活性，細(xì)胞不能將經(jīng)過修飾的Nisin前體分泌到胞外，同時(shí)菌體的生長受到了很大抑制，從而證明了nisT在Nisin轉(zhuǎn)運(yùn)過程中的關(guān)鍵程度。然而，F(xiàn)ang等[10]研究表示，在沒有生物膜結(jié)構(gòu)和nisT基因或NisT存在的體外Nisin合成系統(tǒng)中，同樣可以形成完全修飾的Nisin分子，這表明不同的合成體系中，NisT對(duì)Nisin成熟過程的關(guān)鍵程度不同，且NisT的功能發(fā)揮具有一定獨(dú)立性。

1.2.3 nisP基因:nisP編碼1個(gè)枯草桿菌蛋白酶樣的胞外絲氨酸蛋白酶(NisP)[11]，含682個(gè)氨基酸殘基，負(fù)責(zé)完全修飾的Nisin前體上前導(dǎo)序列的切割，形成成熟活性Nisin分子(見圖1C)。該蛋白酶肽鏈N-端是由220個(gè)殘基構(gòu)成的pre-pro序列，包括1個(gè)分泌性信號(hào)肽區(qū)，負(fù)責(zé)將NisP分泌到細(xì)胞外，和1個(gè)信號(hào)肽酶切割位點(diǎn)，在NisP成熟過程中信號(hào)肽會(huì)被切掉；其C-端是1段含110個(gè)氨基酸的保守序列，它是細(xì)胞表面的膜錨著點(diǎn)，這表明NisP錨定在細(xì)胞外膜上；中間殘基部分就是該酶的功能催化區(qū)。葉嗣穎等[12]成功構(gòu)建了一個(gè)nisP缺失的突變株，此菌株能分泌完整的Nisin前體肽，卻不能分泌成熟的活性Nisin分子。利用Nisin產(chǎn)生菌的菌體胞膜蛋白處理該Nisin前體后，才能形成有活性的成熟Nisin分子，從而證實(shí)了nisP基因在Nisin生物合成最后成熟階段的決定性作用。

1.3 Nisin的表達(dá)調(diào)控基因 Nisin的生物合成由雙組分調(diào)控系統(tǒng)nisRK基因表達(dá)調(diào)控[4]，位于nisP基因下游。其中nisR編碼1個(gè)含228個(gè)氨基酸的應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白(NisR)，是Nisin生物合成中的轉(zhuǎn)錄激活因子。該蛋白發(fā)生磷酸化后能結(jié)合到nisA和nisF的啟動(dòng)子區(qū)，誘導(dǎo)其下游相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。nisK編碼1個(gè)含446個(gè)氨基酸的組氨酸感應(yīng)激酶(NisK)，錨定于胞外膜上，能與成熟Nisin分子發(fā)生結(jié)合。當(dāng)胞外環(huán)境中出現(xiàn)成熟Nisin、Nisin突變體或Nisin類似物時(shí)，它會(huì)結(jié)合到NisK上并激發(fā)下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[4]。研究顯示[13]nisR或nisK的敲除都能夠使nisA轉(zhuǎn)錄缺陷，導(dǎo)致L.lactis菌株不能正常表達(dá)Nisin，體現(xiàn)了nisRK在Nisin生物合成中的重要作用。然而nisRK操縱子自身的表達(dá)是獨(dú)立于Nisin調(diào)控的，由組成型啟動(dòng)子nisR啟動(dòng)表達(dá)。據(jù)報(bào)道[14]，雖然nisR啟動(dòng)子強(qiáng)度相對(duì)較大，但其起始密碼子是GTG，且nisK上缺乏高效的核糖體結(jié)合位點(diǎn)，導(dǎo)致nisRK轉(zhuǎn)錄效率較低，因此一般野生型Nisin產(chǎn)生菌中nisRK的表達(dá)水平都不高。汪蕊等[15]通過構(gòu)建重組質(zhì)粒pMG76e-nisRK，替換了原啟動(dòng)結(jié)構(gòu)，并轉(zhuǎn)入宿主菌后，獲得的重組菌株使Nisin的產(chǎn)量明顯提高，這為高產(chǎn)Nisin工程菌的構(gòu)建了可靠依據(jù)。

1.4 Nisin的免疫抗性基因 Nisin作為一種天然生物防腐劑，對(duì)大多數(shù)革蘭氏陽性細(xì)菌均有抑制作用。一般認(rèn)為[16]它能與細(xì)菌細(xì)胞膜上LipidII分子結(jié)合形成Nisin-LipidII孔洞復(fù)合物，在納摩爾級(jí)濃度下便使細(xì)胞膜穿孔，造成細(xì)胞內(nèi)小分子內(nèi)容物的流失，同時(shí)LipidII分子也是細(xì)菌細(xì)胞壁生物合成的重要中間體，因此Nisin對(duì)LipidII分子的“劫持”會(huì)干擾細(xì)胞壁的正常合成，從而導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。而在Nisin產(chǎn)生菌中，這種抑菌效應(yīng)顯然能被菌株自身所免疫，這主要是Nisin生物合成基因簇上的4個(gè)基因共同決定的，即nisI和nisFEG。它們能編碼相應(yīng)的免疫物質(zhì)，防止產(chǎn)物Nisin對(duì)細(xì)胞自身的毒害作用。其中nisFEG基因分別編碼3個(gè)疏水性蛋白[17]：NisF(225個(gè)氨基酸，24.7 kDa)、NisE(247個(gè)氨基酸，28.2 kDa)和NisG(214個(gè)氨基酸，24.2 kDa)。其中NisE、NisF與ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族有很強(qiáng)的同源性，且NisF是胞質(zhì)ATP結(jié)合蛋白，而NisG含有3～4個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，能定位于胞膜上。這3個(gè)蛋白可組成一個(gè)類ABC的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白復(fù)合體nisFEG，該復(fù)合體能夠把入侵細(xì)胞膜的Nisin轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外部環(huán)境，防止由于Nisin濃度過高而形成孔洞，因此在免疫機(jī)制中發(fā)揮著重要的作用。nisF、nisE和nisG中任一基因的缺失都會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞Nisin產(chǎn)量的下降以及細(xì)胞對(duì)Nisin敏感性的提高。

nisI基因位于nisC下游，編碼1個(gè)含245個(gè)氨基酸的NisI前體蛋白分子[18]，其N-端存在1段高保守信號(hào)序列，是胞質(zhì)膜的膜錨著點(diǎn)，在轉(zhuǎn)運(yùn)過程中會(huì)發(fā)生修飾并切除，從而形成NisI的2種存在形態(tài)：分泌到胞外的游離形態(tài)和膜結(jié)合形態(tài)。這2種形態(tài)的NisI都能直接與Nisin發(fā)生特異性結(jié)合作用，因此NisI可以作為Nisin的“攔截”分子，阻止其與細(xì)胞膜上lipidII分子結(jié)合而造成穿膜的孔洞，從而使細(xì)胞自身免受Nisin的侵害作用，形成了自我免疫的第一道防線。同樣，nisI基因缺失研究表明細(xì)胞仍能產(chǎn)生活性Nisin，但其產(chǎn)量和對(duì)Nisin的敏感水平均有顯著變化。最近有報(bào)道指出[19]，可能還存在其他細(xì)胞成分也參與了菌體的Nisin免疫抗性。Froseth等[20]鑒定到了1個(gè)Nisin抗性基因(nsr)，能編碼一個(gè)膜結(jié)合蛋白(NSR)，其C-端存在一段保守的末端特異性蛋白酶結(jié)構(gòu)域。該蛋白介導(dǎo)的Nisin抗性就是通過破壞Nisin分子的第28位甲基羊毛硫氨酸和第29位絲氨酸之間結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致Nisin分子降解而增強(qiáng)菌體自身免疫。它是L.lactis中首個(gè)被鑒定并闡明的直接由蛋白酶降解Nisin而形成的Nisin免疫抗性機(jī)制。

2 Nisin的生物合成途徑概述

成熟活性Nisin的產(chǎn)生需要該生物合成基因簇上所有基因的共同作用，而這11個(gè)基因序列分別由nisA、nisR、及nisF啟動(dòng)子控制其轉(zhuǎn)錄。其中nisR啟動(dòng)子是組成型表達(dá)的，而nisA和nisF啟動(dòng)子由nisRK所形成的雙組分調(diào)控系統(tǒng)調(diào)控表達(dá)。Nisin具體合成途徑如下[4](見圖2)：①首先胞外信號(hào)(如活性Nisin)與細(xì)胞膜上的NisK結(jié)合，使NisK迅速發(fā)生自我磷酸化并將磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移給NisR；②磷酸化的NisR作為轉(zhuǎn)錄激活因子，結(jié)合到nisA和nisF啟動(dòng)子上，激活轉(zhuǎn)錄，并啟動(dòng)下游基因表達(dá)，從而在核糖體上合成Nisin前體肽和相應(yīng)的一系列蛋白(NisB、NisC、NisT、NisP及脂蛋白NisI和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白復(fù)合體NisFEG)；③Nisin前體分子經(jīng)NisB的脫水作用及NisC的環(huán)化作用，形成5個(gè)分子內(nèi)硫醚橋，完成Nisin前體的翻譯后修飾的過程；④NisT水解胞質(zhì)內(nèi)ATP提供能量，將經(jīng)過翻譯后修飾的Nisin前體跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)至胞外；⑤錨定于胞膜上的NisP對(duì)完全修飾的Nisin前體進(jìn)行胞外加工，切去前導(dǎo)肽序列，釋放出有活性的成熟Nisin分子，完成Nisin整個(gè)生物合成的最后一步。而脂蛋白NisI和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白復(fù)合體NisFEG雖未直接參與Nisin合成過程，但它們與菌體自身對(duì)Nisin的免疫性密切相關(guān)，一直負(fù)責(zé)保護(hù)著生產(chǎn)菌自身免受胞外Nisin的傷害，從而為菌體的一切生命活動(dòng)提供了安全保障。

圖2 Nisin生物合成路徑模型P*：磷酸基團(tuán)；P：誘導(dǎo)型啟動(dòng)子；P：組成型啟動(dòng)子Fig.2 The model of Nisin biosynthesis pathwayP*：phosphate group；P：inducible promoter；P：constitutive promoter

3 Nisin高產(chǎn)菌株的研究進(jìn)展

Nisin作為一種安全環(huán)保型天然抗菌素，具有非常廣闊的市場(chǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)效益。隨著商品市場(chǎng)的發(fā)展，Nisin的市場(chǎng)需求日益擴(kuò)大，而Nisin主要是通過乳酸菌發(fā)酵方法生產(chǎn)，且一般天然菌種的性能差、生產(chǎn)能力較低，因此構(gòu)建穩(wěn)定高產(chǎn)Nisin菌株以滿足實(shí)際需求日益迫切。

3.1 傳統(tǒng)誘變育種 誘變育種指利用某些理化誘變劑處理微生物細(xì)胞，使其發(fā)生突變，再通過某些特定的方法篩選出具有目標(biāo)特性的突變菌株。常用誘變劑主要有物理誘變劑，如紫外線、X射線、宇宙射線、微波、高能電子流等、化學(xué)誘變劑如烷化劑、羥化劑等；還有生物誘變劑，包括能夠引起DNA突變的病毒。長期以來，人們?cè)诶谜T變育種提高Nisin產(chǎn)量方面已經(jīng)進(jìn)行了大量研究，并取得了一些成效。早在1973年，Kalra等[21]就嘗試?yán)米贤饩€照射的方式對(duì)Streptococcuslactis-6菌株進(jìn)行誘變，結(jié)果Nisin的效價(jià)較原始菌株提高了2倍；姜麗艷等[22]采用硫酸二乙酯(DES)對(duì)L.lactis ATCC11454進(jìn)行誘變處理，篩選到了一株遺傳特性穩(wěn)定的Nisin抗性菌株，其效價(jià)最高達(dá)到2570IU/mL，比原始菌株提高了2.13倍；申斐等[23]采用微波對(duì)Nisin產(chǎn)生菌進(jìn)行誘變處理以提高Nisin產(chǎn)量，獲得一突變菌株，但沒有達(dá)到預(yù)期誘變效果；還連棟等[24]利用紫外線、LiCl、60Co及8-MOP+NUV等多種理化誘變劑對(duì)原始菌株進(jìn)行多次單因子和復(fù)合誘變處理，獲得一Nisin高產(chǎn)突變株，其效價(jià)能穩(wěn)定在2300～2500 IU/mL；隨后，陳洪衛(wèi)等[25]利用低能氮離子注入聯(lián)合紫外線照射的方法進(jìn)行原始菌株的誘變處理，也獲得一高產(chǎn)突變菌株，其Nisin效價(jià)達(dá)到2291.75 IU/mL；李海娜等[26]采用紫外線、微波和亞硝酸鈉對(duì)出發(fā)菌株進(jìn)行復(fù)合誘變處理，并結(jié)合Nisin抗性篩選機(jī)制選育出一遺傳性狀穩(wěn)定的高產(chǎn)菌株Nis123，其Nisin產(chǎn)量高達(dá)5250 U/mL，比出發(fā)菌株提高了4.3倍。由此可以看出，傳統(tǒng)誘變育種方法選擇范圍比較廣泛，在選育Nisin高產(chǎn)菌株方面具有一定的實(shí)效性。

3.2 Genome shuffling技術(shù)育種 Genome shuffling技術(shù)又稱基因組重組技術(shù)，是20世紀(jì)末提出的一種將傳統(tǒng)誘變與原生質(zhì)體融合的新興菌種改良技術(shù)，其原理是首先通過傳統(tǒng)誘變篩選獲得若干正向突變菌株，然后以這些突變菌株作為遞推式原生質(zhì)體融合的出發(fā)菌株庫，經(jīng)過多次原生質(zhì)體融合后，株內(nèi)基因組間發(fā)生隨機(jī)重組，最終通過適當(dāng)?shù)暮Y選方法獲得具備目標(biāo)性狀的改良菌株。1996年，Stoyanova等[27]將2個(gè)同源的低產(chǎn)Nisin產(chǎn)生菌L.lactis729和L.lactis1605進(jìn)行原生質(zhì)體融合，篩選出融合子的Nisin產(chǎn)量比融合前提高了10～14倍；張旭等[28]采用超聲波和DES對(duì)原菌株先后進(jìn)行單因素和復(fù)合誘變處理，獲得的突變株S-1、D-1、F-1作為出發(fā)菌株，經(jīng)過2輪原生質(zhì)體融合后，成功選育出一Nisin高產(chǎn)菌株，其Nisin產(chǎn)量較原始菌株提高了69.8%；Zhang等[29]對(duì)原始菌株進(jìn)行紫外誘變和DES兩輪化學(xué)誘變處理后，利用genome shuffling技術(shù)對(duì)初步獲得Nisin突變菌株再進(jìn)行研究，最終收獲菌株的Nisin產(chǎn)量大約是原始菌株的2.43倍，同時(shí)其耐受性也得到很大的提升。實(shí)踐表明，genome shuffling技術(shù)在選育高產(chǎn)Nisin菌株方面成效顯著，這為進(jìn)一步應(yīng)用該技術(shù)選育優(yōu)良菌種提供了參考。

3.3 基因工程方法育種 近年來，隨著分子生物學(xué)理論與技術(shù)的日益成熟，以及對(duì)Nisin的生物合成途徑和代謝調(diào)節(jié)認(rèn)識(shí)的深入，在利用基因工程技術(shù)對(duì)Nisin產(chǎn)生菌進(jìn)行遺傳改造而獲得高產(chǎn)菌株方面也取得一定進(jìn)展。目前主要通過對(duì)Nisin生物合成的相關(guān)基因進(jìn)行過表達(dá)或增加其拷貝數(shù)來提高Nisin合成能力。1998年Kim等[30]將Nisin生物合成相關(guān)的調(diào)控和免疫基因nisRK、nisFEG融合在同一載體pND300上，再導(dǎo)入受體菌中進(jìn)行過表達(dá)，結(jié)果獲得的工程菌Nisin產(chǎn)量比原產(chǎn)生菌提高了20%左右，且其生長速度也明顯加快；2005年Cheigh等[31]試圖通過構(gòu)建表達(dá)載體pOri23-nisZ、pOri23-nisRK、pOri23-nisFEG，并轉(zhuǎn)入Nisin生產(chǎn)菌中以此獲得nisZ、nisRK和nisFEG過表達(dá)的工程菌，結(jié)果nisRK和nisFEG過表達(dá)菌株的Nisin產(chǎn)量均提高了約50%，但菌體的生長速度受到一定影響，而nisZ過表達(dá)菌株的預(yù)期效果不明顯；2014年Kong等[32]構(gòu)建了nisA的單獨(dú)多拷貝載體和nisin合成基因簇的過表達(dá)載體共轉(zhuǎn)化的工程菌，能使Nisin產(chǎn)量提高3.4倍，但菌體生長明顯受限。后又將nisA片段與Nisin合成基因簇整合到同一表達(dá)載體上，同時(shí)優(yōu)化了nisA啟動(dòng)子和發(fā)酵條件，最終得到工程菌的nisin產(chǎn)量達(dá)到原始菌株的6倍多。

國內(nèi)對(duì)于Nisin基因工程方面的研究起步較晚，1995年中國科學(xué)院微生物研究所率先完成了對(duì)乳鏈菌肽的基礎(chǔ)研究，并將選育出的Nisin高產(chǎn)菌株投入生產(chǎn)，實(shí)現(xiàn)了2500 L發(fā)酵罐的放大實(shí)驗(yàn)及中試產(chǎn)品的應(yīng)用試驗(yàn)[33]；樊苗苗等[34]通過構(gòu)建nisA游離型和nisA整合型表達(dá)載體以實(shí)現(xiàn)nisA的過表達(dá)，結(jié)果游離型表達(dá)載體菌株的NisinA產(chǎn)量提高了31%，而整合型菌株的NisinA產(chǎn)量雖也有一定程度的提高，但其生物量明顯降低；Hu等[35]通過增加Nisin產(chǎn)生菌中nisI基因的表達(dá)水平來研究Nisin產(chǎn)量變化，結(jié)果Nisin的產(chǎn)量最多提高了32%，而且工程菌對(duì)Nisin的抗性水平也顯著提高；汪蕊等[36]通過構(gòu)建表達(dá)載體pMG76e-nisRK、pMG76e-nisI-RK以及pmsp3535H4-nisI-nisR-nisK，合成重組菌，結(jié)果前兩組重組菌株的Nisin產(chǎn)量均提高了45%左右，但后一組重組菌株Nisin產(chǎn)量增幅略低，反映了載體啟動(dòng)子表達(dá)效率的相對(duì)強(qiáng)弱對(duì)Nisin產(chǎn)率的直接影響。后來他們又構(gòu)建了含表達(dá)載體pMG76e-nisZBTCI的工程菌，這使Nisin產(chǎn)量提高了約70%。通過RT-PCR檢測(cè)分析了原菌株與重組菌株中Nisin合成基因簇中11個(gè)基因的表達(dá)情況，結(jié)果顯示工程菌的大部分基因都不同程度地上調(diào)了，表達(dá)上調(diào)的基因?qū)isin合成效率的提高具有關(guān)鍵意義。

4 展望

在全社會(huì)都在崇尚綠色安全食品的今天，天然防腐劑乳鏈菌肽日益受到人們的關(guān)注。面對(duì)多年來的理論研究與實(shí)踐應(yīng)用，Nisin作為一種天然食品添加劑的安全性和高效性已經(jīng)無可置疑。同時(shí)，隨著研究的深入，Nisin的應(yīng)用目前已擴(kuò)展到造紙、食品包裝、畜牧業(yè)、生殖、醫(yī)療等領(lǐng)域，其優(yōu)質(zhì)性未來必定還會(huì)受到更多行業(yè)的親睞。鑒于目前Nisin的工業(yè)化產(chǎn)量與實(shí)際應(yīng)用之間的不協(xié)調(diào)狀況，在選擇合適的育種方法以獲得優(yōu)質(zhì)高效的Nisin表達(dá)菌株方面，以上技術(shù)手段已為相關(guān)研究者提供了一些有益的參考，相信隨著生化科技的進(jìn)步和工業(yè)化生產(chǎn)的發(fā)展，實(shí)現(xiàn)Nisin規(guī)?；a(chǎn)必將指日可待。

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(編校：王儼儼)

Research progress on Nisin biosynthesis and breeding of high-yield strains

NI Zhi-jian1, WANG Shao-hua2, LIU Fei2, ZHU Xi-qiang1,2Δ

(1. College of Pharmacy, Shandong University, Ji’nan 250012, China; 2. Postdoctoral Workstation, Pharmaceutical Academy of Sciences of Shandong Province, Ji’nan 250101, China)

Nisin, produced by several strains in the growth process ofLactococcuslactis, is a natural antimicrobial polypeptide.Now, Nisin has served as an effective and safe food additive extensively used in food industry in many countries and regions because of its excellent antimicrobial activity.However, the current production of Nisin is largely fermented by lactobacillus and its industrialized production still can not meet enormous market needs, therefore establishing reasonably high-yield Nisin strains is of great significance.This review mainly summarizes the development pathway of molecule based on the functional expression of Nisin biosynthetic genes and regulation of gene expression, and also the study status on high Nisin-producing strains which provides practical foundation for further study on expected strains as well as some useful guidance for large-scale industrialized production of Nisin.

Nisin; biosynthesis; key genes; regulation; high-yield strains

倪志堅(jiān)，男，碩士在讀，研究方向：生化技術(shù)藥物及發(fā)酵工程，E-mail：mars_pharma@163.com；朱希強(qiáng)，通訊作者，男，博士，研究員，研究方向：生化技術(shù)藥物，E-mail：xistrong@sina.com。

Q939.9

A

1005-1678(2015)06-0171-06