金海丹，周憲春，張松男，林貞花，金鐵峰*

(延邊大學(xué) 1.腫瘤研究所; 2.延邊大學(xué)附屬醫(yī)院 腫瘤科, 吉林 延吉 133002)

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Mortalin促進人乳腺癌細胞MDA-MB231的惡性進展

金海丹1#，周憲春1#，張松男2，林貞花1，金鐵峰1*

(延邊大學(xué) 1.腫瘤研究所; 2.延邊大學(xué)附屬醫(yī)院 腫瘤科, 吉林 延吉 133002)

全球每年有超過100萬乳腺癌新發(fā)病例，轉(zhuǎn)移是其難治的主要原因。Mortalin又名HSP70，是熱休克蛋白(Heat Shock Proteins)家族中的一員，最初發(fā)現(xiàn)于鼠胚胎纖維母細胞[1]。肝癌、結(jié)直腸癌和卵巢癌等的研究表明，Mortalin在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起到了重要的作用，但Mortalin在乳腺癌的研究較少。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition EMT)是腫瘤發(fā)生遷移、侵襲，維持干細胞樣特征及抗凋亡的關(guān)鍵步驟[2]。本實驗旨在研究Mortalin對人乳腺癌MDA-MB231細胞生物學(xué)行為的影響，探討其促進腫瘤惡性進展的可能機制，為臨床治療乳腺癌提供新的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料：MDA-MB231(簡稱M- 231)細胞系(ATCC)；RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco公司)、胰蛋白酶(Santa Cruz 公司)；鼠抗人 Mortalin抗體(Sigma公司)。ECL試劑盒(Pierce公司)，基質(zhì)膠(BD公司)，Transwell板(Corning公司)，EMT相關(guān)抗體(Cell signaling公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及慢病毒轉(zhuǎn)染：人乳腺癌細胞系M- 231置于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2常規(guī)培養(yǎng)。含人Mortalin的慢病毒載體由上海Genechem公司構(gòu)建、包裝并進行測序證實。用1×107個慢病毒傳導(dǎo)單位和空載體的病毒上清液分別感染3×103個M- 231細胞。感染96 h后，用嘌呤霉素(1 mg/L)篩選穩(wěn)定表達Mortalin的靶細胞。最后利用Western blot法鑒定Mortalin的表達情況。

1.2.2 MTT比色法檢測細胞增殖能力：取對數(shù)增殖期的M- 231及M- 231/Mor細胞以2×103個/孔接種于96孔板中，每組設(shè)5個平行復(fù)孔。分別于24、48和72 h后加入50 μL/孔的MTT，4 h后棄上清，加入200 μL/孔的DMSO，輕輕振蕩數(shù)分鐘，應(yīng)用全波長多功能酶標儀，在570 nm波長處測定其吸光度值，并計算細胞生存率。

1.2.3 Western blot 檢測：將M- 231及M- 231/Mor細胞以冷PBS洗2次后提取總蛋白；BCA法測定蛋白濃度；8%SDS聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳進行蛋白分離；轉(zhuǎn)至PVDF膜上；室溫下?lián)u床封閉(TBST+5%脫脂奶粉)2 h；加入一抗；4 ℃過夜；洗膜后加入辣根過氧化物酶二抗；孵育2 h；ECL曝光；觀察并拍照；實驗重復(fù)3次。

1.2.4 細胞體外侵襲實驗：在transwell 小室(Corning公司)濾膜的上表面鋪以100 μL matrigel(1 mg/mL, Becton-dickinson公司)于37 ℃作用1 h 備用。以3×105個細胞加入transwell小室的上室中，下室加入含10%胎牛血清的DMEM，37 ℃培養(yǎng)箱孵育24 h，用棉簽擦凈膜上室面細胞，HE染色后，在倒置顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 Mortalin過表達M- 231細胞系的建立:建立Mortlin高表達細胞株M- 231/Mor后檢測蛋白表達發(fā)現(xiàn)其Mortalin，p-Akt及Akt的表達均升高(P<0.05)(圖1，表1)。

表1 M- 231與M- 231/Mor相對蛋白表達

groupmortalinP-Akttotal-AktM-2310.153±0.0320.254±0.0110.352±0.016M-231/Mor0.431±0.086**1.168±0.036**0.505±0.053*

*P<0.05,**P<0.01 compared with M- 231.

圖1 M- 231與M- 231/Mor蛋白表達比較Fig 1 Compared of the protein expression with M- 231 and M- 231/Mor

2.2 M- 231/Mor較M- 231具有更高的增殖及遷移能力:在48及72 h， M- 231/Mor較M- 231細胞增殖能力明顯增強(P<0.01)(圖2)。M- 231/Mor細胞的遷移率明顯高于M- 231細胞(圖3)。

*P<0.01 compared with M- 231 group圖2 M- 231/Mor增殖能力明顯增強Fig 2 Significantly enhanced the proliferation in M- 231/Mor cells

圖3 Mortalin過表達誘導(dǎo)乳腺癌細胞侵襲性增強Fig 3 Mortalin enhanced the migration in M- 231 cells(×100)

2.3 Mortalin誘導(dǎo)M- 231細胞EMT發(fā)生:M- 231/Mor上皮表型標志物E-cadherin表達明顯下調(diào)，同時間質(zhì)表型vimentin及fibronectin表達明顯上調(diào)(圖4，表2)。

圖4 Mortalin對EMT相關(guān)標志物表達的影響Fig 4 The impact of Mortalin on the expression of EMT-related markers

groupE-cadherin/β-actinvimentin/β-actinfibronectin/β-actinM-2311.811±0.0241.014±0.0230.085±0.011M-231/Mor0.065±0.014**1.371±0.041*0.221±0.016**

*P<0.05,**P<0.01 compared with M- 231 group.

3 討論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，早期原位癌生存率較高，而一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移其預(yù)后較差。因此，找出參與乳腺癌發(fā)生轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子靶點和信號通路是治療乳腺癌的關(guān)鍵。Mortalin蛋白在許多人類腫瘤中表達上調(diào)，有研究證實Mortalin蛋白過表達可以促進乳腺癌細胞的惡性進展[3]。目前有關(guān)EMT與惡性腫瘤發(fā)生浸潤、侵襲及轉(zhuǎn)移的研究已經(jīng)成為腫瘤治療新的熱點。在EMT起始階段，上皮E-鈣黏蛋白(E-cadherin)表達下調(diào)是EMT最重要的生物學(xué)標志[4]，其他如間質(zhì)標志物波形蛋白(vimentin)、纖維連接蛋白(fibronectin)等的表達增強，共同促使細胞骨架重排，運動遷移能力增加，上皮來源的細胞向間質(zhì)來源的細胞轉(zhuǎn)化完成。

通過慢病毒轉(zhuǎn)染成功構(gòu)建Mortalin過表達的乳腺癌細胞系M- 231/Mor。研究結(jié)果表明，較之轉(zhuǎn)染前的M- 231細胞系，Mortalin表達明顯上調(diào)，而且癌基因Akt及其磷酸化蛋白p-Akt表達也明顯增強。同時Mortlin具有促進腫瘤細胞的增殖及侵襲的能力。進一步的研究結(jié)果表明，Mortalin促進E-cadherin表達下調(diào)及vimentin、fibronectin的表達上調(diào)。

綜上所述，Mortalin蛋白可以促進乳腺癌細胞MDA-MB231的惡性進展，其機制部分是通過誘導(dǎo)其EMT的發(fā)生而實現(xiàn)的。Mortalin蛋白有望成為臨床判斷乳腺癌預(yù)后并為其分子靶向治療提供新的靶點。

[1] Renu Wadhwa, Sunil C.Kaul, Yoji Ikawa,etal. Identification of a novel member of mouse hsp70 family. Its association with cellular mortal phenotype [J]. J Biol Chem, 1993, 268:6615- 6621.

[2] Ru P, Steele R, Newhall P,etal. miRNA- 29b suppressesprostate cancer metastasis by regulating epithelial-mesenchymal transition signaling [J]. Mol Cancer Ther, 2012, 11:1166- 1173.

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2014- 07- 04

2014- 10- 22

國家自然科學(xué)基金(61371067)

1001-6325(2015)06-0833-03

R 734.2； R 730.5

A

*通信作者(corresponding author)：jintf@ybu.edu.cn

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