趙　靜，丁　奇，孫　穎，陳怡穎，張玉玉，孫寶國(guó)，陳海濤（北京工商大學(xué)食品營(yíng)養(yǎng)與人類(lèi)健康北京高精尖創(chuàng)新中心，食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室，北京市食品風(fēng)味化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100048）

基礎(chǔ)研究

豬骨湯中的游離氨基酸及其呈味特征分析

趙靜，丁奇，孫穎，陳怡穎，張玉玉*，孫寶國(guó)，陳海濤
（北京工商大學(xué)食品營(yíng)養(yǎng)與人類(lèi)健康北京高精尖創(chuàng)新中心，食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室，北京市食品風(fēng)味化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100048）

摘要：為了研究豬骨湯中的游離氨基酸及其呈味貢獻(xiàn)，采用氨基酸分析儀對(duì)肋排湯、棒骨湯、脊骨湯、扇骨湯4種豬骨湯的游離氨基酸進(jìn)行測(cè)定，并用電子舌分析其滋味輪廓，進(jìn)行對(duì)比分析。結(jié)果表明：4種豬骨湯中均分離出17種游離氨基酸，其中有7種必需氨基酸。棒骨湯中總游離氨基酸的含量最高（24.65 mg/g），肋排湯中最低（12.61 mg/g）。4種豬骨湯中鮮味氨基酸種類(lèi)最少（2種），但其中谷氨酸的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為16.69%～19.96%，TAV值為6.84～16.02，遠(yuǎn)高于其他游離氨基酸，對(duì)豬骨湯滋味貢獻(xiàn)程度最大。電子舌檢測(cè)分析得出，棒骨湯滋味輪廓和其他3種有差異，而其他3種差異不明顯。

關(guān)鍵詞：豬骨湯；游離氨基酸；味道強(qiáng)度值；電子舌；主成分分析

豬骨是豬肉產(chǎn)業(yè)的主要副產(chǎn)物，資源豐富[1]。豬骨湯憑借其鮮味均衡，厚味突出，香味悠長(zhǎng)的特點(diǎn)深受?chē)?guó)人喜愛(ài)。在烹制過(guò)程中，豬骨中的脂肪、氨基酸、蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分在濃度差及溫度的作用下逐漸釋放出來(lái)，形成營(yíng)養(yǎng)豐富、味道鮮美、極易吸收的濃厚湯汁[2]。其中，游離氨基酸是豬骨湯中重要的呈味物質(zhì)[3-6]，其種類(lèi)及含量會(huì)直接影響湯的鮮美程度。游離氨基酸還可以作為前體物質(zhì)與還原糖發(fā)生美拉德反應(yīng)，生成肉類(lèi)的獨(dú)特風(fēng)味。

國(guó)內(nèi)外對(duì)豬骨的研究主要集中在骨蛋白的提取、軟骨素的提取、骨多肽的制備、骨明膠的制備、骨泥的再生產(chǎn)工藝以及對(duì)其營(yíng)養(yǎng)成分的研究[7]。晉佳路等[8]研究了豬骨肽中氨基酸質(zhì)量的分析，發(fā)現(xiàn)豬骨肽中含有豐富的多種天然氨基酸，其中谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、精氨酸、賴(lài)氨酸、亮氨酸等8種氨基酸是豬骨肽中存在的主要氨基酸；王全利等[2]分析了排骨湯加工過(guò)程中游離氨基酸的變化，發(fā)現(xiàn)在烹飪中豬肉湯中總游離氨基酸和必需游離氨基酸的都呈現(xiàn)上升趨勢(shì)；楊銘鐸等[9]還研究了提取方法對(duì)豬骨湯中營(yíng)養(yǎng)成分的影響，發(fā)現(xiàn)相對(duì)于微波法及傳統(tǒng)蒸煮法，酶解法明顯提高了豬骨水解液中游離氨基酸的含量和質(zhì)量。但對(duì)于豬骨湯中，游離氨基酸對(duì)滋味貢獻(xiàn)的分析研究較少。

為了進(jìn)一步確定豬骨湯中游離氨基酸的呈味特性，本文通過(guò)加熱燉煮得到4種不同部位豬骨湯，采用氨基酸分析儀對(duì)豬骨湯中氨基酸種類(lèi)及含量進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算其游離氨基酸味道強(qiáng)度值（taste activity value，TAV），并用電子舌對(duì)其滋味輪廓進(jìn)行對(duì)比驗(yàn)證，以期為豬骨湯調(diào)味基料的研究和制備提供一定的理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1材料

市售肋排、棒骨、扇骨、脊骨，糖、黑胡椒、料酒、醋、蔥、姜、復(fù)合香辛料，購(gòu)于北京永輝超市。

復(fù)合香辛料：八角∶桂皮∶肉蔻∶陳皮∶花椒∶香葉∶小茴香=6∶6∶8∶7∶5∶6∶9。

1.1.2試劑

18種混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：百靈威科技有限公司；氨基酸分析儀Loading Buffer（色譜純）：大昌華嘉商業(yè)（中國(guó)）有限公司；0.01 mol/L的HCl、NaCl、MSG溶液：法國(guó)Alpha MOS公司。

1.2儀器與設(shè)備

30+氨基酸自動(dòng)分析儀：英國(guó)Biochrom公司；TGL16M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；Eppendorf AG移液槍?zhuān)旱聡?guó)Eppendorf公司；ALPHA 2-4 LSC冷凍干燥機(jī)：德國(guó)Marin Christ公司；AstreeⅡ電子舌系統(tǒng)：法國(guó)Alpha MOS公司；DGD40-40 DWG微電腦隔水電燉鍋：廣東天際電器有限公司。

1.3方法

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制及定量方法

混合標(biāo)準(zhǔn)氨基酸溶液中有天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、組氨酸、賴(lài)氨酸、精氨酸，每個(gè)濃度都是0.25 μmol/mL。將標(biāo)準(zhǔn)溶液與Loading Buffer按體積比1∶2、3∶8、1∶4、1∶8 和1∶32分別配制成共5個(gè)濃度的溶液。將5個(gè)不同濃度梯度氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液在同樣的條件下進(jìn)樣，在將得到每種氨基酸的峰面積對(duì)濃度作圖繪制17種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，采用的是峰面積外標(biāo)法進(jìn)行定量。

1.3.2樣品前處理

1.3.2.1豬骨湯的制備

稱(chēng)取相同質(zhì)量（100 g）不同部位的去肉豬骨，切成邊長(zhǎng)約5 cm的小塊，用沸水焯后加入2.5倍水、0.1%的蔗糖、0.1%的黑胡椒、0.3%的醋、1%的料酒、0.025%復(fù)合香辛料、0.7%蔥和姜，放入隔水燉鍋中，在營(yíng)養(yǎng)湯模式下加熱3 h。

1.3.2.2樣品前處理

取4種豬骨湯分別進(jìn)行離心，離心的條件：9 600 r/min，10 min，4℃。離心結(jié)束后分別取4種豬骨湯上清液，一部分直接用于電子舌分析，另一部分于小燒杯中進(jìn)行冷凍干燥，取適量?jī)龈煞奂尤胍欢康腖oading Buffer，0.45 μm親水濾膜過(guò)濾，進(jìn)行氨基酸分析。

1.3.3檢測(cè)條件

氨基酸分析儀參數(shù)設(shè)置：BiochromNa型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，4.6μm×200mm；測(cè)定波長(zhǎng)在570nm和440nm；緩沖液流速25 mL/h，31.2 mL/h；柱溫31℃～76℃；茚三酮溶液流速20 mL/h；進(jìn)樣量20 μL。每個(gè)樣品重復(fù)進(jìn)樣3次。

電子舌參數(shù)設(shè)置：采用交叉型傳感器，在室溫下測(cè)量，每個(gè)樣品重復(fù)7次，數(shù)據(jù)采集時(shí)間為180 s，以水為清洗溶液清洗20 s[10]。測(cè)量前對(duì)電子舌進(jìn)行自檢、活化、校準(zhǔn)和診斷等步驟，以確保采集所得數(shù)據(jù)的可靠性和穩(wěn)定性。

1.3.4分析方法

1.3.4.1游離氨基酸組成及含量分析

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算4種豬骨湯中各游離氨基酸、必需氨基酸（essential amino acids，EAA）、非必需氨基酸（nonessential amino acids，NEAA）和呈味氨基酸（delicious amino acids，DAA）的含量及氨基酸總量（total amino acids，TAA）。

1.3.4.2豬骨湯滋味的分析

參照文獻(xiàn)[11]，計(jì)算豬骨湯中各種游離氨基酸的味道強(qiáng)度值（TAV），找出有顯著貢獻(xiàn)的氨基酸。當(dāng)TAV值大于1時(shí)，認(rèn)為該物質(zhì)對(duì)呈味有貢獻(xiàn)，而TAV值小于1時(shí)，認(rèn)為該物質(zhì)對(duì)呈味沒(méi)有貢獻(xiàn)[12]，由此可以確定主要呈味的氨基酸。

1.3.4.34種豬骨湯整體滋味的對(duì)比評(píng)定。

利用電子舌對(duì)4種豬骨湯的滋味輪廓進(jìn)行區(qū)分辨別，從整體上對(duì)豬骨湯進(jìn)行對(duì)比分析，用電子舌自帶的軟件進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA），主成分分析是在力求數(shù)據(jù)信息丟失最少的原則下，對(duì)高維的變量空間降維，即研究指標(biāo)體系的少數(shù)幾個(gè)線(xiàn)性組合，并且這幾個(gè)線(xiàn)性組合所構(gòu)成的綜合指標(biāo)將盡可能多地保留原來(lái)指標(biāo)變異方面的信息[13]。

2　結(jié)果與分析

2.1標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的圖譜及回歸方程的建立

游離氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)是以峰面積為橫坐標(biāo)，以氨基酸的濃度（μmol/mL）為縱坐標(biāo)。圖1是17種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖。表1是17種氨基酸回歸曲線(xiàn)和相關(guān)系數(shù)。脯氨酸在440 nm出峰，其它16種氨基酸在570 nm出峰。

圖1　17種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖Fig.1　17 kinds of amino acids standard Chromatograms

表1　17種氨基酸回歸曲線(xiàn)和相關(guān)系數(shù)Table 1　17 kinds of amino acid regression curve and correlation coefficient

2.24種豬骨湯中游離氨基酸種類(lèi)及質(zhì)量分析

圖2分別是肋排湯、棒骨湯、脊骨湯、扇骨湯的氨基酸分離圖譜。

圖2　4種豬骨湯的氨基酸分離圖譜Fig.2　The amino acid separation diagram in four kinds of pig bone soup

由圖2可以看出，17種氨基酸的分離效果較好，檢測(cè)出的17種游離氨基酸與晉佳路等[8]的研究成果一致，其中必需氨基酸種類(lèi)均是7種。

表2是4種不同豬骨湯中游離氨基酸的種類(lèi)及含量。

從表2中可以看出，4種豬骨湯游離氨基酸的種類(lèi)均相同，但含量不同。肋排湯和脊骨湯中含量最高的為丙氨酸，其次為谷氨酸；棒骨湯和扇骨湯中含量最高的是谷氨酸，其次為丙氨酸。

4種豬骨湯中氨基酸總量最高的為棒骨湯（24.65 mg/g），其次為扇骨湯（22.70 mg/g）、脊骨湯（14.63 mg/g），最低的為肋排湯（12.61 mg/g）。棒骨湯中的呈味氨基酸含量也最高，為23.88 mg/g，占其氨基酸總量的96.90%。

從必需氨基酸總量（EAA）分析比較，4種豬骨湯中均具有蘇氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸和賴(lài)氨酸7種必需氨基酸。必需氨基酸總量最高的是棒骨湯（8.15 mg/g），其次為扇骨湯和脊骨湯，分別為6.97 mg/g、2.87 mg/g，最少的是肋排湯為2.79 mg/g。根據(jù)必需氨基酸占氨基酸總量比值（EAA/ TAA）比較可得出，棒骨湯比值最高（33.07%），其次依次是扇骨湯（30.71%）、肋排湯（22.15%）、脊骨湯（19.62%）。根據(jù)必需氨基酸與非必需氨基酸比值（EAA/NEAA）比較得出的結(jié)果為，棒骨湯的比值最高（49.42%），脊骨湯最少（24.41%）。

表2　4種不同豬骨湯中游離氨基酸的種類(lèi)及含量（n=3）Table 2　The type and concentration of free amino acid in four kinds of pig bone soup（n=3）

2.34種豬骨湯呈味特性及TAV分析

滋味有酸、甜、苦、咸和鮮5種感受，呈味氨基酸的含量對(duì)豬骨湯的口感起著至關(guān)重要的作用。根據(jù)參考文獻(xiàn)[14-16]，游離氨基酸分成鮮、甜和苦3類(lèi)，苦味氨基酸的種類(lèi)為9種，鮮味氨基酸為2種，甜味氨基酸為5種。游離氨基酸是肉類(lèi)重要的滋味呈味和香味前體物質(zhì)，如蘇氨酸、丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸、賴(lài)氨酸、脯氨酸、羥脯氨酸等具有甜味[17]；天冬氨酸、谷氨酸產(chǎn)生酸味；精氨酸、組氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸等產(chǎn)生苦味[18]。

表3為4種不同部位豬骨湯游離氨基酸的味道強(qiáng)度值。

表3　4種不同部位豬骨湯游離氨基酸的味道強(qiáng)度值Table 3　Taste intensity value of free amino acid in four kinds of pig bone soup

由表3可以看出，4種豬骨湯滋味有貢獻(xiàn)的氨基酸種類(lèi)排序結(jié)果為：棒骨湯（11種）＞扇骨湯（9種）＞脊骨湯（6種）＞肋排湯（5種）。其中呈鮮味的氨基酸種類(lèi)最少，但在4種豬骨湯中谷氨酸TAV值都最高，對(duì)滋味的貢獻(xiàn)度最大，谷氨酸鮮味很強(qiáng)，對(duì)湯風(fēng)味具有重要貢獻(xiàn)[19]，具有形成肉鮮味和緩沖咸與酸等味道的特殊功效[20]。4種骨湯的蘇氨酸、脯氨酸、異亮氨酸、亮氨酸TVA值均小于1，對(duì)湯滋味貢獻(xiàn)程度不大。甜味也是豬骨湯的一個(gè)主要特征味道，甘氨酸和丙氨酸等呈味氨基酸具有舒適的甜味，4種豬骨湯中的甘氨酸、丙氨酸TVA＞1，對(duì)滋味貢獻(xiàn)很大。4種豬骨湯中苦味氨基酸種類(lèi)最多，但是豬骨湯中鮮有苦味感，因苦味氨基酸如苯丙氨酸、酪氨酸，當(dāng)其含量低于呈味閾值時(shí)，可增強(qiáng)其它呈味氨基酸的鮮味和甜味[21]，如苦味氨基酸精氨酸，有增加呈味復(fù)雜性和提高鮮度的作用[22]。

表4為4種豬骨湯中味覺(jué)氨基酸的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

從表4可以看出，肋排湯和脊骨湯鮮味氨基酸的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)相差不大，棒骨湯和扇骨湯鮮味氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異不大。在4種豬骨湯中，丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸等甜味氨基酸所占的比例較高，賦予了豬骨湯甘甜爽口的特性，還能減少苦味，緩解食物中不快口味[23]。其中脊骨湯中的甜味氨基酸的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高（60.13%），滋味比其他3種更甘甜；棒骨湯中的甜味氨基酸相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)最少（46.52%）。棒骨湯中苦味氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高（33.39%），脊骨湯中最低（22.18%）。

2.44種豬骨湯電子舌對(duì)比分析

圖3為4種豬骨湯電子舌檢測(cè)的PCA分析圖及判別指數(shù)。

表4　4種豬骨湯中味覺(jué)氨基酸的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 4　The relative mass fraction of taste amino acid in 4 kinds of pig bone soup

圖3　4種豬骨湯電子舌檢測(cè)的PCA分析圖及判別指數(shù)Fig.3　PCA analysis diagram and discrimination index detected by electronic tongue in four pig bone soup

電子舌檢測(cè)得到的結(jié)果是由7個(gè)傳感器檢測(cè)樣品的酸、甜、苦、咸、鮮口感的綜合結(jié)果組成，電子舌在檢測(cè)的過(guò)程中，樣品需要至少重復(fù)5次，因?yàn)殡娮由嗟牡谝淮螜z測(cè)結(jié)果一般與后來(lái)的檢測(cè)結(jié)果相差比較大，為了得到比較真實(shí)的數(shù)據(jù)，盡量將實(shí)驗(yàn)的重復(fù)次數(shù)維持在6次～7次左右[25]。主成分分析中方差貢獻(xiàn)率最大的視為第1主成分，貢獻(xiàn)率次之的為第2主成分，以此類(lèi)推。第1、第2主成分方差貢獻(xiàn)率之和主要反映了樣本整體差異性信息在主成分平面上的完整程度[26]，當(dāng)方差貢獻(xiàn)率累積達(dá)到85%以上時(shí)就認(rèn)為所選的幾個(gè)主成分能夠反映原來(lái)指標(biāo)的信息[27]。圖3顯示了電子舌檢測(cè)和區(qū)分不同部位豬骨湯的PCA分析圖及判別指數(shù)（discrimination index，DI），7個(gè)傳感器主成分1 （principal component value 1，PCV1） 和主成分 2 （principal component value 2，PCV2）的累積方差貢獻(xiàn)率為97.68%大于85%，這說(shuō)明主成分1和2包含樣品大量信息，可以反映4種樣品的整體信息。經(jīng)PCA分析后得到的區(qū)別指數(shù)是判斷電子舌是否能區(qū)分樣品的重要指標(biāo)，一般當(dāng)DI值＞80時(shí)，認(rèn)為對(duì)樣品具有良好的區(qū)分度[27]。棒骨湯與其他3種豬骨湯的DI分別為88.75%、88.17%、88.88%，均大于80%，說(shuō)明棒骨湯可以跟其他3種的滋味分開(kāi)，但肋排湯、脊骨湯、扇骨湯卻不能很好地分開(kāi)，其判別指數(shù)都小于80%，其中差異最大的是棒骨湯和扇骨湯，差異最小的是肋排湯和扇骨湯。

3　結(jié)論

1）棒骨湯中游離氨基酸總量最高（24.65 mg/g），肋排湯中最低（12.61 mg/g）。4種豬骨湯中對(duì)滋味有貢獻(xiàn)的氨基酸數(shù)量為：棒骨湯（11種）、扇骨湯（9種）、脊骨湯（6種）、肋排湯（5種）。其中，鮮味氨基酸相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高為扇骨湯（18.99%），甜味氨基酸最高為脊骨湯（60.13%），苦味氨基酸最高為棒骨湯（33.39%）。

2）電子舌PCA和判別指數(shù)分析得出，差異最大的是棒骨湯和扇骨湯，差異最小的是肋排湯和扇骨湯。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.18.001

收稿日期：2015-08-21

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31401604）；“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2014BAD04B06）

作者簡(jiǎn)介：趙靜（1991—），女（漢），碩士，研究方向：食用香料化學(xué)及其應(yīng)用。

*通信作者：張玉玉（1982—），女，博士，講師，研究方向：食用香料化學(xué)及其應(yīng)用。

Comparison of Free Amino Acids and Taste Characteristics in Different Kinds of Pig Bone Soup

ZHAO Jing，DING Qi，SUN Ying，CHEN Yi-ying，ZHANG Yu-yu*，SUN Bao-guo，CHEN Hai-tao
（Beijing Innovation Centre of Food Nutrition and Human Health，Beijing Laboratory for Food Quality and Safety，Beijing Key Labaratory of Flavor Chemistry，Beijing Technology and Business University，Beijing 100048，China）

Abstract：In order to study the taste contribution of free amino acid in pig bone soup，the free amino acids were detected in rid soup，bar soup bone，chine soup and fan bone soup by automatic amino acid analyzer.The taste outline was analyzed by the electronic tongue.The results indicated that 17 kinds of amino acids were isolated from 4 pig soup，including 7 kinds of essential amino acids.The content of total free amino acids was the highest in the stick soup（24.65 mg/g），but the lowest in the rib soup（12.61 mg/g）.Only 2 kinds of umami amino acids were detected，but the relative amounts of the glutamic acid in the 4 soup were between 16.69%-19.96%，the TAV values were between 6.84-16.02，which was far higher than other free amino acids，and it had the greatest taste contribution in pig bone soup.The results of the electronic tongue showed that a significant difference taste outline was between the stick bone soup and the other three，but not in the other three kinds of pig soups.

Key words：pig bone soup；free amino acid；taste active value；electronic tongue；principal component analysis