孫 河，趙曉龍

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱150040;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱150040)

青光眼(glaucoma)以其不可逆性和高致盲性備受眼科界的關(guān)注，而視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGCs)凋亡［1］則是其主要機(jī)制。在誘導(dǎo)RGCs 凋亡的諸多因素中，谷氨酸(Glu)［2］和一氧化氮(NO)［3］在視網(wǎng)膜中含量的變化為當(dāng)前研究熱點(diǎn)。有研究發(fā)現(xiàn)，即使眼壓控制后視功能仍不斷損失［4］，故如何有效保護(hù)視神經(jīng)非常重要，中醫(yī)藥在改善視功能、保護(hù)視神經(jīng)方面療效獨(dú)到。筆者前期就針刺、中藥通竅明目IV 號(hào)分別進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究，通過影響NO、Glu 在視網(wǎng)膜中的含量，而對(duì)視神經(jīng)有保護(hù)作用。本研究探討針?biāo)幉⒂脤?duì)慢性高眼壓兔視網(wǎng)膜NO 和Glu 含量的影響，探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的日本純種健康大耳白兔60 只，體重2.5 ～3.5 kg，兔齡12 ～16個(gè)月，雌雄兼用。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

通竅明目IV 號(hào)由柴胡、葛根、當(dāng)歸、郁金等中藥按一定比例配伍而成，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬一院藥劑科提供中藥材，并由本校制劑室負(fù)責(zé)加工的濃度為每1 ml 含生藥1 g 的混懸液，保持無菌密封，冰箱4℃保存?zhèn)溆?西藥腦蛋白水解物注射液(曲奧)由哈爾濱松鶴制藥有限公司提供。

1.3 儀器及試劑

眼科手術(shù)顯微鏡(蘇州醫(yī)療器械設(shè)備廠，型號(hào):YZZOT);眼科顯微手術(shù)器械(蘇州醫(yī)療器械廠);TONG-PEN 筆式眼壓計(jì)(美國(guó)Medtronic solar 公司，型號(hào):XL);一氧化氮試劑盒(南京建成生物工程研究所);卡波姆-940(北京國(guó)人逸康科技有限公司);谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)品(江西本草天工);戊巴比妥鈉(上海化學(xué)試劑廠分裝)等。

1.4 造模與分組

造模:①麻醉:實(shí)驗(yàn)兔以耳緣靜脈注射法予以全身麻醉(2%戊巴比妥鈉20 mg/kg)，并予0.4%倍諾喜眼液(鹽酸奧布卡因)滴眼行局部麻醉;②高眼壓造模:造膜眼抽取房水0.15 ml 后，前房?jī)?nèi)注射0.3%復(fù)方卡波姆(0.3%卡波姆和0.25%地塞米松的復(fù)方卡波姆溶液，PH 值為4)0.15 ml;③眼壓監(jiān)測(cè):以Tong-pen眼壓計(jì)每日行眼壓監(jiān)測(cè)，慢性高眼壓模型標(biāo)準(zhǔn)為眼壓＞22 mmHg(2.93 kPa)并維持20 天，如眼壓＜22 mm-Hg (1 mmHg=0.133 kPa)，7 天后按上述方法重復(fù)注藥1 次;④降眼壓:慢性高眼壓維持28 天后行改良小梁切除術(shù)。即制備鞏膜瓣后于瓣下角膜緣切一小口，緩慢放出房水，待眼壓下降后沖洗前房，清除卡波姆，并行小梁及周邊虹膜切除術(shù)，術(shù)后結(jié)膜下注射地塞米松1 mg、慶大霉素0.5 萬U，眼壓降至正常，觀察1 周。

分組:隨機(jī)將60 只實(shí)驗(yàn)兔分出20 只作為正常對(duì)照組，其余40 只造模成功后隨機(jī)分為模型組和治療組，每組20 只。共120 只眼。

1.5 治療方法

正常對(duì)照組不予治療。

治療組:①針刺治療:雙側(cè)球后、風(fēng)池及行間穴，常規(guī)消毒后，球后進(jìn)針時(shí)沿眶壁刺入至眶尖部，風(fēng)池、行間進(jìn)針約0.5 寸(腧穴定位以中國(guó)針灸學(xué)會(huì)實(shí)驗(yàn)針灸研究會(huì)制定的“動(dòng)物針灸穴位圖譜”進(jìn)行);②中藥治療:通竅明目IV 號(hào)3 g/kg·d 灌胃(根據(jù)體表面積計(jì)算法，相當(dāng)于成人等效治療量);③神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)劑治療:腦蛋白水解物注射液0.2 ml/kg·d，于實(shí)驗(yàn)兔臀部或股部肌肉注射。

模型組:①生理鹽水灌胃，劑量為4 ml/kg·d;②0.9%生理鹽水注射液0.2 ml/kg·d，于實(shí)驗(yàn)兔臀部或股部肌肉注射。

以上治療均為每日1 次，持續(xù)1 個(gè)月。

1.6 觀測(cè)指標(biāo)與測(cè)試方法

治療1 月后，采用耳緣靜脈空氣栓塞法處死各組動(dòng)物。

NO 標(biāo)本制備及測(cè)定:各組隨機(jī)取10 只動(dòng)物摘除眼球(20 只眼)，立即在冰上沿角膜緣剪開眼球，去除晶體、玻璃體，剝?nèi)∫暰W(wǎng)膜，濾紙吸干表面水分并稱重，以濕重按1:20 用冰生理鹽水稀釋，并用玻璃勻漿器于冰水中勻漿。組織勻漿液10 000 轉(zhuǎn)/min，離心10 min，取上清液，沸水浴3 min，10 000 轉(zhuǎn)/min，離心5 min，取其上清液采用一氧化氮酶法測(cè)定。

Glu 標(biāo)本制備及測(cè)定:各組余下10 只動(dòng)物(20 只眼)去除晶體、玻璃體后，立即用無水乙醇固定30 s。剝離視網(wǎng)膜并稱重。轉(zhuǎn)移至勻漿器加無水乙醇1 ml冰上勻漿，勻漿充分后轉(zhuǎn)入離心管，4℃15 000 轉(zhuǎn)/min，離心20 min。取上清液采用鄰苯二甲醛柱前衍生法，高效液相色譜儀與熒光光度檢測(cè)器測(cè)定樣品中的氨基酸，根據(jù)氨基酸的色譜峰面積，采用外算法計(jì)算樣品中的Glu 含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 針?biāo)幉⒂脤?duì)兔視網(wǎng)膜NO 含量的影響

表1 各組兔視網(wǎng)膜NO 含量比較(±s)

表1 各組兔視網(wǎng)膜NO 含量比較(±s)

注:與對(duì)照組比較，▲▲P ＜0.01;與模型組比較，* P ＜0.05。

組別 眼數(shù)(n) NO(u mol/g)對(duì)照組40 22.24 ±3.68模型組 40 37.41 ±4.67▲▲治療組 40 31.89 ±3.58▲▲＊

由表1 可見，與對(duì)照組相比，治療組和模型組兔視網(wǎng)膜中NO 含量均有升高。模型組與對(duì)照組比較，視網(wǎng)膜中NO 的含量差異有顯著性(P ＜0.01)。治療組與模型組之間差異有顯著性(P ＜0.05)。治療組與對(duì)照組之間差異有顯著性(P ＜0.01)。

2.2 針?biāo)幉⒂脤?duì)兔視網(wǎng)膜Glu 含量的影響

由表2 可見，與對(duì)照組比較，兔視網(wǎng)膜中Glu 的含量均升高。模型組與對(duì)照組比較，視網(wǎng)膜中Glu 的含量差異有顯著性(P ＜0.01)。治療組與模型組之間差異有顯著性(P ＜0.01)，治療組與對(duì)照組之間差異有顯著性(P ＜0.01)。

表2 各組兔視網(wǎng)膜Glu 含量比較(±s)

表2 各組兔視網(wǎng)膜Glu 含量比較(±s)

注:與對(duì)照組比較，▲▲P ＜0.01;與模型組比較，* P ＜0.01。

組別 眼數(shù)(n) Glu (10 -5 mmol/g)對(duì)照組40 25.28 ±4.58模型組 40 53.01 ±6.86▲▲治療組 40 42.58 ±4.15▲▲＊

3 討論

NO 是體內(nèi)重要的信使分子和效應(yīng)分子，是近年來研究較多的一種神經(jīng)遞質(zhì)，對(duì)眼內(nèi)壓和眼血流有調(diào)節(jié)作用［5］。生理狀態(tài)下，NO 主要由一氧化氮合成酶催化生成，發(fā)揮神經(jīng)遞質(zhì)的作用，但在病理狀態(tài)下如創(chuàng)傷、缺血、細(xì)胞因子等被誘導(dǎo)后可產(chǎn)生過量NO，線粒體膜去極化，自由基生成增多，使細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加，破壞呼吸鏈，加速能量消耗，損傷DNA，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡［6］。

Glu 是大量存在于腦部中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，具有含量最高、分布最廣、作用最強(qiáng)等特點(diǎn)。生理狀態(tài)下谷氨酸作為一種神經(jīng)遞質(zhì)，傳遞生物信號(hào);在病理情況下，谷氨酸大量釋放而攝取減少，與視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞表面的N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體結(jié)合，經(jīng)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)，引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載，并隨之激活一氧化氮合成酶，誘導(dǎo)NO 過量生成，具有氧化特性的一氧化氮與線粒體釋放的超氧陰離子結(jié)合，形成具有強(qiáng)毒性的過氧亞銷酸根離子，致使RGCs抵抗力下降，細(xì)胞膜通透性增強(qiáng)，促使凋亡發(fā)生，同時(shí)，凋亡的RGCs 又釋放高濃度的谷氨酸，興奮性谷氨酸再損傷RGCs，形成惡性循環(huán)。

目前尚無確切藥物對(duì)視神經(jīng)保護(hù)具有明確作用，中醫(yī)藥治療顯示出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。通竅明目IV 號(hào)即為本課題組多年臨床驗(yàn)方，前期臨床研究表明用藥后患者視力提高，視野平均光敏度增強(qiáng)，視野缺損面積減小，視神經(jīng)電生理活動(dòng)增強(qiáng)，同時(shí)還具有擴(kuò)張外周血管、改善微循環(huán)、抗氧化、抗血小板聚集的作用［7］。實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，其可減輕高眼壓兔視網(wǎng)膜及視神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)的損傷程度，抑制NO、Glu 的毒性作用，對(duì)視網(wǎng)膜抗凋亡基因Bcl-xl 和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子BDNF 的表達(dá)亦有上調(diào)作用，并可明顯改善VEP 的P1 波潛伏期及振幅［8］。

針刺為祖國(guó)醫(yī)藥的重要部分，被視為“綠色醫(yī)療”，就其對(duì)視神經(jīng)的保護(hù)作用，本課題組在大量臨床研究中發(fā)現(xiàn)針刺可以提高患者視力，視覺誘發(fā)電位振幅也相應(yīng)提高，潛伏期縮短;視野平均光敏度顯著增加，平均缺損率減少;而視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層的厚度影響均不明顯［9］。實(shí)驗(yàn)研究中顯示針刺治療后視網(wǎng)膜增厚，外核層亦可見增厚，內(nèi)核層空泡結(jié)構(gòu)減少，細(xì)胞數(shù)量亦增加;兔視網(wǎng)膜中NO 及Glu 含量明顯降低;兔節(jié)細(xì)胞BDNF 蛋白表達(dá)顯色強(qiáng)度加強(qiáng)，Bcl-xl 表達(dá)陽(yáng)性反應(yīng)范圍擴(kuò)大，節(jié)細(xì)胞、視桿內(nèi)節(jié)出現(xiàn)較強(qiáng)的陽(yáng)性反應(yīng);節(jié)細(xì)胞層出現(xiàn)部分空泡，內(nèi)核層及內(nèi)網(wǎng)狀層部分萎縮，視細(xì)胞內(nèi)外節(jié)水腫、斷裂或溶解等均有減輕。

針?biāo)幗Y(jié)合對(duì)視神經(jīng)保護(hù)的臨床研究中顯示，針?biāo)幹委熃M提高視力的有效率達(dá)86.67%，西藥對(duì)照組有效率達(dá)63.33%，治療組優(yōu)于對(duì)照組;視野變化，治療對(duì)照兩組均出現(xiàn)平均光敏度增強(qiáng)、平均缺損降低;視誘發(fā)電位方面，治療對(duì)照兩組均有P100 振幅增加、潛伏期縮短。實(shí)驗(yàn)研究表明，針?biāo)幉⒂每梢栽鰪?qiáng)視網(wǎng)膜上Bcl-xl 蛋白、BDNF 的表達(dá)，且優(yōu)于單純針刺組［10-11］。

青光眼歸類于中醫(yī)學(xué)之“五風(fēng)障”，屬瞳神疾病，根據(jù)其發(fā)展不同程度晚期亦可歸屬“青盲”、“視瞻昏渺”等范疇。筆者依據(jù)肝竅學(xué)說，認(rèn)為青光眼為七情所犯，肝郁氣結(jié)，氣郁不得疏泄，無以助血運(yùn)行，導(dǎo)致眼部氣血瘀滯閉塞目竅，神光不得發(fā)越，致使視物昏蒙，因此以“疏肝開竅”為法，采用針刺結(jié)合通竅明目IV號(hào)及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，探討其對(duì)青光眼視神經(jīng)保護(hù)的作用機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物模型制備采用課題組多年臨床經(jīng)驗(yàn)，即兔眼前房注射0.3%復(fù)方卡波姆溶液制作慢性高眼壓模型［12］，而后采用改良小梁切除將眼壓恢復(fù)正常。此種造模成功率高，造模穩(wěn)定，制備方法與人類青光眼發(fā)病特點(diǎn)相似，為課題的順利完成提供了保障。通過本研究證實(shí)，針刺聯(lián)合通竅明目IV 號(hào)及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)劑綜合治療能有效減少NO、Glu 在視網(wǎng)膜中的含量，從而發(fā)揮其對(duì)視神經(jīng)的保護(hù)作用。就其作用機(jī)理可能是通過影響視網(wǎng)膜微環(huán)境，改善微循環(huán)，維持其能量供給，抑制鈣離子的細(xì)胞內(nèi)流，減少一氧化氮合成酶的生成，阻斷NO 和Glu 惡性循環(huán)的產(chǎn)生，阻止RGCs調(diào)亡，進(jìn)而產(chǎn)生視神經(jīng)保護(hù)作用。本研究樣本基數(shù)大，但未能進(jìn)行各組單一治療及聯(lián)合治療對(duì)比，有待今后實(shí)驗(yàn)研究中得以進(jìn)一步的完善。

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