鄧紅彬，李龍浩，高楓，任慶蘭

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤科，重慶 400016)

舌癌是最常見(jiàn)的口腔癌之一，早期的病人可單純手術(shù)治療，也可單純放療。放療的優(yōu)勢(shì)在于對(duì)舌功能的保留。中晚期舌癌可采用放療和手術(shù)的綜合治療。放療是舌癌的重要治療手段之一［1］，但放療時(shí)可能出現(xiàn)一系列副反應(yīng)，很多病人無(wú)法耐受，且隨著放射劑量的增加，副反應(yīng)發(fā)生率及嚴(yán)重程度會(huì)加重［2］。如能找到增加舌癌放射敏感性的方法，可降低放療劑量，減少腫瘤周圍正常組織的損傷，提高患者生活質(zhì)量，因此研究舌癌放射增敏具有重要現(xiàn)實(shí)意義。近年來(lái)基因與放療敏感性的關(guān)系受到越來(lái)越多的關(guān)注，通過(guò)改變基因調(diào)控來(lái)提高腫瘤對(duì)放療的敏感性可能是一種非常有前景的方法，但相關(guān)報(bào)道并不多見(jiàn)。ANGPTL4(angiopoietin-like 4)是2000年新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)基因，研究表明該基因與惡性腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移有關(guān)［3］。而該基因與惡性腫瘤放射敏感性的關(guān)系國(guó)內(nèi)外卻罕有報(bào)道。本文通過(guò)反義技術(shù)對(duì)ANGPTL4基因進(jìn)行抑制，觀察它對(duì)舌癌細(xì)胞Tca8113放射敏感性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

舌癌細(xì)胞株Tca8113購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)病理生理教研室;脂質(zhì)體Lipofectamine 2000購(gòu)自Invitrogen公司;RT-PCR試劑盒購(gòu)自Tiangen公司;AO(丫啶橙)、EB(溴乙錠)購(gòu)于 Sigma公司;胰蛋白酶購(gòu)自Promega公司;胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)液購(gòu)自Gibco公司。寡核苷酸由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成，皆經(jīng)全硫代修飾。ANGPTL4正義寡核苷酸序列為:5'—ATGGAGCACATACAGGGA—3';ANGPTL4反義寡核苷酸序列為:5'—TCCCTGTATGTGCTCCAT—3'

1.2 實(shí)驗(yàn)分組

本研究分為4組:空白對(duì)照組、脂質(zhì)體組、ANGPTL4正義寡核苷酸(Sense Oligodeoxynucleotide，SODN)組以及ANGPTL4反義寡核苷酸(Antisense Oligodeoxynucleotide，ASODN)組。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及寡核苷酸轉(zhuǎn)染

將Tca8113舌癌細(xì)胞置于37℃、飽和濕度、5%CO2孵箱中，用 10%胎牛血清和青-鏈霉素各100 U/mL的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。將2×105的細(xì)胞接種于6孔板上，24 h后細(xì)胞有40% ～60%融合，將脂質(zhì)體與寡核苷酸以1∶1質(zhì)量比分別加入1 μm ANGPTL4正義和反義寡核苷酸中，參照LipofectamineTm2000轉(zhuǎn)染策略轉(zhuǎn)染，6 h后換用含胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h。

1.4 RT-PCR檢測(cè)舌癌Tca8113細(xì)胞ANGPTL4的表達(dá)

采用Trizol法按試劑盒說(shuō)明書提取各組Tca8113細(xì)胞總RNA。RT-PCR用兩步法，先取5 μg RNA為模板，合成逆轉(zhuǎn)錄cDNA;再以ANGPTL4特異引物在Taq酶作用下PCR擴(kuò)增，引物序列為:Primer1:5'-GGCGAGTI'CTGGCTGGGTCT-3';Primer2:5'-TGGCCGTTGAGGTTCCAATG-3'。內(nèi) 參 照 β-actin(肌動(dòng)蛋白)引物序列為:Primer1:5'-GCGGGAAATCGTGCGTGACATT-3';Primer2:5'-GATGGAGTTGAAGGTAGTTTCGTG-3'。擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性5 min，后變性95℃ ×25 s，退火70℃ ×45 s，總計(jì)30個(gè)循環(huán)。最后延伸72℃ ×8 min。用PCR產(chǎn)物10 μL在瓊脂糖凝膠電泳，比較 ANGPTL4表達(dá)。ANGPTL4擴(kuò)增片段為329 bp。計(jì)算機(jī)采集圖像并測(cè)定各條帶的峰強(qiáng)度(Peak Intensity)，各峰強(qiáng)度值與內(nèi)參條帶的峰強(qiáng)度的比值即為數(shù)據(jù)結(jié)果(即為RT-PCR量)。RT-PCR量與對(duì)照組的比值為基因的表達(dá)量。

1.5 X射線(直線加速器)照射

室溫條件下對(duì)實(shí)驗(yàn)各組行直線加速器(VARIAN2300CD)6MV X射線(劑量率300cGy/min)照射0 Gy、2 Gy 或 4 Gy。

1.6 集落形成試驗(yàn)

照射后立刻制成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度為1×103/mL，在6孔板上以每孔300 μL接種，每組同時(shí)設(shè)2個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)7～14 d后固定并染色。顯微鏡下計(jì)數(shù)≥50個(gè)細(xì)胞的集落，計(jì)算集落形成率。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

集落形成率(%)=計(jì)數(shù)集落形成數(shù)/300×100%。

1.7 AO/EB熒光染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

將各實(shí)驗(yàn)組照射4 Gy后的細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色并計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)，細(xì)胞濃度調(diào)整為1×105/mL。在預(yù)先放有無(wú)菌小玻片的6孔板中接種2 mL，每組設(shè)3個(gè)平行孔。培養(yǎng)5 d后終止實(shí)驗(yàn)。AO(100 μg/mL)與 EB(100 μg/mL)按 1∶1新鮮混合配制。熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)。結(jié)果判斷:活細(xì)胞(VN):為正常結(jié)構(gòu)，核染色質(zhì)呈綠色;早期凋亡細(xì)胞(VA):為圓球或固縮狀，核染色質(zhì)呈綠色;晚期凋亡細(xì)胞(NVA):為圓球或固縮狀，核染色質(zhì)呈橘紅色;非凋亡的死細(xì)胞(NVN):正常結(jié)構(gòu)，核染色質(zhì)呈橘紅色。隨機(jī)選擇3個(gè)視野，計(jì)數(shù)各類細(xì)胞。重復(fù)3次。

1.8 流式細(xì)胞儀檢測(cè)Bcl-2蛋白的表達(dá)

將各組細(xì)胞照射4 Gy后收集1×106個(gè)細(xì)胞，以1∶1甲醛及丙酮行固定10～15 min，0.1%Saponin PBS漂洗 2次，加入 1%人 AB型血清，4℃ ×10 min，再加入1∶10 稀釋的Bcl-2 I抗10 μL，4 ℃ ×30 min，再次0.1%Saponin PBS漂洗并加入1∶100稀釋的 IgG-FITC Ⅱ 50 μL，4 ℃ ×30 min，然后0.1%Saponin PBS漂洗2次，重懸細(xì)胞于1%多聚甲醛中，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用統(tǒng)計(jì)軟件為SPSS 17.0，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，各組間差異比較采用雙因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t及SNK-q法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)a=0.05。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR檢測(cè)Tca8113細(xì)胞的ANGPTL4表達(dá)

RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與空白對(duì)照組、脂質(zhì)體組和 SODN組比較，轉(zhuǎn)染 ANGPTL4 ASODN后，Tca8113細(xì)胞ANGPTL4基因的表達(dá)被抑制，較空白對(duì)照組下降約44%，而其他3組之間無(wú)明顯差異(圖1，表1)。

2.2 各實(shí)驗(yàn)組集落形成試驗(yàn)結(jié)果

集落形成試驗(yàn)結(jié)果提示(表2):ASODN組集落形成率與各組相比在照射后明顯下降(2 Gy組，各組間比較F=38.782，P＜0.001)，并且隨著照射劑量的增加，這種趨勢(shì)愈加明顯(4 Gy組，各組間比較F=71.331，P＜0.001)。以上結(jié)果提示轉(zhuǎn)染 ANGPTL4 ASODN的受照射腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)被顯著抑制，提高了舌癌細(xì)胞Tca8113的輻射敏感性。

圖1 RT-PCR在四組中檢測(cè)到ANGPTL4的表達(dá)

表1 實(shí)驗(yàn)各組Tca8113細(xì)胞ANGPTL4 RT-PCR結(jié)果

表2 實(shí)驗(yàn)各組X射線照射后的集落形成率(%，n=10，±s)

表2 實(shí)驗(yàn)各組X射線照射后的集落形成率(%，n=10，±s)

*與空白對(duì)照組比較，P=0.632;#與空白對(duì)照組比較，P=0.086;△分別與空白對(duì)照組、脂質(zhì)體組、SODN組兩兩比較，均為P＜0.001;▲與空白對(duì)照組比較，P=0.474;□與空白對(duì)照組比較，P=0.428;■分別與空白對(duì)照組、脂質(zhì)體組、SODN組兩兩比較，均為P＜0.001。

空白對(duì)照組＜0.001 ＜0.001 83.25±5.46 66.35±4.31 49.35±3.68脂質(zhì)體組 82.83±4.57 65.53±3.77* 48.28±2.47▲SODN組 81.39±3.56 63.36±3.48# 48.16±3.37□ASODN組 72.34±4.34 50.35±3.56△ 30.93±3.59■F值 38.782 71.331 P值

2.3 AO/EB熒光染色法檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤組細(xì)胞凋亡結(jié)果

熒光染色法結(jié)果可見(jiàn):和各對(duì)照組比較，經(jīng)ANGPTL4 ASODN轉(zhuǎn)染后的受照射舌癌細(xì)胞中出現(xiàn)大量凋亡細(xì)胞(圖2)。表3顯示脂質(zhì)體組和SODN組的凋亡率都較空白對(duì)照組有所下降，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性意義(組間兩兩比較P=0.398，P=0.294)，而ASODN組照射后凋亡率明顯增加，與空白對(duì)照組、脂質(zhì)體組及SODN組比較有顯著性差異(各組間比較F=156.320，P＜0.001，組間兩兩比較均 P＜0.001)。

圖2 實(shí)驗(yàn)各組熒光染色法檢測(cè)結(jié)果（400×）

表3 實(shí)驗(yàn)各組經(jīng)4 Gy X射線照射后的凋亡率(%，n=9±s)

表3 實(shí)驗(yàn)各組經(jīng)4 Gy X射線照射后的凋亡率(%，n=9±s)

*與空白對(duì)照組比較，P=0.398;#與空白對(duì)照組比較，P=0.294;△分別與空白對(duì)照組、脂質(zhì)體組、SODN組兩兩比較，均為P ＜0.001。

空白對(duì)照組10.78±2.13脂質(zhì)體組 11.86±3.21*SODN組 12.13±2.67#ASODN組 33.87±2.58△F值 156.320 P值 ＜0.001

2.4 免疫熒光測(cè)定實(shí)驗(yàn)各組腫瘤細(xì)胞Bcl-2蛋白的表達(dá)結(jié)果

流式細(xì)胞儀檢測(cè)后顯示:各實(shí)驗(yàn)組Bcl-2表達(dá)都有所下降，但ANGPTL4 ASODN組Bcl-2表達(dá)明顯下調(diào)(各組間比較F=302.895，P＜0.001，組間兩兩比較均為P＜0.001，見(jiàn)表4)。

表4 各組經(jīng)4 Gy照射后Bcl-2蛋白表達(dá)(%，n=8±s)

表4 各組經(jīng)4 Gy照射后Bcl-2蛋白表達(dá)(%，n=8±s)

*與空白對(duì)照組比較，P=0.639;#與空白對(duì)照組比較，P=0.160;△分別與空白對(duì)照組、脂質(zhì)體組、SODN組兩兩比較，均為P＜0.001。

空白對(duì)照組78.46±3.15脂質(zhì)體組 77.76±3.05*SODN組 76.33±2.88#ASODN組 41.23±2.71△F值 302.895 P值 ＜0.001

3 討論

2000年，Kim等首先采用RACE技術(shù)從人胎盤cDNA文庫(kù)中分離出了一個(gè)新基因，該基因的mRNA在肝臟中呈特異性高表達(dá)，后來(lái)該基因被命名為血管生成素樣蛋白4(ANGPTL4)，人的ANGPTL4基因定位在19p13.3，有7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子，基因cDNA全長(zhǎng)為1943bp，開(kāi)放閱讀框含1 218 bp，編碼406個(gè)氨基酸，預(yù)計(jì)分子量為45.2 kDa［3］。國(guó)內(nèi)外對(duì)ANGPTL4與各種腫瘤關(guān)系的研究報(bào)道較多。Nakayama等［4］研究表明ANGPTL4在結(jié)直腸癌中的表達(dá)與腫瘤靜脈浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系。洪思琦等［5］用攜帶siANGPTL4基因的重組腺病毒感染骨肉瘤細(xì)胞株MG63，使其內(nèi)源性表達(dá)的ANGPTL4基因沉默從而使MG63細(xì)胞體外增殖被抑制。不過(guò)在不同惡性腫瘤中及相同腫瘤的不同類型中，ANGPTL4的表達(dá)及作用并不一致，對(duì)腫瘤的影響仍有爭(zhēng)議，也有相關(guān)報(bào)道在某些腫瘤細(xì)胞可抑制其遷移和侵襲，在某些腫瘤細(xì)胞系中表達(dá)會(huì)下降。Zhang等［6］研究發(fā)現(xiàn)ANGPTL4的表達(dá)可以抑制乳腺癌細(xì)胞向肺組織的擴(kuò)散。曾一元等［7］研究發(fā)現(xiàn)不同的肝癌細(xì)胞株轉(zhuǎn)染ANGPTL4基因后，它們的過(guò)表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞株的細(xì)胞增殖率有明顯差異，而在裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中ANGPTL4基因?qū)Σ煌母伟┘?xì)胞株可分別表現(xiàn)為抑制成瘤和促進(jìn)成瘤兩種作用。造成這一結(jié)果的原因可能是不同的癌細(xì)胞株有著不同的基因譜表達(dá)，在基因及蛋白等水平的不同調(diào)控反饋?zhàn)饔媒Y(jié)果。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)ANGPTL4在正常乳腺上皮細(xì)胞呈高表達(dá)，而在乳腺原位癌中卻表達(dá)下降，原因可能與ANGPTL4基因的甲基化有關(guān)［8］。ANGPTL4在腫瘤中的作用是復(fù)雜的，在不同組織的腫瘤中，ANGPTL4表現(xiàn)出不同的作用，顯示出環(huán)境和組織特異性，需要進(jìn)行更多的實(shí)驗(yàn)研究。而在臨床研究中舌癌患者的ANGPTL4表達(dá)可作為患者獨(dú)立預(yù)后因子，高表達(dá)者提示預(yù)后較差［9］。ANGPTL4還與腫瘤新生血管有一定的關(guān)系，趙劍鋒等［10］認(rèn)為胃癌組織中ANGPTL4 mRNA高表達(dá)可能促進(jìn)新生血管形成，腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。Katanasaka等［11］在惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)ANGPTL4的表達(dá)與新生血管的形成相關(guān)。ANGPTL4不但參與惡性腫瘤的增殖及轉(zhuǎn)移、與腫瘤新生血管相關(guān)，而且其在腫瘤細(xì)胞中可被乏氧、壞死等因素誘導(dǎo)表達(dá)，其中過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體和缺氧誘導(dǎo)因子-1被認(rèn)為是ANGPTL4的關(guān)鍵調(diào)控基因［12-13］，值得注意的是，它們也是影響腫瘤放射療效的重要因子，提示ANGPTL4可能與腫瘤放療存在相關(guān)性，而有關(guān)該基因與惡性腫瘤放射敏感性的關(guān)系的研究國(guó)內(nèi)外罕有報(bào)道。綜上所述，ANGPTL4基因不但與腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移有關(guān)，對(duì)放療的敏感性也可能有影響，如果抑制ANGPTL4基因表達(dá)，可以進(jìn)一步明確其與細(xì)胞增殖和凋亡的關(guān)系及其對(duì)放療敏感性的影響。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)反義技術(shù)對(duì)舌癌細(xì)胞中ANGPTL4基因進(jìn)行抑制，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)率下降約44%。該基因被抑制后，經(jīng)過(guò)照射處理的舌癌細(xì)胞集落形成率較SODN組及空白對(duì)照組和脂質(zhì)體組明顯下降，并且隨著照射劑量的增加，這種趨勢(shì)愈加明顯，提示轉(zhuǎn)染ANGPTL4 ASODN對(duì)人舌癌細(xì)胞具有輻射增敏作用。熒光染色法檢測(cè)結(jié)果提示轉(zhuǎn)染ASODN后受照射細(xì)胞凋亡率由空白對(duì)照組10.78%增加到33.87%;同時(shí)流式細(xì)胞儀測(cè)定結(jié)果可見(jiàn)受照射腫瘤細(xì)胞的Bcl-2蛋白表達(dá)率僅為41.23%，而空白對(duì)照組、脂質(zhì)體組和SODN組分別為78.46%、77.76%和76.33%，ASODN組和后三者比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異(P＜0.001)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示ANGPTL4 ASODN抑制ANGPTL4基因表達(dá)后能增加舌癌細(xì)胞放射敏感性，其輻射增敏機(jī)制可能與 ANGPTL4 ASODN下調(diào)舌癌細(xì)胞Bcl-2基因表達(dá)、增加X(jué)射線照射后腫瘤細(xì)胞的凋亡率有關(guān)。由于反義技術(shù)抑制基因表達(dá)存在不足之處，以及抑制ANGPTL4基因后對(duì)舌癌細(xì)胞放射增敏機(jī)制可能還涉及其他方面，比如輻射信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、放射損傷修復(fù)、細(xì)胞周期、體內(nèi)微環(huán)境等等，還需要進(jìn)一步研究。

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