郭曼，趙園園，何信佳，于麗，張蕊，葉寶玲

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院，1.腫瘤科;2.檢驗(yàn)科，山東 青島 266000)

胃癌是中國(guó)最常見的消化道惡性腫瘤，多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已屬中晚期，僅通過手術(shù)難以治愈［1］?；熥鳛橹匾闹委熓侄危鸬母喂δ軗p害，嚴(yán)重的藥物性肝損傷使得患者不能按期完成化療或不能承受應(yīng)用劑量，從而影響治療效果［2］。異甘草酸鎂(magnesium isoglycyrrhizinate，MgIG)是一種臨床常用的保肝藥物，在治療化療藥物性肝損害時(shí)具有肝功恢復(fù)快、不良反應(yīng)少的優(yōu)點(diǎn)［3－4］。本研究建立人胃癌裸鼠皮下移植瘤模型，通過MgIG結(jié)合奧沙利鉑(oxaliplatin，L-OHP)對(duì)動(dòng)物模型的干預(yù)，探討MgIG對(duì)L-OHP抗腫瘤作用的影響，為MgIG在臨床中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株和動(dòng)物

人胃癌細(xì)胞株SGC-7901由青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心惠贈(zèng)。BALB/c雄性裸小鼠60只，周齡5～6周，體質(zhì)量18～23 g，購(gòu)自購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于中國(guó)海洋大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院分子藥理實(shí)驗(yàn)室。

1.2 藥品與試劑

MgIG注射液(國(guó)藥準(zhǔn)字H20051942)購(gòu)自江蘇正大天晴藥業(yè)股份有限公司;L-OHP(國(guó)藥準(zhǔn)字H20000337)購(gòu)自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司;DMEM培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.3 細(xì)胞的培養(yǎng)和人胃癌裸鼠模型的建立

人胃癌細(xì)胞株SGC-7901在DMEM培養(yǎng)液(含體積分?jǐn)?shù) 0.1滅活胎牛血清、10 U/L青霉素、10 U/L鏈霉素)，在37℃下于體積分?jǐn)?shù)0.05的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將處于數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞運(yùn)用胰酶消化，用PBS液稀釋，制備成細(xì)胞密度為4×1010/L的單細(xì)胞懸液。在超凈工作臺(tái)內(nèi)于裸鼠右腋下皮下注射0.2 mL細(xì)胞懸液，10 d后所有裸鼠右腋下均出現(xiàn)長(zhǎng)徑約5～8 mm的皮下結(jié)節(jié)，提示移植瘤模型建立成功。

1.4 分組與處理

將60只人胃癌裸鼠移植瘤模型隨機(jī)分為6組，每組 10只:高(40 mg/kg)、中(20 mg/kg)、低(10 mg/kg)劑量MgIG聯(lián)合L-OHP組(6 mg/kg)、單純L-OHP(6 mg/kg)組、單純MgIG(20 mg/kg)和葡萄糖對(duì)照組(5%葡萄糖注射液0.2 mL)。L-OHP每3 d給藥1次，MgIG和葡萄糖均為1次/d給藥。L-OHP和MgIG均用5%葡萄糖溶液稀釋，給藥途徑均為尾靜脈注射給藥，0.2 mL/只，連續(xù)用藥14 d。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)

自首次給藥起，連續(xù)監(jiān)測(cè)裸鼠一般情況，每2 d用游標(biāo)卡尺測(cè)量移植瘤大小一次，記錄長(zhǎng)徑(a)和短徑(b)，腫瘤體積=(ab2)/2［5］。并測(cè)定裸鼠體質(zhì)量。停藥后第2天用摘眼球取血法采集血樣，用于檢測(cè)裸鼠肝功能，主要包括丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)。處死裸鼠后剝離腫瘤組織，稱取瘤質(zhì)量，計(jì)算質(zhì)量抑瘤率，抑瘤率(瘤質(zhì)量)=(對(duì)照組平均瘤質(zhì)量－實(shí)驗(yàn)組平均瘤質(zhì)量)/對(duì)照組平均瘤質(zhì)量×100%;測(cè)量移植瘤體積，計(jì)算體積抑瘤率，抑瘤率(瘤體積)=(對(duì)照組平均瘤體積－實(shí)驗(yàn)組平均瘤體積)/對(duì)照組平均瘤體積×100%。TUNEL法檢測(cè)移植瘤細(xì)胞凋亡率，操作方法嚴(yán)格按照試劑盒說明，每張切片隨機(jī)選取10個(gè)視野在400倍鏡下計(jì)數(shù)，計(jì)算凋亡細(xì)胞百分比及其標(biāo)準(zhǔn)差，陽性細(xì)胞率=陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。裸鼠腫瘤組織于－70℃冰箱保存?zhèn)錂z。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x－±s)表示，兩組間均數(shù)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，組間差異采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 裸鼠一般情況

各組裸鼠均于接種10 d后成瘤明顯，成瘤率及移植瘤大小無明顯差異，對(duì)各組移植瘤大小進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)示方差齊(P=0.376)，方差分析顯示各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.801，P ＞0.05)。見表1。

給藥期間，各組裸鼠均未出現(xiàn)死亡，移植瘤未出現(xiàn)破潰，不同劑量MgIG聯(lián)合L-OHP組裸鼠出現(xiàn)不同程度的消瘦，精神狀態(tài)稍差，進(jìn)食、飲水尚可，大小便正常;單純L-OHP組裸鼠消瘦明顯，進(jìn)食量最少，精神萎靡，出現(xiàn)不同程度腹瀉。單純MgIG和葡萄糖對(duì)照組裸鼠精神狀態(tài)好、進(jìn)食正常，大小便正常，較活躍。處死裸鼠并解剖，各組均未見腹水及其他部位轉(zhuǎn)移病灶。與用藥前比較，高、中、低劑量MgIG聯(lián)合L-OHP組和單純L-OHP組裸鼠用藥后體質(zhì)量有不同程度的降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

表1 接種10 d后各組裸鼠成瘤大小比較(mm3)

表2 用藥前后裸鼠的體質(zhì)量變化(g±s，n=10)

表2 用藥前后裸鼠的體質(zhì)量變化(g±s，n=10)

高劑量MgIG聯(lián)合L-OHP組24.58 ±1.71 21.74 ±1.58 －2.84 ±0.47 3.89 ＜0.05中劑量MgIG 聯(lián)合 L-OHP組 24.81±1.30 22.06±1.34 －2.75±0.89 4.65 ＜0.01低劑量MgIG 聯(lián)合 L-OHP組 24.55±1.10 21.77±1.21 －2.79±0.84 5.40 ＜0.01單純 L-OHP 組 25.04 ±0.99 21.56 ±1.04 －3.48 ±0.46 7.67 ＜0.01單純 MgIG 組 24.61 ±1.09 25.31 ±1.09 0.70 ±0.40 1.44 ＞0.05葡萄糖對(duì)照組25.03 ±1.20 25.27 ±1.26 0.24 ±0.60 0.44 ＞0.05

2.2 各組裸鼠移植瘤生長(zhǎng)曲線

給藥后，各劑量MgIG聯(lián)合L-OHP組及單純LOHP組的皮下移植瘤生長(zhǎng)速度低于葡萄糖對(duì)照組及單純MgGI組。單純MgGI組和葡萄糖對(duì)照組移植瘤生長(zhǎng)曲線較陡，高、中劑量MgIG聯(lián)合L-OHP組生長(zhǎng)曲線較緩，低劑量MgIG聯(lián)合L-OHP組和單純L-OHP組介于上述兩者之間。見圖1。

圖1 各組裸鼠胃癌移植瘤生長(zhǎng)曲線

2.3 各組移植瘤的瘤體積、瘤質(zhì)量相應(yīng)抑瘤率比較

移植瘤體積變化方面，與葡萄糖對(duì)照組相比，高、中、低劑量MgIG聯(lián)合L-OHP組及單純L-OHP組表現(xiàn)出了明顯的抗腫瘤作用，體積抑瘤率分別為46.92%、43.03%、40.08%、35.53%，移植瘤體積減少幅度隨著MgIG劑量的增加而增加(F=611.39，P＜0.05)，提示與L-OHP聯(lián)用時(shí)，MgIG提高了奧沙利鉑的抗腫瘤作用，并且呈劑量依賴性。此外，與葡萄糖對(duì)照組相比，單純MgIG組未表現(xiàn)出明顯的抗腫瘤作用，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);高、中、低劑量MgIG聯(lián)合L-OHP組與單純L-OHP組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表3和圖2。

移植瘤質(zhì)量變化方面，與葡萄糖對(duì)照組相比，高、中、低劑量MgIG聯(lián)合L-OHP組及單純L-OHP組表現(xiàn)出了明顯的抗腫瘤作用，質(zhì)量抑瘤率分別為44.61%、41.62%、39.21%、35.12%，移植瘤質(zhì)量減少幅度隨著MgIG劑量的增加而增加(F=337.60，P＜0.05)。此外，與葡萄糖對(duì)照組相比，單純MgIG組未表現(xiàn)出明顯的抗腫瘤作用，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);高、中、低劑量MgIG聯(lián)合 L-OHP組與單純 L-OHP組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);組間兩兩比較，高、低劑量MgIG聯(lián)合L-OHP組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表3和圖2。

表3 各組移植瘤的瘤體積、瘤質(zhì)量抑瘤率比較(n=10)

圖2 用藥后各組移植瘤的瘤體積、瘤質(zhì)量抑瘤率比較

2.4 各組裸鼠移植瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)比較

高、中、低劑量 MgIG聯(lián)合 L-OHP組，單純 LOHP組，單純MgIG組及葡萄糖對(duì)照組的細(xì)胞凋亡指數(shù)分別為(15.62 ±1.63)%、(15.59 ±2.15)%、(14.57 ± 2.39)%、(13.74 ± 1.89)%、(3.79 ±1.19)%和(3.58±0.92)%。各劑量MgIG聯(lián)合LOHP及單純L-OHP組的細(xì)胞凋亡指數(shù)均高于單純MgIG組及葡萄糖對(duì)照組(F=112.04，P ＜0.05);高、中劑量MgIG聯(lián)合L-OHP組的凋亡指數(shù)高于單純L-OHP組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);低劑量MgIG聯(lián)合L-OHP組與單純L-OHP組的凋亡指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);高、中劑量MgIG聯(lián)合L-OHP組的凋亡指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見圖3。

圖3 各組裸鼠移植瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)比較

2.5 各組裸鼠肝功能比較

與葡萄糖對(duì)照組相比，單純L-OHP組ALT、AST顯著升高，各劑量MgIG聯(lián)合L-OHP組均顯著降低，其中以高劑量MgIG聯(lián)合L-OHP降低幅度最大。AST水平變化方面，高劑量MgIG聯(lián)合L-OHP組、單純MgIG組及葡萄糖對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);中、低劑量 MgIG聯(lián)合 L-OHP組及單純 LOHP組與葡萄糖對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。ALT水平變化方面，高劑量MgIG聯(lián)合L-OHP組、單純MgIG組及葡萄糖對(duì)照組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);中、低劑量 MgIG聯(lián)合 LOHP組及單純L-OHP組與葡萄糖對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)。見表4。

表4 各組裸鼠肝功能的比較±s，n=10)

表4 各組裸鼠肝功能的比較±s，n=10)

高劑量MgIG聯(lián)合L-OHP組138.36 ±22.06 59.83 ±12.74中劑量 MgIG 聯(lián)合 L-OHP 組 154.88 ±19.69 70.26 ±10.19低劑量 MgIG 聯(lián)合 L-OHP 組 173.19 ±16.45 87.30 ±8.11單純 L-OHP 組 276.23 ±17.82 157.79 ±16.13單純 MgIG 組 135.24 ±17.36 54.91 ±13.58葡萄糖對(duì)照組127.50 ±16.16 59.30 ±8.94

3 討論

對(duì)于不能手術(shù)切除的中晚期胃癌患者，化療是主要的治療措施。然而化療藥物經(jīng)過肝臟代謝和排泄，可造成不同程度的肝損傷。臨床研究證實(shí)，保肝藥物與化療藥物聯(lián)用時(shí)，可降低肝損傷的發(fā)生［6］，然而是否會(huì)影響化療藥物的療效目前尚存在爭(zhēng)議。本研究通過建立裸鼠移植瘤模型，觀察L-OHP聯(lián)合不同劑量的MgIG對(duì)裸鼠移植瘤抑瘤率及凋亡指數(shù)的影響，以探討MgIG對(duì)L-OHP抗腫瘤作用的影響。通過比較各組裸鼠的肝功能，結(jié)果顯示高劑量MgIG聯(lián)合L-OHP組、單純MgIG組及葡萄糖對(duì)照組ALT和AST水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);與單純L-OHP組相比，不同劑量MgIG聯(lián)合L-OHP組ALT和AST水平均較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，提示MgIG能一定程度緩解化療藥物L(fēng)-OHP引起的血清AST升高，具有保護(hù)肝功能的作用，與王慧芳等［7］的研究結(jié)論基本一致。從腫瘤生長(zhǎng)曲線可見，各劑量MgIG聯(lián)合L-OHP組的腫瘤生長(zhǎng)速度明顯較單純L-OHP組緩慢;同時(shí)，各劑量MgIG聯(lián)合L-OHP組及單純L-OHP組移植瘤質(zhì)量和體積顯著低于葡萄糖對(duì)照組，隨著MgIG劑量的增加，移植瘤質(zhì)量和體積縮小程度更加顯著，提示MgIG提高了L-OHP的抑瘤率，與L-OHP聯(lián)用具有協(xié)同作用。本研究中，各劑量MgIG聯(lián)合L-OHP組的移植瘤凋亡指數(shù)顯著高于單純L-OHP組，提示MgIG對(duì)L-OHP的協(xié)同抗腫瘤作用可能與其提高移植瘤的凋亡率有關(guān)，但相關(guān)機(jī)制有待通聯(lián)合檢測(cè)其他指標(biāo)進(jìn)一步研究闡述。

MgIG是第四代甘草酸制劑，是一種肝細(xì)胞保護(hù)劑，具有抗炎、保護(hù)肝細(xì)胞膜、清除氧自由基及改善肝功能的作用［8］。MgIG中有效物質(zhì)甘草酸，由1分子甘草苦質(zhì)酸和2分子葡萄糖醛酸組成，以18α和18β兩種異構(gòu)體形式存在，作用于激素受體，影響離子通道的開放，通過激活和抑制酶的活性，調(diào)節(jié)物質(zhì)代謝，調(diào)節(jié)膽堿能神經(jīng)的興奮性，具有腎上腺皮質(zhì)激素樣作用，從而呈現(xiàn)抗炎及免疫調(diào)節(jié)作用［9－10］。研究表明，異甘草酸鎂能抑制肝星狀細(xì)胞的增殖和氧化，減輕肝組織炎癥活動(dòng)度及纖維化程度;降低血清轉(zhuǎn)氨酶及血漿 NO水平，從而減輕肝組織損害［11－12］，不僅能夠?qū)?D-氨基半乳糖引起大鼠急性肝損傷、四氯化碳引起的慢性肝損傷、Gal/FCA誘發(fā)的免疫性肝損害以及對(duì)慢性酒精性肝損傷有防治效果，也能夠有效地改善肝切除后及化療藥物引起的肝損傷［13－15］。與以往保肝藥物相比，在治療化療藥物引起的急性肝損傷時(shí)，MgIG具有更好的療效和安全性，總有效率可達(dá)91.43%，同時(shí)可以縮短肝損傷病程，減輕不良反［16］。體外實(shí)驗(yàn)也顯示MgIG與部分化療藥物聯(lián)用時(shí)，表現(xiàn)出了明顯的協(xié)同作用［17］。綜上所述，MgIG在L-OHP對(duì)腫瘤的化療中，不僅表現(xiàn)出了明顯的保肝作用，而且潛在增加了L-OHP的抗腫瘤作用，初步體現(xiàn)了協(xié)同作用，但機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。

［1］Okines A，Verheij M，Allum W，et al.Gastric cancer:ESMO Clinical Practice Guidelines for diagnosis，treatment and follow-up［J］.Ann Oncol，2010，21(suppl.5):50 － 54.

［2］Grant LM，Rockey DC.Drug-induced liver injury［J］.Curr Opin Gastroenterol，2012，28(3):198 －202.

［3］葉建新，黃永健，鄭煒，等.異甘草酸鎂在胃腸道惡性腫瘤術(shù)后輔助化療時(shí)的保肝作用研究［J］.實(shí)用臨床醫(yī)藥雜志，2010，14(2):42－44.

［4］李志宏，郝磊，孔佩艷，等.異甘草酸鎂治療化療藥物性肝損害的臨床療效觀察［J］.實(shí)用臨床醫(yī)藥雜志，2011，15(1):88－89.

［5］趙立民，劉玉國(guó)，徐恒衛(wèi).馬錢子堿對(duì)SGC-7901裸鼠移植瘤模型抑瘤作用的研究［J］.中華腫瘤防治雜志，2012，19(19):1464－1466.

［6］張華，金建華，陸文斌，等.凱西萊聯(lián)合天晴甘美治療化療后肝損害的臨床療效［J］.中國(guó)現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2012，6(18):5 －6.

［7］王慧芬.甘草酸二銨治療各類肝病629例臨床觀察［J］.中華傳染病雜志，2004，22(2):113 －115.

［8］Mao YM，Zeng MD，Chen Y，et al.Magnesium isoglycyrrhizinate in the treatment of chronic liver diseases:a randomized，double-blind，multi-doses，active drug controlled，multi-center study［J］.Zhonghua gan zang bing za zhi，2009，17(11):847 －851.

［9］Abe M，Akbar F，Hasebe A，et al.Glycyrrhizin enhances interleukin-10 production by liver dendritic cells in mice with hepatitis［J］.J Gastroenterol，2003，38(10):962 －967.

［10］Dai JH，Iwatani Y，Ishida T，et al.Glycyrrhizin enhances interleukin-12 production in peritoneal macrophages［J］.Immunology，2001，103(2):235 －243.

［11］Beskina OA，Abramov AI，Gabdulkhakova AG，et al.Possible mechanisms of antioxidant activity of glycyrrhizic acid［J］.Omeditsinskaia khimiia，2005，52(1):60 －68.

［12］Chen WH，Lu LG，Zeng MD，et al.Effect of magnesium isoglycyrrhizinate on the proliferation and oxidative stress of rat hepatic stellate cells in vitro［J］.Zhonghua gan zang bing za zhi，2006，14(6):426－430.

［13］徐中南，吳錫銘，王佩，等.18-α甘草酸對(duì)大鼠四氯化碳慢性肝損傷的治療作用［J］.實(shí)用臨床醫(yī)藥雜志，2011，15(21):1 －4.

［14］董麗萍，于鋒，柳靜，等.異甘草酸鎂對(duì)D-氨基半乳糖急性肝損傷模型小鼠的保護(hù)作用研究［J］.中國(guó)藥房，2006，17(12):902－904.

［15］張憲祥，張炳遠(yuǎn)，吳力群，等.異甘草酸鎂對(duì)肝切除術(shù)后的保肝作用［J］.世界華人消化雜志，2010，18(2):189 －194.

［16］湯麗娜，林峰，沈贊，等.異甘草酸鎂治療抗腫瘤藥物引起的急性藥物性肝損傷的Ⅲ期臨床試驗(yàn)［J］.腫瘤，2012，32(9):738－743.

［17］朱林忠，寧濤，朱旭.異甘草酸鎂與化療藥的相互作用的基礎(chǔ)研究［J］.中華肝膽外科雜志，2012，18(12):944 －947.