陸勇剛 張靜敏 孫 維 陶 炯中國福利會國際和平婦幼保健院 （上海 200030）

1例45, X45, X不育癥男性的分子遺傳學(xué)特征

陸勇剛 張靜敏 孫 維 陶 炯*
中國福利會國際和平婦幼保健院 （上海 200030）

摘要目的 從1例45, X不育癥男性的分子遺傳學(xué)特征探討無精子癥或少弱精子癥患者的遺傳缺陷與精子生成障礙的關(guān)系，分析部分患者不育原因是否可能與染色體異常有關(guān)。方法 采用常規(guī)染色體、FISH及分子檢測技術(shù)，對該患者進(jìn)行遺傳學(xué)分析。結(jié)果 常規(guī)染色體檢測顯示該患者核型為45,X,dic(Y;13)(q12;p11)。且易位的染色體中只有一個著絲粒具有活性，其中72%的細(xì)胞Y染色體著絲粒失活，13號染色體著絲粒收縮，具有活性，其余28%的細(xì)胞13號染色體著絲粒失活。FISH與分子遺傳學(xué)分析證實患者13號短臂增加部分來源于Y染色體，Y斷裂位點位于q12異染色質(zhì)區(qū)。近端包括AZF和SRY在內(nèi)的所有Y常染色體部分與13號染色體短臂融合，形成一條雙著絲粒染色體。其13號染色體與Y染色體功能基因區(qū)未發(fā)生任何缺失。核型描述為45,X,dic(Y;13) (q12;p11).ish(SRY+, DYZ3+, GLP13+)。結(jié)論 本例遺傳學(xué)分析結(jié)果提示部分男性不育癥可能是由Y/常染色體易位造成減數(shù)分裂異常，導(dǎo)致生精受阻，精子生成大量減少而引發(fā)不育。

關(guān)鍵詞不育, 男性; 45, X男性; 易位, 遺傳

男性不育與染色體異常關(guān)系密切，發(fā)生的比率與精子數(shù)量成反比。不育癥男性中染色體異常的發(fā)生率約為2%～8%，是普通人群中發(fā)生染色體異常概率的100倍，無精子癥男性中的比率上升至16%[1, 2]。常見的有性染色體數(shù)目異常（主要為XXY）和結(jié)構(gòu)異常。

Y染色體易位是一種Y染色體結(jié)構(gòu)異常，目前認(rèn)為其造成不育的機(jī)制可能有兩種：其一可能是由于易位引起的Y染色體AZF（azoospermic factor）基因缺失所致。AZF基因定位于Y常染色質(zhì)q11區(qū)，與精子發(fā)生相關(guān)，其部分或完全缺失可導(dǎo)致精子發(fā)生異常[3]。而在AZF基因完整卻發(fā)生精子缺乏的Y染色體易位人群中，其原因可能與減數(shù)分裂時性染色體聯(lián)會異常有關(guān)，形成一個異常的性小體（sex body），最終導(dǎo)致精子發(fā)生停止[4]。

45,X是一種特殊的Y染色體易位，通常為Y染色體短臂上性別決定因子SRY基因易位至常染色體上，至今只有30余例報道。本文描述了一例核型為45,X的不育癥男性，并通過常規(guī)染色體、FISH及分子檢測，探討其不育癥發(fā)生原因，以及輔助生育的潛在遺傳風(fēng)險。

材料和方法

一、病例

一對夫婦，男30歲，女27歲，因結(jié)婚4年不育要求輔助生育。夫婦倆否認(rèn)家族中有先天性畸形、遺傳性疾病史。外生殖器及其他常規(guī)體格檢查無異常發(fā)現(xiàn)。男方精液檢查顯示為嚴(yán)重少精子，每4～5個低倍視野見0-1個形態(tài)較好活動精子。睪丸病理未獲得，并不知道其生精情況。

二、常規(guī)染色體核型分析

患者外周血淋巴細(xì)胞經(jīng)PHA刺激體外培養(yǎng)，常規(guī)制備染色體， G顯帶、C顯帶。

三、染色體熒光原位分析（FISHFISH）

我們分別采用SRY/X著絲粒探針與13（GLP13 14）/21號探針以及X/Y（DYZ3）著絲粒探針與18號著絲粒探針對其中期染色體進(jìn)行雜交。以此判斷Y的存在，及其易位形式。

13號染色體長臂q14和21號染色體長臂q22區(qū)域特異探針[GLP13（綠色）/GLP21（紅色）]以及18、X、Y染色體著絲粒探針[CSP18（湖藍(lán)色）/CSP X（綠色）/CSP Y（紅色）]購自北京金菩嘉醫(yī)療科技有限公司，Y染色體短臂SRY探針和X著絲粒探針購自美國Vysis公司。FISH檢測按公司操作手冊，雜交后染色體經(jīng)DAPI復(fù)染后在OLYMPUS BX51正置熒光顯微鏡下鏡檢。圖像由JENOPTIK（Prog Res MF cool）冷CCD采集，Video Test-Fish 2.0軟件分析。

四、AZFAZF基因區(qū)的分子檢測

為了確定Y染色體斷裂位點及AZF的缺失情況，應(yīng)用Y染色體STS標(biāo)記進(jìn)行PCR分析。我們采用酚氯仿抽提法從該患者的外周血淋巴細(xì)胞抽取了基因組DNA，PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，EB染色。選擇的STS位點如下：AZYa: SY84、SY86；AZYb: SY124；AZFc: SY157、SY255（DAZ）；異染色質(zhì)區(qū): SY160。

結(jié) 果

一、常規(guī)染色體核性分析

患者外周血淋巴細(xì)胞經(jīng)常規(guī)染色體制備G顯帶后，計數(shù)50個細(xì)胞，所有細(xì)胞的染色體數(shù)目都為45條，缺少一條性染色體。選取顯帶分辨率在400～500條帶的細(xì)胞經(jīng)過核型配對后發(fā)現(xiàn)一條13號染色體與Y染色體發(fā)生易位，形成一條雙著絲粒染色體。其中28%（14/50）的細(xì)胞Y染色體著絲粒收縮，具有活性，13號染色體著絲粒失活（圖1A1A），72% （36/50）的細(xì)胞Y染色體著絲粒失活，13號染色體著絲粒收縮，具有活性（圖1B1B）。C顯帶未見Y異染色質(zhì)區(qū)（Yqh），Y斷裂位點不清楚（圖1C1C）。

圖1 患者染色體G帶和C帶核型圖

圖2 患者染色體核型FISHFISH結(jié)果

二、染色體熒光原位分析（FISHFISH）

采用13號染色體長臂q14 的位點特異探針和Y染色體上的SRY探針同時與患者的中期染色體進(jìn)行雜交，證實13號染色體短臂增加的遺傳物質(zhì)來源于Y染色體，進(jìn)一步用Y著絲粒探針證實易位的染色體包括了雙著絲粒（圖2）。結(jié)合FISH與常規(guī)染色體檢測結(jié)果，我們可以得出Y長臂斷裂后易位至13號染色體短臂，形成一條雙著絲粒染色體，其SRY存在。

三、AZFAZF基因區(qū)的分子檢測

分子檢測結(jié)果顯示SY84、SY86、SY124、SY157、SY255及SY160都存在（圖3），Y染色體斷裂位點位于q12位置，AZF基因沒有任何缺失。

核型為45,X,dic(Y;13)(q12;p11).ish (SRY+, DYZ3+, GLP13+)。

圖3 患者AZYAZY基因檢測結(jié)果

討 論

本文報告了一例核型為45,X的不育癥男性。45, X核型的患者通常為Turner綜合征女性，臨床表現(xiàn)為身材矮小，原發(fā)性卵巢發(fā)育不良。45, X男性極為罕見，世界各地至今僅見30余例報道。Hsu認(rèn)為“純粹的”45, X男性不可能存在，該類男性的異常核型是由Y染色體上性別決定基因區(qū)域易位到常染色體上所致，其實質(zhì)是一種特殊的Y染色體易位[5]。Y染色體易位至常染色體時會發(fā)生遺傳物質(zhì)的丟失，當(dāng)易位點附近的常染色體遺傳物質(zhì)缺失時，患者通常會有相應(yīng)的常染色體單體表現(xiàn)[6, 7]，如生長發(fā)育遲緩、智力落后、多發(fā)畸形等。當(dāng)易位點附近的Y染色體遺傳物質(zhì)缺失時，患者表現(xiàn)為不同程度的精子缺乏[8, 9]，這是由于Y染色體上的AZF基因缺失所致。AZF基因位于Y常染色質(zhì)q11區(qū)，主要分為3個功能區(qū)AZFa、AZFb 及AZFc，其一個或多個區(qū)域的缺失會導(dǎo)致精子發(fā)生缺陷。最常見的缺失位于AZFc區(qū)，它含有一個DAZ （deleted in azoospermia）多基因家族，這個基因的缺失表現(xiàn)最輕微，雖然同樣表現(xiàn)為精子缺乏，但睪丸組織還能檢出精子，可進(jìn)行人工輔助生育；而AZFb及以上部位的缺失，精子發(fā)生則完全停止，睪丸組織亦不能檢出精子存在[3, 10]。

本例患者Y染色體易位未造成13號染色體與Y染色體功能基因的缺失。FISH及Y染色體STS分析顯示，患者Y染色體是在長臂q12異染色質(zhì)區(qū)處斷裂，近端包括AZF和SRY在內(nèi)的幾乎所有的Y常染色體部分與13號染色體短臂融合，形成一條雙著絲粒染色體。易位造成13號染色體隨體柄和頭的缺失以及Y染色體q12異染色質(zhì)區(qū)和PAR2的缺失，這些區(qū)域中都為重復(fù)序列，不含功能性常染色質(zhì)。綜合結(jié)果提示，本例患者的不育癥很可能是由Y染色體易位造成XY性染色體配對異常，形成異常的XY小體，導(dǎo)致生精受阻。一些研究表明[4, 11]在精母細(xì)胞減數(shù)分裂前期，XY性染色體聯(lián)會形成一個性小體（sex body），性染色體開始高度凝集并失活，與Y易位的常染色體連帶著一起被拖入性泡，失活同時擴(kuò)展到常染色體部分。正常情況下常染色體與性染色體轉(zhuǎn)錄是不同步的，性染色體先失活后轉(zhuǎn)錄，而正是由于部分常染色體與性染色體同步失活，導(dǎo)致減數(shù)分裂停止，精母細(xì)胞凋亡。

Siffroi、Buonadonna等[12, 13]的研究也表明男性不育可能與減數(shù)分裂異常相關(guān)，其報道的病例AZF未發(fā)生任何缺失，卻表現(xiàn)了嚴(yán)重的精子缺乏癥狀。然而Wimmer、Morales等[14, 15]報道了二個家系中攜帶Y/常染色體易位的男性生育能力似乎未受影響。他們的易位形式完全一樣，唯一區(qū)別是生育能力不受影響的男性，其易位染色體中的Y著絲?？偸欠€(wěn)定失活的，而有精子缺乏表現(xiàn)的男性易位染色體著絲粒存在不同比例的失活。最新研究表明著絲粒除了裝配動粒的功能外，還具有同源染色體配對的功能，在減數(shù)分裂早期染色體通過著絲粒間的不同接觸，確認(rèn)同源染色體，然后形成交叉配對[16]。因此對于易位常染色體著絲粒失活的細(xì)胞，兩條常染色體可能不能聯(lián)會，形成不聯(lián)會染色質(zhì)減數(shù)分裂沉默（meiotic silencing f unsynapsed chromatin，MSUC），也就是失活[17]。同時這條易位染色體表現(xiàn)為Y染色體，減數(shù)分裂時與染色體形成性小體，導(dǎo)致常染色體失活，細(xì)胞凋亡。而對于Y染色體著絲粒失活的細(xì)胞，這條易位染色體表現(xiàn)為常染色體，與正常染色體配對不會形成MSUC。并且XY染色體的配對是通過其短臂假常染色體區(qū)（PAR）實現(xiàn)的，Y染色體著絲粒失活可能并不影響XY的聯(lián)會及性小體的形成，因此減數(shù)分裂可能不受影響。本例不育患者也發(fā)現(xiàn)了易位染色體著絲粒存在不同比例的失活，其中72%的細(xì)胞Y染色體著絲粒失活，這類細(xì)胞減數(shù)分裂可能是不受影響的，其余28%的細(xì)胞13號染色體著絲粒失活，可能會引起減數(shù)分裂異常。然而外周血比例并不能代表生殖腺的比例，該患者生殖腺13號染色體著絲粒失活的細(xì)胞有可能更多，但是我們并沒有采集該組織標(biāo)本，還需進(jìn)一步驗證。這些異常情況都有概率發(fā)生少弱精子癥的可能。

綜上所述，本例患者是Y與13號常染色體易位，形成一條雙著絲粒染色體，這類不平衡性易位很少見，但由于未產(chǎn)生任何功能基因組的缺失，因此沒有表現(xiàn)相關(guān)染色體異常癥狀。盡管我們未得到睪丸組織病理情況，但是其少弱精子癥的發(fā)生可能是由于性染色體配對時連帶常染色體一起失活而引起生殖細(xì)胞減數(shù)分裂障礙導(dǎo)致生精受阻，具有明確的病因。其染色體異常不僅可能引起不孕不育，也可能進(jìn)一步導(dǎo)致懷孕后胎兒流產(chǎn)?；颊呱臣?xì)胞通過2:1的分離后可能產(chǎn)生以下6種精子：23,X、22,t(Y;13)、23,t(Y;13),X、23,t(Y;13),+13、22,-X、22,X,-13。其中一種是正常的，一種是平衡攜帶者，其余都是異常的。如果其睪丸組織中可以獲得足夠的精子行輔助生育，那么子代發(fā)生遺傳缺陷的風(fēng)險很高，有可能宮內(nèi)流產(chǎn)或出生嚴(yán)重畸形的患兒，有必要作植入前診斷或產(chǎn)前染色體檢查。而且少弱精程度與染色體異常發(fā)生率成正相關(guān)，因此我們有必要對這類不孕不育患者都做一下染色體檢查，這不管是為了明確其不育原因還是后續(xù)治療處理都有顯著臨床價值。

參 考 文 獻(xiàn)

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（2014-09-10收稿）

doi:10.3969/j.issn.1008-0848.2015.01.009

中圖分類號R 698.2

*通訊作者, E-mail: taojiong@hotmail.com

Molecular genetic characteristic of male infertility with 45,X

Lu Yonggang, Zhang Jingmin, Sun Wei, Tao Jiong*The International Peace Maternity & Child Health Hospital of China Welfare Institute, Shanghai 200030, China Corresponding author: Tao Jiong, E-mail: taojiong@hotmail.com

AbstractObjective To explore the relationship between spermatogenesis disorder and genetic defects of patients with azoospermia or severe oligospermia，and analyze the possible effcets of chromosome abnormalities on male infertilities. Methodsthods Conventional cytogenetic, fluorescent in-situ hybridization(FISH) and molecular study were performed in the study to detect chromosome abnormalities. Resultssults The conventional cytogenetic analysis showed 45,X,dic(Y;13)(q12;p11) karyotype and the translocation chromosome had only one active centromere. In most of the cell(72%), the Y chromosome centromere was inactivated and the chromosome 13 centromere constricted, with activation. In the remaining cells(36%), the chromosome 13 centromere was inactivated. FISH and molecular studies confirmed the translocation of Y chromosome on the short arm of chromosome 13, and the Y breakpoint is on q12. This dicentric chromosome included the short arm, the centromere and the intact long-arm euchromatin of the Y chromosome and the centromere and the long arm of chromosome 13. There was no any deletion of the functional gene in Y chromosome and chromosome 13. The karyotype was 45,X,dic(Y;13) (q12;p11).ish (SRY+, DYZ3+, GLP13+). Conclusionusion This result suggestss that male infertility might be related to meiotic disturbances with spermatogenetic arrest in Y/Autosome translocations，which could result in infertility by reduction of sperm production.

Key wordsords infertility, male; 45,X male; translocation, genetic