朱雪梅，王曉芬，陳永財(cái)，劉剛，陳凌云

(1.溫州市中醫(yī)院，浙江 溫州 325000；2.溫州市藥檢所，浙江 溫州 325000)

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止咳口服液提取工藝研究

朱雪梅1，王曉芬1，陳永財(cái)1，劉剛1，陳凌云2

(1.溫州市中醫(yī)院，浙江 溫州 325000；2.溫州市藥檢所，浙江 溫州 325000)

目的 優(yōu)選止咳口服液的最佳提取工藝。方法 采用正交實(shí)驗(yàn)法以總黃酮、黃芩苷為評價(jià)指標(biāo)，以提取時(shí)間、溶劑倍量、提取次數(shù)為考察因素，篩選出止咳口服液的最佳提取工藝參數(shù)。結(jié)果 止咳口服液的最佳提取工藝：提取時(shí)間為1 h，溶劑倍量為10倍，提取次數(shù)2次。結(jié)論 該提取工藝可行，試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可以為確定止咳口服液的提取工藝提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

止咳口服液；提取工藝；正交試驗(yàn)；黃芩苷；總黃酮

止咳方來源于溫州市中醫(yī)院呼吸科專家劉剛主任經(jīng)驗(yàn)方，該方由地骨皮、桑白皮、黃芩、木蝴蝶等組成，具有清肺化痰，利咽止咳的功能。該方在臨床上主要以湯劑服用，臨床療效顯著，具備良好的市場前景。但由于湯劑存在口感差，服用劑量大，久貯易霉變、酸敗，攜帶不便等缺點(diǎn)[1-3]，為方便患者服用，將其制備為口服液。

藥材提取工藝的優(yōu)化，是口服液質(zhì)量控制中的重要環(huán)節(jié)。黃芩苷和總黃酮為本方主要有效成分和有效部位，藥理研究表明：黃芩苷具有抗菌、抗病毒等多種活性，總黃酮具有止咳祛痰的多種功效[7]。因此用于治療咳嗽、痰多、咽癢等呼吸道疾病的市售藥品及醫(yī)院制劑，多將黃芩苷、總黃酮作為質(zhì)量控制的重要指標(biāo)[4-6]。本實(shí)驗(yàn)以黃芩苷和總黃酮綜合評分為指標(biāo)，應(yīng)用L9(34)正交試驗(yàn)，選定提取時(shí)間(A)、溶劑倍數(shù)(B)、煎煮次數(shù)(C)作為考察因素，對該制劑的提取制備工藝進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 黃芩苷和蘆丁對照品(均購自中國藥品生物制品檢定所，批號分別為：110715-200514、100080-200707)。甲醇(色譜純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，水為自制的超純水，其他試劑為分析純。

1.2 儀器 UV-1800型紫外可見分光光度計(jì)(上海美普達(dá)儀器有限公司)；LC-20AT型高效液相色譜儀(日本Shimadzu公司)；SPD-10Avp紫外可見檢測器(日本Shimadzu公司)。

1.3 方法

1.3.1 正交試驗(yàn)優(yōu)選口服液提取最佳工藝：以預(yù)試驗(yàn)中單因素考察結(jié)果為參考依據(jù)，選擇影響藥材提取效果的提取時(shí)間 (A)、溶劑倍數(shù)(B)、煎煮次數(shù)(C)作為考察因素, 每個(gè)因素設(shè)置3個(gè)水平，以總黃酮和黃芩苷含量為評價(jià)指標(biāo)，L9(34)正交試驗(yàn)因素水平表，見表1。

表1 正交因素設(shè)計(jì)表Tab.1 Table of orthogonal factor design

1.3.2 總黃酮含量測定：

① 對照品溶液的制備：精密稱取蘆丁對照品10 mg，置于50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制得每1 mL含0.2 mg蘆丁對照品溶液。

② 供試品溶液的制備：稱取水提浸膏0.2 g，置于50 mL容量瓶中，加甲醇25 mL，搖勻，超聲30 s，用甲醇稀釋至刻度，制得水提供試品溶液；

③ 供試品測定方法：精密量供試品溶液各3 mL，分別置于25 mL量瓶中，加5% NaNO2溶液1 mL，搖勻，靜置6 min，再加人10% Al(NO3)3溶液1 mL，搖勻，繼續(xù)靜置6 min，加4%的NaOH溶液5 mL，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，靜置15 min，于510 nm波長處測定吸光度。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線：按照“1.3.2”項(xiàng)下方法，分別精密吸取對照品溶液3、4.5、6、7.5、9、10 mL，分別置于25 mL量瓶中，加5% NaNO3溶液1 mL，搖勻，靜置6 min，再加人10% Al(NO3)3溶液1 mL，搖勻，繼續(xù)靜置6 min，加4%的NaOH溶液5 mL，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，靜置15 min，得濃度分別為24、36、48、60，72，80 μg/mL，于510 nm波長處測定吸光度。

1.3.4 精密度試驗(yàn)：按照“1.3.2”項(xiàng)下方法，精密吸取蘆丁對照品溶液10 μL, 連續(xù)平行進(jìn)樣6次，測定各吸光度。

1.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一水提供試品溶液，分別于0、15、30、45、60、120 min進(jìn)行測定。

1.3.6 重復(fù)性試驗(yàn)：精密稱量同一水提供試品浸膏6份，同法制備供試品溶液，按照“1.3.3”項(xiàng)下方法，于510 nm波長處測定吸光度。

1.3.7 回收率試驗(yàn)：精密稱量已知含量的供試品溶液6份，分別精密加入36 μg/mL蘆丁對照品溶液2 mL，按照“1.3.2”項(xiàng)下，制備供試品溶液6份，進(jìn)行測定，計(jì)算回收率。

1.4 黃芩苷含量測定

1.4.1 對照品溶液的制備：精密稱取黃芩苷對照品2.20 mg置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，制得每1 mL含0.22 mg黃芩苷對照品溶液。

1.4.2 供試品溶液的制備：精密量取1 mL水提取液，放入蒸發(fā)皿中蒸干成浸膏，加入適量甲醇溶液溶解移置10 mL的容量瓶中，并用甲醇定容至10 mL，超聲30 min，補(bǔ)足減失重量，溶液通過0.45 μm微孔濾膜濾過，即得黃芩苷供試品溶液。

1.4.3 陰性樣品溶液的制備：按止咳方口服液最佳工藝，制備不含黃芩與木蝴蝶藥材的陰性對照樣品溶液。方法同“1.4.2”項(xiàng)下。

1.4.4 色譜條件與檢測波長：Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)填充劑為十八烷基鍵合硅膠；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫為30 ℃；流動(dòng)相：乙腈:0.1%磷酸水=25:75。

1.4.5 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)：分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀。測得黃芩苷對照品，止咳方供試品及其陰性對照溶液的色譜圖。

1.4.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線：按照“1.4.1”項(xiàng)下分別精密對照品溶液0.1、0.5、1、1.5、2、3 mL，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，得到黃芩苷對照品稀釋液。按照上述色譜條件進(jìn)行測定，記錄峰面積。

1.4.7 精密度試驗(yàn)：精密吸取“1.4.2”項(xiàng)下供試品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，測定各組分的峰面積值(n=5)。

1.4.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液，分別于0、1、2、4、8、10、12、24 h進(jìn)樣測定。

1.4.9 重復(fù)性試驗(yàn)：精密量取同一批供試品溶液，按照上述方法平行制備6份，按照“1.4.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定。

1.4.10 加樣回收率試驗(yàn)：精密稱量已知含量的供試溶液6份，精密吸取每份供試品溶液0.05 mL，分別精密加入同一溶度對照品溶液1 mL，按“1.4.2”項(xiàng)下方法制備得供試品溶液6份，進(jìn)行測定，計(jì)算回收率。

1.5 止咳口服液中總黃酮和黃芩苷的含量測定 按照“1.4.2”項(xiàng)下制備供試品，在510 nm測定吸收度，計(jì)算總黃酮含量。按照“1.3.2”項(xiàng)下制備成供試品溶液，精密吸取20 μL注入液相色譜儀，按照“1.4.4”項(xiàng)下進(jìn)行分析，每份樣品平行測定3份，采用外標(biāo)法計(jì)算黃芩苷含量。

2 結(jié)果

2.1 總黃酮含量測定

2.1.1 總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線：以吸光度(Y)對其濃度(C)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=0.0109C+0.036(r=0.999)，結(jié)果表明，蘆丁在24～80 μg/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系均良好。

2.1.2 精密度試驗(yàn)：結(jié)果顯示RSD小于0.50%，表明儀器精密度良好。

2.1.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)：結(jié)果顯示RSD小于2.25%，表明供試品溶液在2 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.4 重復(fù)性試驗(yàn)：結(jié)果顯示RSD小于0.81%，證明重復(fù)性良好。

2.1.5 回收率試驗(yàn)：平均加樣回收率為101.23%，RSD為2.62%，表明本方法準(zhǔn)確可靠。見表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)Tab.2 Results of sample recovery test(n=6)

2.2 黃芩苷含量測定

2.2.1色譜條件與檢測波長：根據(jù)文獻(xiàn)[3-5]結(jié)果，確定黃芩苷HPLC的檢測波長為270 nm。

2.2.2 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)：結(jié)果顯示，在以上色譜條件下，各指標(biāo)的色譜峰與相鄰成分達(dá)到基線分離，陰性對照液中色譜峰對測定無干擾，見圖1。

圖1 HPLC色譜圖(A.黃芩苷對照品；B.黃芩苷供試品；C.陰性對照品)Fig.1 HPLC chromatogram(A.Baicalin reference substance;B.Baicalin test samples;C.Negative reference substance)

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線：分別黃芩苷的峰面積對其濃度進(jìn)行線性回歸，得回歸方程式Y(jié)=31058X-41837，r=0.9999，線性范圍為2.2～220.0 μg/mL結(jié)果表明，黃芩苷在該范圍內(nèi)線性關(guān)系均良好。

2.2.4 精密度試驗(yàn)：計(jì)算得黃芩苷的峰面積的RSD為0.25%，表明該HPLC方法儀器精密度良好。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)：黃芩苷峰面積在24 h內(nèi)RSD小于0.55%，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn)：黃芩苷RSD分別為0.46%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.7 加樣回收率試驗(yàn)：黃芩苷平均加樣回收率為101.04%，RSD分別為2.85%，表明該方法準(zhǔn)確可靠。見表3。

表3 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)Tab.3 Results of sample recovery test(n=6)

2.2.8 止咳口服液中總黃酮和黃芩苷的含量測定：按照正交實(shí)驗(yàn)L9(34)設(shè)計(jì)，以總黃酮的提取量為評價(jià)指標(biāo)，極值BA3>A1、C2>C3>C1，見表5。以黃芩苷的提取量為評價(jià)指標(biāo)，極值BC3>C1，見表6。由表5、6可知，B因素均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。綜上所述，結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)，確定生產(chǎn)條件為A2B3C2，即提取時(shí)間為1 h，溶劑倍量為10倍，提取次數(shù)2次。

表4 止咳口服液中總黃酮和黃芩苷的含量(mg/g)Tab.4 Contents of total flavonoids and baicalin in the Zheke oral liquid(mg/g)

表5 總黃酮方差分析表Tab.5 Analysis of total flavone variance

表6 黃芩苷方差分析表Tab.6 Analysis of variance of baicalin

3 討論

止咳方中黃芩、木蝴蝶、桑白皮均具有黃酮類成分，該類成分具有鎮(zhèn)痛、抗炎、調(diào)節(jié)免疫、鎮(zhèn)咳、祛痰和平喘等功效，是止咳方的主要有效成分之一。其中，黃芩苷是止咳方黃酮類成分中最主要的藥效物質(zhì)，具有抗菌、抗病毒等的多種作用。因此，通過測定黃芩苷、總黃酮的含量、能較準(zhǔn)確地控制止咳口服液的質(zhì)量[8-10]。

本研究采用正交試驗(yàn)法，以總黃酮和黃芩苷作為檢測指標(biāo)，考察復(fù)方止咳口服液的制備工藝。本試驗(yàn)得出，止咳口服液的最佳制備工藝為提取時(shí)間為1 h，溶劑倍量為10倍，提取次數(shù)2次。本研究不僅建立了復(fù)方止咳口服液的制備工藝，同時(shí)也建立了口服液中多組分含量測定方法，既符合中藥復(fù)方多靶點(diǎn)，多組分的特點(diǎn)，也為復(fù)方口服液的質(zhì)量控制提供了內(nèi)控依據(jù)。

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(編校：王冬梅)

Study on extraction technology of Zhike oral liquid

ZHU Xue-mei1, WANG Xiao-fen1, CHEN Yong-cai1, LIU Gang1, CHEN Ling-yun2

(1.Wenzhou Hospital of TCM, Wenzhou 325000, China; 2.Wenzhou Institute of Drug Control, Wenzhou 325000, China)

ObjectiveTo establish the best extraction technology of Zhike oral liquid. MethodsUsing orthogonal experiment method, total flavonoids and baicalin as evaluation index, extraction time, solvent times, extraction times as factors, the optimal extraction process parameters were selected. ResultsThe best extraction process of Zhike oral liquid: extraction time was 1h, solvent amount was 10 times, 2 times of extraction. ConclusionThe extraction process is feasible, the test result is accurate and reliable, which can provide the experimental basis for the extraction process of Zheke oral liquid.

Zhike oral liquid; extraction technology; orthogonal design; baicalin; total flavonoids

溫州市中醫(yī)藥科研課題(2014ZB018)；杭州市重大科技創(chuàng)新專項(xiàng)(No.20131813A23)

朱雪梅，女，本科，副主任中藥師，研究方向：中藥飲片質(zhì)量控制,E-mail：zhuxuemei33@163.com。

TQ461

A

1005-1678(2015)06-0140-03