劉康，李杰，王蘭，趙云霞，葉俊，李佳，秦家元，宋桂芹

(1.川北醫(yī)學院組織工程與干細胞研究所;2.南充市中心醫(yī)院生物治療中心;3.川北醫(yī)學院2012級臨床醫(yī)學系;4.川北醫(yī)學院2013級臨床醫(yī)學系;5.川北醫(yī)學院2011級臨床醫(yī)學系;6.川北醫(yī)學院基礎醫(yī)學院生物學教研室，四川 南充 637000)

食管癌是我國常見的惡性腫瘤之一，我國食管癌的發(fā)病率、死亡率均位居世界前列，每年的發(fā)病人數(shù)占全世界的一半以上［1］，而以四川南充、鹽亭為代表的川東北地區(qū)是中國食管癌的主要高發(fā)區(qū)之一［2］。食管癌的術后轉移和復發(fā)是造成預后差和死亡的主要原因之一，因此進一步探討食管癌發(fā)病原因和發(fā)病機理，對盡早發(fā)現(xiàn)和治療具有重要的現(xiàn)實意義。因此，有必要從遺傳學和表觀遺傳學角度對食管癌的發(fā)生、轉移機制進行深入研究，探討食管癌發(fā)生、發(fā)展過程中細胞內(nèi)各種基因和信號轉導通路的異?；罨?，并針對細胞內(nèi)的基因和信號通路中的重要分子開發(fā)定向拮抗藥物，為診斷和治療食管癌提供新靶點和策略。

特異AT序列結合蛋白1(special AT rich sequence binding protein 1，SATB1)是一種組織特異性核基質(zhì)區(qū)結合蛋白，可特異性的與核基質(zhì)結合區(qū)序列結合，參與染色體的高級包裝和組織特異性基因表達的調(diào)控及核骨架的形成［3］。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，SATB1基因在胃癌組織和細胞中均呈高表達［4］，體內(nèi)外試驗證實，經(jīng)SATB1沉默的胃癌細胞其侵襲轉移和增殖能力均有明顯降低。但SATB1基因在食管癌中的表達和作用如何，目前國內(nèi)外尚無探討。本研究應用免疫組織化學染色和熒光定量PCR等方法，分析SATB1基因在食管癌中的表達與腫瘤發(fā)生、分化轉移的關系，希望通過以上研究加深對食管癌生物學行為的了解，對食管癌的早期診斷和治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

選取2013年10月至2014年4月我院附屬醫(yī)院心胸外科手術切除后經(jīng)病理診斷為食管鱗狀細胞癌及癌旁組織48例。其中男性34例、女性14例，年齡43～75歲，平均60歲。病理分級:高分化10例，中分化25例，低分化13例。所有患者術前均未接受放療或化療。

1.2 主要試劑

qRT-PCR引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，RNA提取試劑盒購自Omega公司，cDNA合成試劑盒和PCR試劑盒購自Thermo公司，兔抗人SATB1多克隆抗體購自bioss公司。

1.3 免疫組織化學染色

采用鏈霉素抗生素蛋白－過氧化酶連接法(S-P法)按試劑盒說明書進行操作。切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度酒精水化后，雙氧水阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性后高壓鍋行抗原修復10 min，正常山羊血清封閉20 min后，滴加一抗(以PBS代替一抗作為陰性對照)4℃孵育過夜，PBS洗2遍，滴加生物素標記的二抗，室溫孵育1 h，PBS洗2遍后滴加辣根過氧化物酶標記鏈霉素工作液，DAB顯色，蘇木素復染，中性樹膠封片。SATB1基因陽性判斷標準以胞漿或胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。結果判定在雙盲法下進行，每張切片由2名病理醫(yī)師分別判斷，兩者結論不一致時重新評判。

1.4 實時熒光定量PCR

按照Omega RNA提取試劑盒說明書分別提取食管癌組織和癌旁組織RNA，按cDNA合成試劑盒說明書分別將RNA逆轉錄為cDNA，然后按照Bio-Rad熒光定量試劑盒說明書加樣檢測不同組織SATB1表達差異。qRT-PCR引物由上海捷瑞生物工程工程有限公司合成，引物序列見表1。所有反應均設有3個復孔，采用SYBR Green嵌合熒光方法在熒光定量PCR儀(Bio-Rad公司)擴增目的基因和內(nèi)參基因。

表1 實時熒光定量PCR擴增的引物序列及擴增片段的大小

1.5 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，采用卡方檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 SATB1蛋白在食管癌和癌旁的表達情況

SATB1定位于細胞核，呈淡黃色至棕黃、棕褐色，在食管癌組織中的表達率顯著高于癌旁組織中的表達，為83.3%。見圖1。

2.2 SATB1的表達與食管癌臨床病理參數(shù)相關性分析

SATB1在食管癌組織各級總的表達率見表2。SATB1基因在食管癌中呈陽性表達，在食管癌組織各級的表達分別為:與患者年齡和性別無關，但與腫瘤細胞分化程度、淋巴結轉移和病理學分期等呈顯著正相關。腫瘤分化程度低、臨床病理分期較晚和出現(xiàn)淋巴結轉移的腫瘤組織SATB1蛋白的表達與腫瘤分化程度高、臨床分期較早和未見淋巴結轉移的腫瘤組織比較，統(tǒng)計學有顯著意義(P＜0.05)。

圖1 SATB1在食管癌和癌旁中的表達情況（×200）

表2 SATB1與食管癌臨床病理參數(shù)相關系性分析

2.3 SATB1基因在食管癌組織中的表達

熒光定量PCR結果顯示，SATB1基因在癌組織中的表達率顯著高于癌旁組織，結果見圖2。

3 討論

食管癌(esophageal carcinoma)是目前世界上最常見的胃腸道惡性腫瘤之一，而我國又是食管癌高發(fā)地區(qū)，年平均死亡人數(shù)約15萬人，占全國腫瘤死亡率21.8%［5］。在導致死亡最多的癌癥中，食管癌名列第4，侵襲轉移是造成患者死亡的主要原因。迄今為止，食管癌的發(fā)病機制仍不清楚，食管癌的早期診斷和預后評估等一系列問題一直困擾著廣大臨床工作者。但大量研究表明，食管癌的發(fā)生和侵襲轉移是一個多基因、多步驟的癌變過程，涉及大量相關基因結構和表達調(diào)控的改變，尤其是癌基因的活化和抑癌基因的失活起著重要作用［6］。相關基因在食管癌的發(fā)生及發(fā)展中扮演重要角色，腫瘤發(fā)生與癌基因的激活和抑癌基因的失活密切相關，食管癌的侵襲轉移及發(fā)展和食管癌轉移基因及食管癌轉移抑制基因有密切聯(lián)系。已知與食管癌發(fā)生、轉移相關的癌基因很多，如 Survivin、β-catenin、c-myc、EGFR、ras和p16等，針對這些基因的基因治療也取得了一定的進展［7－12］，但是效果并不明顯，因此，深入研究食管癌發(fā)生、侵襲轉移的分子機制，尋找新的干預靶點對于食管癌的預防和治療具有重要意義。

圖2 熒光定量PCR檢測SATB1基因在食管癌和癌旁組織中的表達情況

2008年，Han等［5］對乳腺癌的一項研究表明SATB1(special A-T rich sequence binding protein 1)蛋白是乳腺癌細胞獲得轉移性所必需的，其在具有侵襲性的乳腺癌細胞中有所表達，而在正常細胞中并不出現(xiàn)。SATB1表達上調(diào)與侵襲性腫瘤表型和患者存活時間下降相關。SATB1通過限定多個基因組的位點和補充染色質(zhì)修飾酶來調(diào)節(jié)染色質(zhì)的結構和基因表達。在有較強侵襲性的癌細胞中敲除SATB1可以改變基因表達，通過恢復癌細胞的極性來逆轉腫瘤的發(fā)生，并且抑制在體腫瘤的生長和轉移。在非侵襲性腫瘤細胞中SATB1的異位表達可以導致與侵襲性腫瘤表型相關的基因表達模式，從而使之獲得轉移的能力。SATB1起到基因組組織器的作用，構成了一個功能性的核結構，被稱為SATB1調(diào)節(jié)的網(wǎng)狀結構。比較SATB1移除前后幾種轉移性細胞型中基因表達圖譜的變化，結果表明SATB1控制著1/4－1/3“預后不良基因”，包括控制黏附性、細胞周期、細胞外基質(zhì)、數(shù)個信號通路、細胞間連接和凋亡的基因。因此SATB1通過染色質(zhì)基因重排促進腫瘤的發(fā)生和轉移，SATB1增量調(diào)節(jié)可能是腫瘤細胞轉移必須基因簇的開關。

進一步的研究表明，SATB1在肝癌、子宮內(nèi)膜癌和直腸癌中均為高表達［13－15］，抑制 SATB1在相關腫瘤中的表達可以達到抑制腫瘤轉移的作用。我們之前的研究也發(fā)現(xiàn)，SATB1基因在胃癌組織中均呈高表達，在正常組織中低表達或無表達［4］。但目前為止，SATB1與食管癌的關系如何，其在食管癌中的表達情況及調(diào)控機制等研究尚未見公開報道。

本研究結果表明，食管癌組織中 SATB1的mRNA及其蛋白的表達與癌旁組織比較明顯增高，SATB1的表達與患者年齡、性別無關，但與腫瘤細胞分化程度、淋巴結轉移和病理學分期等呈顯著正相關，這提示SATB1可能在食管癌的發(fā)生、發(fā)展、轉移過程中起到一定的作用，表明其可作為食管癌惡性程度及預后的重要參考指標，進一步提示其有可能作為食管癌生物治療的重要靶點，為食管癌侵襲轉移和治療提供一個新的研究方向。

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