曾雨薇 綜述 羅素新 劉洪沛 審校

(重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科，重慶 400016)

近年來，冠心病成為導(dǎo)致中國乃至全球患者死亡的首要原因。膽固醇升高是冠心病的獨立危險因素，亦稱直接病因，其中最為重要的是低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)。新近的薈萃分析［1］發(fā)現(xiàn)，LDL-C每降低1 mmol/L，冠心病風險可減少21%。因此，降低膽固醇被視為防治缺血性心腦血管疾病的核心策略。他汀類藥物是目前降膽固醇治療領(lǐng)域的一線藥物，其不僅有效降低血漿LDL-C水平，還能減少心腦血管疾病的發(fā)病率和病死率。盡管他汀類藥物臨床應(yīng)用廣泛，優(yōu)勢突出，但存在一定的局限性:(1)一些家族性高膽固醇血癥患者，LDL-C基線水平較高，在接受強化他汀類藥物治療后膽固醇水平仍不能達標;(2)他汀類藥物雖然一般耐受性良好，但仍有少部分患者由于各種不良反應(yīng)，不能耐受大劑量或根本不能耐受他汀類藥物治療;(3)盡管他汀類藥物能有效預(yù)防心血管疾病，但PROVE-IT研究顯示，部分心血管疾病高?；颊咴诮邮軓娀☆愃幬?阿托伐他汀80 mg)治療后仍有較大的心血管事件殘余風險，在為期2年的研究中，風險發(fā)生率達22.4%［2］，該類患者仍有額外的降脂治療需求。目前臨床實際應(yīng)用中，可聯(lián)用膽固醇吸收抑制劑依折麥布和煙酸類藥物進一步降低LDL-C，但此類藥物降脂效果有限，且現(xiàn)有臨床研究尚未發(fā)現(xiàn)其可顯著減少患者主要心血管終點事件發(fā)生率，也只能作為降低LDL-C的二線藥物。因此，進一步研發(fā)針對脂代謝的不同作用靶點，更為安全、有效的新型降脂藥物成為目前血脂領(lǐng)域的研究熱點。前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9，PCSK9)的發(fā)現(xiàn)為這些患者提供了新的治療前景?，F(xiàn)對PCSK9抑制劑的研究現(xiàn)狀做一綜述。

1 PCSK9與高膽固醇血癥的關(guān)系

PCSK9是一種主要由肝臟合成的分泌型絲氨酸蛋白酶，屬于前蛋白轉(zhuǎn)化酶家族，其基因位于常染色體1p34-32，編碼神經(jīng)凋亡調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化酶1，參與神經(jīng)細胞凋亡的調(diào)節(jié)過程，更重要的是，其與膽固醇代謝直接相關(guān)。PCSK9基因功能缺失型突變可致LDL-C明顯減少，冠心病的發(fā)病率顯著降低，而PCSK9基因功能獲得型突變則致LDL-C水平大幅度升高，并與一種嚴重的純合子家族性高膽固醇血癥有關(guān)。PCSK9基因突變也是除低密度脂蛋白受體(low density lipoprotein receptor，LDL-R)和載脂蛋白B基因突變之外，第三個與常染色體顯性家族性高膽固醇血癥有關(guān)的基因突變［3］。

LDL-C主要通過肝細胞表面的LDL-R清除。PCSK9則通過細胞內(nèi)和細胞外途徑調(diào)控肝臟的LDL-R水平，進而影響LDL-C的代謝。PCSK9釋放入血后與肝細胞表面的LDL-R特異性結(jié)合，引導(dǎo)后者進入肝細胞，到達溶酶體，在溶酶體中LDL-R發(fā)生降解，肝細胞表面LDL-R減少，肝細胞對LDL-C的清除能力下降，導(dǎo)致LDL-C水平升高，這是細胞外途徑。PCSK9在分泌入血前也能調(diào)節(jié)局部肝臟組織中LDL-R的表達，然而細胞內(nèi)途徑具體機制尚不明確。抑制PCSK9能阻斷PCSK9介導(dǎo)的LDL-R降解，上調(diào)肝細胞表面的LDL-R水平，從而達到降低LDL-C的目的，是治療高膽固醇血癥的合理靶點。有趣的是，他汀類藥物的研究［4］發(fā)現(xiàn)他汀類藥物在抑制膽固醇合成的同時，可升高血漿PCSK9水平，且存在劑量依賴關(guān)系，并與他汀類藥物治療時間成正比，提示PCSK9抑制劑與他汀類藥物聯(lián)用或許能明顯提高其降脂效果。

2 PCSK9抑制途徑及相關(guān)藥物

2007年，第一個PCSK9抑制劑誕生，繼后，多種不同途徑的PCSK9抑制劑應(yīng)運而生，主要包括:(1)抑制PCSK9的合成:反義寡核苷酸(antisense oligonucleotides，ASOs)、小分子干擾 RNA(small interfering RNA，siRNA);(2)抑制PCSK9與LDL-R結(jié)合:單克隆抗體、小分子多肽。目前已進入臨床研究階段的PCSK9抑制劑見表1。

表1 臨床研究階段的PCSK9抑制劑一覽

2.1 抑制PCSK9的合成

2.1.1 ASOs類抑制劑

ASOs通常由8～50個核苷酸組成，其短小序列核苷酸與mRNA結(jié)合，抑制蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄［5］，達到沉默靶基因的目的。ASOs通過與PCSK9 mRNA結(jié)合抑制PCSK9的轉(zhuǎn)錄，從而抑制PCSK9的合成。肝臟是易于攝取外源性ASOs類藥物的器官，也是PCSK9的主要合成場所，這為ASOs類PCSK9抑制劑聚集于此并充分發(fā)揮作用提供了有利的條件，使肝細胞中PCSK9 mRNA水平明顯降低，肝細胞表面的LDL-R表達顯著增加，LDL-C減少。2007年，Graham等報道了第二代ASOs類PCSK9抑制劑靶向作用于小鼠PCSK9有良好的降脂效果，高脂喂養(yǎng)的小鼠通過皮下注射PCSK9 ASOs治療6周后，PCSK9 mRNA減少了92%，肝細胞表面LDL-R水平升高了2倍，總膽固醇和LDL-C分別減少了53%和38%，但HDL-C也減少了54%。動物研究證實運用ASOs抑制PCSK9 mRNA可明顯降低LDL-C水平，然而隨后兩項關(guān)于 ASOs類藥物 SPC-5001和BMS-844421的Ⅰ期研究［6-7］并未得出陽性結(jié)果，已在2011年提前終止，原因尚不明確。

鎖核酸(locked nucleic acid，LNA)技術(shù)也被運用到了PCSK9 ASOs中。LNA作為一種寡核苷酸衍生物，有穩(wěn)定的空間構(gòu)象，對RNA有良好的識別能力和親和力，與天然核酸構(gòu)成的ASOs相比，LNA構(gòu)成的新型ASOs結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，識別能力和親和力更強。研究證實了以人和動物PCSK9為靶標的LNA的有效性，人肝細胞轉(zhuǎn)染LNA ASOs后，PCSK9水平明顯減少，肝細胞表面LDL-R增多。小鼠尾單次靜脈注射LNA ASOs后，肝細胞中PCSK9 mRNA減少了60%，藥效持續(xù)16 d，肝臟表面LDL-R水平上調(diào)2.5～3倍持續(xù)8 d以上［5］。在非人靈長類動物試驗中，使用PCSK9特異性的LNA ASOs藥物SPC-5001后，PCSK9水平減少了85%，LDL-C減少了50%，總膽固醇減少水平與 LDL-C相一致［8］。以 PCSK9為靶標的 LNA ASOs為高膽固醇患者提供了一種有效的治療策略，未來可能成為他汀類藥物治療的補充，其藥物SPC-5001的Ⅰ期臨床研究正在進行中。

2.1.2 siRNA類抑制劑

抑制PCSK9合成的另一種方法是siRNA，它從機制上有別于ASOs。PCSK9 siRNA與PCSK9 mRNA靶向的RNA干擾沉默復(fù)合體結(jié)合，抑制PCSK9 mRNA的轉(zhuǎn)錄，同時啟動了靶mRNA序列特異性的降解機制，有序、高效、特異地降解PCSK9 mRNA，導(dǎo)致基因表達沉默［9］。PCSK9 siRNA被研制成可靜脈注射的脂質(zhì)化微顆粒，以減少毒副作用及對其他siRNA的干擾。在小鼠和大鼠試驗中，單次靜脈注射脂質(zhì)體siRNA，可使其PCSK9 mRNA最大沉默50%～60%，減少PCSK9水平，降低LDL-C達30%。在非人靈長動物中單劑量給藥可快速起效，48 h后LDL-C降低了50% ～60%，藥效持續(xù)3周，對HDL-C、三酰甘油無影響。ALN-PCS是Alnylam公司研發(fā)的脂質(zhì)體siRNA類PCSK9抑制劑，其Ⅰ期研究［10］納入了32例 LDL-C＞3.0 mmol/L的健康志愿者，接受不同單劑量靜脈給藥，研究結(jié)果顯示，該藥起效快、作用持久，不同劑量組間存在明顯的量效關(guān)系，觀察到最大劑量效應(yīng)最強，PCSK9減少達70%，LDL-C降低達40%，HDL-C、脂蛋白a無明顯改變。ALN-PCS安全性、耐受性好，無藥物相關(guān)的嚴重不良反應(yīng)報道。該藥的Ⅰ期研究臨床有效終點取得了陽性結(jié)果。由于Ⅰ期研究樣本量小，未來還需大型研究來進一步驗證其治療高膽固醇血癥的有效性和安全性。

2.2 抑制PCSK9與LDL-R結(jié)合

2.2.1 小分子多肽類抑制劑

PCSK9作用于細胞表面的LDL-R，是基于它們之間直接的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，運用抗體對抗PCSK9可破壞其相互作用，從而抑制PCSK9介導(dǎo)的肝細胞表面的LDL-R降解。2008年，Mayer等研究發(fā)現(xiàn)，膜聯(lián)蛋白AnxA2與PCSK9的CHRD片段特異性結(jié)合，抑制該區(qū)域與LDL-R的相互作用，其小分子模擬肽為抑制PCSK9提供了新的思路。LDL-R的EGFA段模擬多肽類藥物1D05-IgG2為單克隆抗體類模擬肽，對PCSK9的催化區(qū)具有高度親和力，與LDL-R競爭性結(jié)合PCSK9，抑制PCSK9對LDL-R的降解能力，增加肝細胞表面LDL-R的水平。動物試驗［11］中，獼猴單劑量注射1D05-IgG2后，LDL-C減少達50%。然而PCSK9與小分子接觸面積有限，產(chǎn)生的疏水作用不強，結(jié)合后容易脫落，且小分子模擬肽設(shè)計難度較大，這都為該類藥物的開發(fā)設(shè)置了難度。2014上半年，CVI公司研發(fā)的小分子PCSK9抑制劑CVI-LM001已申報臨床。

2.2.2 單克隆抗體類抑制劑

在目前眾多的PCSK9抑制劑中，單克隆抗體類藥物發(fā)展最為迅速。2009年，Duff等研究發(fā)現(xiàn)PCSK9特異性抗體通過識別PCSK9與LDL-R結(jié)合的前片段-催化域，阻斷PCSK9與LDL-R之間的相互作用，減少PCSK9介導(dǎo)的LDL-R降解，提高LDL-C的清除率。同年，Chan等為非人靈長類動物單次靜脈注射人源PCSK9單克隆抗體mAb1，發(fā)現(xiàn)其可有效降低 LDL-C水平，證明了單克隆抗體降低 LDL-C的有效性。PCSK9作為一種蛋白質(zhì)大分子，較易通過雜交瘤技術(shù)獲得單克隆抗體。隨著近幾年的快速發(fā)展，許多PCSK9單克隆抗體類藥物已進入臨床試驗階段(見表1)，其中熱門研究藥物為Amgen公司的evolocumab(AMG-145)和 Regeneron/Sanofi公司的 alirocumab(REGN-727/SAR-236553)，已進入Ⅲ期臨床試驗。

Evolocumab和alirocumab先后進入臨床試驗，Ⅰ期研究［12-13］中兩種藥物均能迅速、有效地降低LDL-C水平，且耐受性良好，無嚴重的藥物不良反應(yīng)，治療相關(guān)不良反應(yīng)發(fā)生率與安慰劑組相似。

Evolocumab和 alirocumab的Ⅱ期研究［14-20］顯示，兩種藥物單獨或聯(lián)合他汀類藥物治療除了有效降低LDL-C水平外，還影響了其他致動脈粥樣硬化脂蛋白水平:明顯降低總膽固醇、非HDL-C、載脂蛋白B水平，且下降幅度與LDL-C相似;有效降低脂蛋白a水平，在 GAUSS研究［21］中單用evolocumab使脂蛋白 a水平降低了20%～26%，而在alirocumab的一項研究中，聯(lián)合阿托伐他汀80 mg治療可使脂蛋白a明顯下降達34.7%［18］;輕微升高HDL-C水平，三酰甘油輕微下降或無明顯變化。Ⅱ期試驗的安全性數(shù)據(jù)十分鼓舞人心，兩種藥物的一般耐受性良好、不良反應(yīng)少。

Evolocumab和alirocumab的Ⅲ期研究正在進行中，納入人數(shù)較Ⅱ期研究明顯增多，同時隨訪時間延長，其中10項試驗結(jié)果于2014年先后公布，包括evolocumab 的 MENDEL-2、GAUSS-2、DESCARTES-2、LAPLACE-2、RUTHERFORD-2、TESLA 研究，以及 alirocumab的 ODYSSEY MONO、ODYSSEY COMBOⅡ、ODYSSEY FHⅠ和Ⅱ、ODYSSEY Long-Term研究。MENDEL-2［22］、LAPLACE-2［23］、DESCARTES-2 研 究［24］和RUTHERFORD-2研究［25］驗證了evolocuma單獨或聯(lián)合他汀類藥物(伴或不伴依折麥布)治療對于非家族性或家族性高膽固醇血癥患者安全有效。對于罕見的純合子家族性高膽固醇血癥患者，evolocumab也同樣安全有效，TESLA研究［26］發(fā)現(xiàn) evolocumab可使該類患者LDL-C水平從基線顯著降低31%。GAUSS-2研究［27］在evolocumab耐受性方面作了相關(guān)報道，他汀類藥物不耐受患者使用evolocumab后僅有23%出現(xiàn)肌肉相關(guān)不良反應(yīng)，且發(fā)生率與使用依折麥布組無明顯差異。Alirocumab的ODYSSEY系列研究結(jié)果涉及多個治療領(lǐng)域。首先公布的ODYSSEY MONO研究［21］通過比較證明了alirocumab降脂效果明顯優(yōu)于依折麥布。ODYSSEY COMBOⅡ研究［28］針對使用最大耐受劑量他汀類藥物治療血脂仍未達標的心血管疾病高?；颊撸芯堪l(fā)現(xiàn)alirocumab對于這類患者降LDL-C效果明顯、藥效持久，52周時 alirocumab組LDL-C仍保持在較基線水平降低49.5%。ODYSSEY FHⅠ和Ⅱ研究［29］進一步發(fā)現(xiàn)即使對于雜合子家族性高膽固醇血癥患者，alirocumab仍能明顯降低LDL-C達49%，且52周時LDL-C降低程度依舊保持在與24周時接近的水平。ODYSSEY Long-Term研究［29］通過事后分析探討了alirocumab對于心血管事件高危患者主要心血管事件的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，治療65周后，alirocumab組患者主要心血管事件絕對發(fā)生率為1.4%，安慰劑組為3.0%，相對風險下降了54%。雖然為事后分析結(jié)果，但也為alirocumab在降低心血管事件風險方面增添了新的證據(jù)。

現(xiàn)有的短期研究顯示單克隆抗體類藥物降低LDL-C的幅度超過50%，這一降幅相當于大劑量的強效他汀類藥物治療，且安全性與耐受性良好，無嚴重不良反應(yīng)。至此，單克隆抗體已具備了作為優(yōu)秀降膽固醇藥物的基本條件。然而，在血脂異常干預(yù)以及心血管疾病的防治中，LDL-C的降低只能作為一個替代終點，不能單憑替代性終點評價藥物療效。已公布的研究周期較短、樣本量小，缺乏長期有效性和安全性的證據(jù)。為了進一步評估PCSK9單克隆抗體對心血管事件的影響，evolocumab和alirocumab均開展了以心血管事件的發(fā)生率為主要終點的Ⅲ期隨機雙盲平行對照研究——FOURIER研究和ODYSSEY OUTCOMES研究。兩個研究分別納入了22500例和18000例心血管疾病患者，隨訪時間5～6年，主要終點包括冠心病死亡、非致死性心肌梗死、非致死性缺血性卒中、需住院的不穩(wěn)定型心絞痛、冠狀動脈血運重建等［30］，研究預(yù)計2018年結(jié)束，屆時才能比較可靠地判定這類藥物對臨床主要心血管終點事件的影響。

3 展望

從發(fā)現(xiàn)PCSK9基因突變到研發(fā)PCSK9抑制劑類藥物進入臨床試驗不到10年的時間里，PCSK9抑制劑成績斐然，有望發(fā)展成為一種前景廣闊的藥物。目前正在研究的PCSK9抑制劑中，小分子類藥物CVILM001正在申報臨床，LNA類藥物SPC-5001和siRNA類藥物ALN-PCS處于Ⅰ期研究階段，單克隆抗體類PCSK9抑制劑發(fā)展最為迅速，已進入Ⅲ期臨床試驗。2014年8月，安進公司率先向美國食品藥品監(jiān)督管理局提交了首個PCSK9抑制劑evolocumab的上市申請。雖然現(xiàn)有臨床研究已證實PCSK9抑制劑能顯著降低LDL-C水平，且安全性良好，但強效降低LDL-C水平是否能轉(zhuǎn)化為降低心血管事件風險?持續(xù)極低水平的LDL-C是否會有其他不良反應(yīng)?長期使用PCSK9抑制劑是否安全?PCSK9抑制劑是否能和他汀類藥物一樣，成為降脂治療的一線藥物甚至超越他汀類藥物?這些問題亟待目前的研究結(jié)果以及今后進一步大量的臨床研究驗證。

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