董玲玲，楊 星，范 強(qiáng)，郝利華，萬仁玲

（中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 海淀 100081）

氟喹諾酮類藥物因能通過干擾DNA、RNA及蛋白質(zhì)的合成而起殺菌作用，而被廣泛使用。但一些不法生產(chǎn)企業(yè)為提高產(chǎn)品療效而非法添加處方外藥物。目前，根據(jù)監(jiān)督抽檢中發(fā)現(xiàn)的問題，有添加解熱鎮(zhèn)痛類藥物的現(xiàn)象。參考已建立的一些非法添加檢查方法[1-2]，本研究以薄層色譜法進(jìn)行初篩，以高效液相色譜方法進(jìn)行確證，建立了氟喹諾酮類制劑中非法添加對乙酰氨基酚和安乃近的檢查方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器與試劑 高效液相色譜儀（Waters 2695，PDA，Empower2色譜工作站軟件）；分析天平（十萬分之一）；磷酸二氫鈉、氫氧化鈉為分析純；甲醇為色譜純。

1.2 試藥 對乙酰氨基酚：（批號：10116942，Al?faAesar）；安乃近：（批號：950811，南通制藥廠）。陰性供試品：恩諾沙星、煙酸諾氟沙星、氧氟沙星、鹽酸環(huán)丙沙星可溶性粉及注射液；供試品：恩諾沙星可溶性粉（按1%添加安乃近）、乳酸環(huán)丙沙星注射液。氟喹諾酮類對照品均來自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜方法

2.1.1 檢驗(yàn)方法 取供試品1.0 g或1.0 mL，置50 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲處理5 min，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。另取對乙酰氨基酚和安乃近對照品，分別加甲醇制成每1 mL中含對乙酰胺氨基酚或安乃近1 mg的溶液，作為對照品溶液。取上述溶液各5μL，點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以乙酸乙酯-乙醇（1∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（254 nm）下檢視：氟喹諾酮類藥物在原點(diǎn)顯藍(lán)色熒光斑點(diǎn)，陰性供試品色譜中，在與對照品相應(yīng)位置未顯示與對照品相同顏色的熒光斑點(diǎn)，無干擾。供試品色譜中，在對照品色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。

圖1 薄層色譜結(jié)果

2.1.2 薄層色譜檢測限 取對乙酰氨基酚對照品，分別加甲醇制成每1 mL中含0.1 mg的溶液，取0.5、1、2、5、10、20 μL，點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，在上述薄層色譜條件下，展開，取出，晾干，置紫外光燈（254 nm）下檢視，結(jié)果顯示，點(diǎn)樣體積為1μL時，斑點(diǎn)基本可見，故確定在該薄層色譜條件下對乙酰氨基酚檢測限為0.1μg。另取安乃近對照品同法操作，結(jié)果顯示，點(diǎn)樣體積為2μL時，斑點(diǎn)基本可見，故確定安乃近檢測限為0.2μg。

2.2 高效液相色譜法

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；磷酸鹽緩沖液（取磷酸二氫鈉3.0 g，加水1000 mL使溶解，加三乙胺0.5 mL，用氫氧化鈉飽和溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0）為流動相A，甲醇為流動相B，按表1進(jìn)行梯度洗脫；二極管陣列檢測器，采集波長范圍為200 nm～400 nm，分辨率為1.2 nm；記錄244 nm波長處的色譜圖。對乙酰氨基酚、安乃近、4-甲基安替比林（MAA）與氟喹諾酮類藥物的分離度應(yīng)大于1.5。

2.2.2 溶液配制

表1 流動相梯度洗脫表

2.2.2.1 供試品溶液和對照品溶液 取供試品2.0 g或2.0 mL，置50 mL量瓶中，加甲醇適量超聲5 min后，用甲醇稀釋至刻度，搖勻；量取1.0 mL，置25 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。另取對乙酰氨基酚、安乃近對照品適量，分別加甲醇溶解并稀釋制成每1 mL中含0.1 mg的溶液，作為對照品溶液。

2.2.2.2 氟喹諾酮類制劑空白溶液 取陰性供試品2.0 g或2.0 mL，置50 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲5 min，加甲醇至刻度；取1.0 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻。

圖2 系統(tǒng)適用性色譜光譜

2.2.3 測定法 取上述各溶液10μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖與光譜圖。

2.2.4 峰純度檢查 對供試品溶液色譜圖中對乙酰氨基酚、安乃近色譜峰進(jìn)行峰純度檢查，結(jié)果顯示，對乙酰氨基酚峰與安乃近峰的純度角度均小于純度閾值，表明在此液相條件下，對乙酰氨基酚峰與安乃近的出峰處無其他干擾峰，為單一物質(zhì)峰，方法可行。

2.2.5 光譜相似度檢查 對供試品溶液中對乙酰氨基酚峰、安乃近峰的光譜圖與對照品的進(jìn)行匹配，匹配角度均小于匹配閾值，表明供試品溶液中相應(yīng)色譜峰的光譜與對乙酰氨基酚、安乃近對照品的光譜非常相似，可認(rèn)為是同一物質(zhì)。

圖3 供試品色譜光譜圖1

圖4 供試品色譜光譜圖2

2.2.6 檢出限 取陰性供試品2.0 g或2.0 mL，置50 mL量瓶中，加1 mg/mL的對乙酰氨基酚溶液0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL或5 mg/mL的安乃近儲備液 1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL，加甲醇至刻度，搖勻；精密量取1 mL，置25 mL量瓶，加甲醇至刻度，搖勻。以光譜圖失真的最大濃度作為方法的檢出限，對乙酰氨基酚檢出限為0.5μg/g（mL），安乃近檢出限為5 μg/g（mL）。

2.2.7 回收率試驗(yàn) 取陰性供試品2.0 g或2.0 mL，精密加對乙酰氨基酚對照品適量，按2.2.2.1法制備回收率試驗(yàn)溶液，平行配制6份。立即測定并計(jì)算，對乙酰氨基酚平均回收率為101.2%，RSD為0.5%；另取安乃近對照品及氟喹諾酮類可溶性粉，同法操作，安乃近平均回收率為101.0%，RSD為0.5%。

2.2.8 耐用性 從柱溫、流動相pH值、色譜柱3個方面考察方法的耐用性。調(diào)節(jié)柱溫為20℃、25℃和30℃，隨柱溫升高，保留時間略提前，但差異小于0.2 min；調(diào)節(jié)流動相pH值為6.8、7.0和7.2，保留時間幾乎不變；選擇4款不同品牌、填料的色譜柱進(jìn)行考察，分離度均大于1.5，結(jié)果顯示方法耐用性較好。

3 討論

按《中國獸藥典》2010年版一部對某企業(yè)乳酸環(huán)丙沙星注射液進(jìn)行檢驗(yàn)時發(fā)現(xiàn)，在液相色譜圖中除環(huán)丙沙星色譜峰外還有一異常峰，根據(jù)光譜圖形狀及最大吸收，懷疑可能為解熱鎮(zhèn)痛類藥物峰。通過薄層色譜法與對乙酰氨基酚、安乃近對照品斑點(diǎn)進(jìn)行比對，懷疑可能摻入了對乙酰氨基酚，并通過高效液相色譜法（PDA法）進(jìn)行了確證。

安乃近遇水迅速水解成活性代謝物4-甲氨基安替比林（MAA）[3]，故選擇純甲醇作為溶媒。而氟喹諾酮類注射劑均為水溶液，在進(jìn)行回收率試驗(yàn)時，色譜圖中會出現(xiàn)MAA色譜峰，且隨著樣品放置時間的延長，MAA峰面積會增大。此時，以安乃近與MAA峰面積之和計(jì)算，平均回收率為101.0%，RSD為0.7%，與未產(chǎn)生MAA色譜峰的安乃近平均回收率結(jié)果一致。故當(dāng)氟喹諾酮類注射液中摻入安乃近時，僅以安乃近色譜峰計(jì)算會使結(jié)果偏低，故應(yīng)考慮以安乃近與MAA峰面積之和計(jì)算安乃近的摻入量。

4 結(jié)論

本檢驗(yàn)方法中薄層色譜法展開時間短，且氟喹諾酮類藥物在原點(diǎn)顯藍(lán)色熒光斑點(diǎn)，能迅速篩查出是否含有非法添加物。再通過保留時間及光譜圖與對照品的進(jìn)行比對，能實(shí)現(xiàn)氟喹諾酮類制劑中非法添加對乙酰氨基酚、安乃近的高效、快速、準(zhǔn)確識別。

本檢驗(yàn)方法針對4種氟喹諾酮類可溶性粉及注射液，用于其他氟喹諾酮類制劑時，需進(jìn)行空白試驗(yàn)和系統(tǒng)適用性試驗(yàn)。

[1]李文莉，萬勝利，趙勇，等.天麻膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中補(bǔ)充檢驗(yàn)對乙酰氨基酚的方法[J].藥物分析雜志，2013，33（6）：1041-1044.

[2]郝利華，董玲玲，于曉輝，等.薄層色譜法快速篩選黃芪多糖注射液中非法添加的化學(xué)物質(zhì)[J].中國獸藥雜志，2012，46（5）：29-30.

[3]沈金燦，龐國芳，謝麗琪，等.牛和豬肌肉組織中安乃近代謝物殘留的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析[J].分析化學(xué)，2007，35（11）：1565-1569.