薛啟祥，沈 雪，田 甜，韓 冰，謝汝佳，何 艷，楊 勤*

(貴陽醫(yī)學(xué)院 1.病理生理學(xué)教研室； 2.生理學(xué)教研室， 貴州 貴陽 550004)

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研究論文

金屬硫蛋白降低GRP78和CHOP蛋白表達減輕大鼠砷中毒肝細胞凋亡

薛啟祥1，沈 雪1，田 甜1，韓 冰1，謝汝佳1，何 艷2，楊 勤1*

(貴陽醫(yī)學(xué)院 1.病理生理學(xué)教研室； 2.生理學(xué)教研室， 貴州 貴陽 550004)

目的研究葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)、C/EBP環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子同源蛋白(CHOP)在金屬硫蛋白(MT)減輕大鼠砷中毒肝細胞凋亡中的作用。方法建立MT治療亞砷酸鈉(NaAsO2)誘導(dǎo)的大鼠砷中毒肝損傷模型，用MT治療2周，以TUNEL法檢測肝細胞凋亡，免疫組化法、Western blot檢測大鼠肝臟GRP78、CHOP蛋白表達。結(jié)果砷中毒模型組大鼠肝細胞凋亡、肝組織GRP78和CHOP蛋白表達較對照組顯著升高(P<0.05)，MT治療組肝細胞凋亡、肝組織GRP78和CHOP蛋白表達明顯回降(P<0.05)，但仍然高于對照組(P<0.05)。結(jié)論MT可通過降低GRP78和CHOP蛋白表達減輕大鼠砷中毒所致的肝細胞凋亡。

金屬硫蛋白；砷中毒；肝損傷；凋亡；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78； C/EBP環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子同源蛋白

砷是嚴重危害人體健康的環(huán)境毒物。流行病學(xué)調(diào)查和動物實驗表明砷中毒可引起不同程度的肝臟損傷[1]，并且砷致肝損傷的發(fā)生機制中有細胞凋亡參與[2]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)途徑是繼線粒體途徑和死亡受體途徑后新發(fā)現(xiàn)的又一個誘導(dǎo)細胞凋亡的途徑，并且ERS誘導(dǎo)的細胞凋亡在中毒性肝病、非酒精性脂肪肝、病毒性肝炎等所致的肝損傷中發(fā)揮了重要作用[3]。有研究發(fā)現(xiàn)金屬硫蛋白(metallothionein,MT)對急性化學(xué)性肝損傷有一定的保護作用[4]。MT能否通過減少ERS減輕砷中毒肝細胞凋亡尚未見研究報道。本研究擬觀察MT治療大鼠砷中毒肝損傷過程中肝組織ERS相關(guān)蛋白葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulated protein78,GRP78)、C/EBP環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)和肝細胞凋亡三者的表達并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 材料

清潔級雄性Wistar大鼠24只，體質(zhì)量150～180 g[貴陽醫(yī)學(xué)院實驗動物中心(許可證號:SCXK(黔)2002-0001]；亞砷酸鈉(NaAsO2)(Sigma公司)；MT(上海源葉公司)；超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；組織細胞裂解液和BCA蛋白濃度測定試劑盒(北京鼎國昌盛公司)；PVDF膜、ECL發(fā)光試劑(Millipore公司)；CHOP抗體(Bioworld公司)；β-actin抗體(Cell Signaling公司)；GRP78抗體DAB顯色試劑盒和TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(武漢博士德公司)；DAPI染色試劑盒(南京凱基公司)等。

1.2 方法

1.2.1 模型復(fù)制：將大鼠隨機分為對照組、砷中毒模型組和MT治療組，每組8只。給予砷中毒模型組大鼠含200 mg/L的NaAsO2自來水溶液，飲用8周后改用自來水2周。MT治療組大鼠于8周后停止飲用NaAsO2自來水溶液，改用自來水并開始隔日1次按2 mL/100 g體質(zhì)量給予濃度為200 mg/L的MT溶液灌胃,繼續(xù)喂養(yǎng)2周。

1.2.2 標本采集：實驗結(jié)束后大鼠股動脈放血處死，收集血清，檢查肝功能指標；留取右葉部分肝組織用4%甲醛溶液固定，其余肝組織置-80 ℃低溫冰箱凍存。

1.2.3 生化檢測：用全自動生化分析儀檢測血清ALT、AST水平，按照相應(yīng)測定試劑盒說明書操作檢測肝組織勻漿SOD活性。

1.2.4 組織學(xué)檢測：肝組織石蠟包埋，常規(guī)制片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織損傷變化。

1.2.5 TUNEL法檢測凋亡：肝組織切片常規(guī)脫蠟入水，滴加ProteinaseK，37 ℃消化10 min，滴加含TdT和DIG-d-UTP的標記液，37 ℃濕盒中標記2 h，滴加封閉液，37 ℃封閉30 min，滴加生物素化抗地高辛抗體(1∶100)，37 ℃反應(yīng)30min，滴加SABC-FITC+POD(1∶100), 37 ℃反應(yīng)30 min，DAPI染色液復(fù)染細胞核，室溫避光反應(yīng)10 min，洗去DAPI染液，封片。熒光顯微鏡觀察1個視野，在以490/45 nm激發(fā)光激發(fā)時顯示明亮黃綠光染色，同時在以340/380 nm激發(fā)光激發(fā)時顯示強藍光的細胞為陽性細胞。高倍鏡下隨機觀察8個視野，以每100個細胞中凋亡細胞平均個數(shù)作為凋亡指數(shù)(apoptosis index,AI)。

1.2.6 免疫組化法檢測：采用SABC法，嚴格按照試劑盒說明書操作。Ⅰ抗?jié)舛染鶠?∶100，陰性對照以PBS液代替Ⅰ抗。光鏡下觀察細胞染成棕黃色為陽性細胞，觀察GRP78和CHOP在肝細胞的表達，用BI-2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)測定平均吸光度(avorage absorbance, AA值)。

1.2.7 Western blot法檢測：取-80 ℃凍存肝組織稱重，裂解，勻漿后取上清，BCA蛋白濃度測定法測定樣品總蛋白濃度。10% SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)膜，常溫封閉1 h，分別加入β-actinⅠ抗(1∶200)、GRP78Ⅰ抗(1∶400)、CHOPⅠ抗(1∶600)置4 ℃冰箱振蕩孵育過夜。次日洗膜，加入Ⅱ抗(1∶4 000)室溫孵育1 h，ECL化學(xué)發(fā)光顯影，凝膠圖像分析系統(tǒng)掃描分析，目的蛋白的相對表達水平為目的蛋白的吸光度值與β-actin蛋白的吸光度值之比。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清生化指標及肝組織SOD活性測定結(jié)果

砷中毒模型組血清ALT、AST水平較對照組明顯增高(P<0.05)，MT治療組血清ALT、AST水平明顯回降(P<0.05)，但仍然高于對照組(P<0.05)。砷中毒模型組肝組織SOD活性較對照組明顯降低(P<0.05)，MT治療組肝組織SOD活性明顯回升(P<0.05)，但仍然低于對照組(P<0.05)(表1)。

2.2 各組大鼠肝臟組織病理形態(tài)學(xué)觀察

對照組大鼠肝細胞以中央靜脈為中心,呈放射狀排列,無肝細胞變性、壞死及炎性細胞浸潤,肝小葉結(jié)構(gòu)完整；砷中毒模型組大鼠門管區(qū)少許炎性細胞浸潤，肝細胞胞質(zhì)疏松，有不同程度的氣球樣變性；MT治療組大鼠肝細胞以中央靜脈為中心，呈放射狀排列，無肝細胞變性、壞死及炎性細胞浸潤,肝小葉結(jié)構(gòu)完整，近似于對照組(圖1)。

2.3 各組大鼠肝細胞凋亡檢測

砷中毒模型組肝細胞AI較對照組明顯增高(P<0.05)，MT治療組肝細胞AI明顯回降，但仍然高于對照組(P<0.05)(圖2)。

表1 各組大鼠血清生化指標及肝組織SOD活性測定結(jié)果

*P<0.05 compared with control group；#P<0.05 compared with model group.

A.control group; B.model group; C.treatment group

A～C.TUNEL staining；D～F.DAPI staining; A,D.control group; B,E.model group; C,F.treatment group；*P<0.05 compared with control group；#P<0.05 compared with model group

圖2 TUNEL法結(jié)合DAPI法檢測肝細胞凋亡指數(shù)

Fig 2 Apoptosis of liver cells detected by TNNEL and DAPI staining(×200)

2.4 各組大鼠肝組織GRP78和CHOP表達免疫組化法檢測

正常對照組大鼠肝組織鮮見GRP78和CHOP表達陽性細胞；砷中毒模型組大鼠肝組織中可見較多棕黃色染色的陽性細胞，且呈胞質(zhì)表達陽性；治療組大鼠肝組織中也鮮見GRP78和CHOP陽性表達的細胞(圖3)。

2.5 各組大鼠肝臟GRP78和CHOP蛋白表達水平Western blot檢測

砷中毒模型組肝組織GRP78和CHOP蛋白表達量較對照組明顯增高(P<0.05)，MT治療組肝組織GRP78和CHOP蛋白表達量明顯回降(P<0.05)，但仍然高于對照組(P<0.05)(圖4)。

A～C.GRP78 group;D～F.CHOP group; A,D.control group; B,E.model group; C,F.treatment group；*P<0.05 compared with control group；#P<0.05 compared with model group

圖3 免疫組化法檢測大鼠肝組織GRP78和CHOP蛋白表達

Fig 3 The expression of GRP78 and CHOP proteins in liver of each group rats(SABC,×400)

*P<0.05 compared with control group；#P<0.05 compared with model group

3 討論

目前對砷中毒肝損傷的發(fā)生機制及防治的研究發(fā)現(xiàn)砷在肝臟內(nèi)代謝過程中可產(chǎn)生大量的氧自由基，引起的肝細胞凋亡增加是砷中毒致肝損傷的主要因素之一[5]。有研究發(fā)現(xiàn)MT對CCl4肝損傷的保護作用很可能與MT提高組織抗氧化能力、清除過多的自由基有關(guān)[4]。還有研究發(fā)現(xiàn)MT可能參與了砷暴露大鼠肝損傷的發(fā)生過程，漢丹肝樂可能是通過其誘導(dǎo)砷暴露大鼠肝臟MT表達，提高抗氧化效應(yīng)而起到保護肝細胞的作用[6]。

本研究復(fù)制砷中毒致大鼠肝損傷及MT治療動物模型。肝組織病理形態(tài)學(xué)結(jié)合反映肝損傷的重要生化指標ALT、AST 顯示砷中毒模型組肝損傷復(fù)制成功，MT治療組肝損傷得到改善。砷中毒模型組肝組織SOD活性明顯降低，肝細胞凋亡明顯增高，MT治療組肝組織SOD活性明顯回升，肝細胞凋亡明顯回降。提示MT通過其抗氧化作用減輕肝細胞氧化損傷，從而減少大鼠砷中毒肝細胞凋亡，對大鼠砷中毒肝損傷起保護作用。

目前研究發(fā)現(xiàn)砷可能通過上調(diào)Fas/FasL和Bax的表達[2]及啟動P53 介導(dǎo)的線粒體凋亡通路導(dǎo)致的肝細胞凋亡從而引起肝損傷發(fā)生[7]。ERS通路是新發(fā)現(xiàn)的又一致細胞凋亡機制[8]。GRP78作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)的感受器,是啟動ERS關(guān)鍵因子之一[9]。當細胞發(fā)生ERS時，表達增多的GRP78可通過3個內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白啟動其下游的信號分子CHOP蛋白表達增加而介導(dǎo)細胞凋亡[10]。CHOP蛋白是一個特異性的ERS轉(zhuǎn)導(dǎo)因子[11]，是ERS通路中一個由抗凋亡向促凋亡轉(zhuǎn)換的重要的信號分子[12]。

免疫組化法和Western blot法均顯示ERS的標志蛋白GRP78和ERS誘導(dǎo)的細胞凋亡信號蛋白CHOP的表達量在砷中毒模型組肝組織均較對照組都明顯增高，在MT治療組都明顯回降，與肝細胞凋亡變化和肝損傷一致。提示砷中毒致大鼠肝損傷中存在ERS通路的激活，ERS誘導(dǎo)的細胞凋亡參與了砷中毒致大鼠肝損傷發(fā)生機制，并與肝組織的抗氧化能力降低相關(guān)。

綜上所述，本研究提示在治療大鼠砷中毒肝損傷過程中，MT可能通過其抗氧化作用減輕肝細胞氧化損傷[6]，有減少肝細胞ERS,降低GRP78和CHOP的表達，從而減輕ERS誘導(dǎo)的肝細胞凋亡，達到改善肝損傷的目的。上述結(jié)果為使用MT治療砷中毒肝損傷提供了新的思路。

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Metallothionein decreases the expression of GRP78 and CHOP proteins followed by apoptosis of liver cells in arsenic poisoning rats

XUE Qi-xiang1, SHEN Xue1, TIAN Tian1, HAN Bing1, XIE Ru-jia1, HE Yan2, YANG Qin1*

(1.Dept. of Pathophysiology; 2.Dept. of Physiology, Guiyang Medical College, Guizhou 550004, China)

Objective To investigate the function of GRP78 and CHOP in the process of reducing apoptosis of liver cells in arsenic poisoning rats by metallothionein.Methods The model of NaAsO2-induced liver injury and then treated with MT for two weeks was established.Apoptosis in liver was detected by TUNEL method. The expression levels of GRP78 and CHOP proteins in liver tissue were detected by immunohistochemistry and Western blot.ResultsThe apoptosis of liver cells and the expression of GRP78 and CHOP proteins in the arsenic poisoning model group were higher than that of the control group(P<0.05).The apoptosis of liver cells and the expression of GRP78 and CHOP proteins in the treatment group with MT were lower than that of the arsenic poisoning model group(P<0.05), but still higher than that of the control group(P<0.05).Conclusions MT may reduce apoptosis of liver cells in arsenic poisoning rats by decreasing expression of GRP78 and CHOP proteins.

metallothionein; arsenic poisoning; liver injury; apoptosis; endoplasmic reticulum stress; GRP78; CHOP

2014- 12- 26

2015- 03- 30

國家自然科學(xué)基金(81100284，81460484)

1001-6325(2015)06-0739-05

R363

A

*通信作者(corresponding author)：qinyang@gmc.edu.cn