詹羽姣，盛 萍，張鵬葛，安露莎，張 煊

(新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830011)

貝母屬(Fritillaria L.)為百合科多年生草本植物，全世界約有130種，分布于北溫帶，尤以地中海地區(qū)、亞洲東部至中部和北美洲的種類為多。我國(guó)有貝母屬植物61種，50個(gè)變種，5變型，其中具藥用價(jià)值的植物有20余種，主要分布于四川、新疆、甘肅、湖北、安徽、浙江等省。該屬大多數(shù)鱗莖供藥用，有清熱潤(rùn)肺，止咳祛痰的功效，在我國(guó)有悠久的用藥歷史［1］?！吨袊?guó)藥典》2010年版收載的貝母藥材有川貝母、浙貝母、伊貝母等，其中伊貝母包括新疆貝母Fritillaria walujewii Rege.、伊犁貝母 F.pallidiflora Schrenk 2種植物的干燥鱗莖［2］。因其野生品種僅分布在新疆［3］，故當(dāng)?shù)厝艘矊⒋?種植物的干燥鱗莖統(tǒng)稱為新疆貝母。而實(shí)際上，新疆分布量較豐富的其他6種貝母如黃花貝母F.verticillaea、額敏貝母F.meleagris等的干燥鱗莖也同時(shí)入藥使用。新疆貝母屬的藥用貝母主要分布于新疆塔城地區(qū)、吉木薩爾縣、新源縣、霍城縣、鞏留縣、吉木乃等的山區(qū)及草地，分布范圍廣泛，生態(tài)分布多樣，具有較好的資源基礎(chǔ)，因此，對(duì)新疆貝母屬藥用貝母植物資源的開發(fā)及遺傳研究具有重要的意義。

近年來(lái)新型分子標(biāo)記技術(shù)ISSR(Inter simple sequence repeat內(nèi)部簡(jiǎn)單序列重復(fù)區(qū)間擴(kuò)增)，已廣泛應(yīng)用于植物品種鑒定及遺傳多樣性分析等研究中［4－6］。但其反應(yīng)體系受到多種因素的影響，故ISSR－PCR反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化是重要的前提和基礎(chǔ)。2012年王果平等［7］通過(guò)改良的CTAB法提取基因組DNA，利用單因素和L9(34)正交試驗(yàn)建立了新疆貝母ISSR－PCR體系，但對(duì)于體系的延長(zhǎng)時(shí)間和循環(huán)次數(shù)未見考察，且CTAB法提取的總基因組純度較試劑盒法低。因此，本實(shí)驗(yàn)采用課題組已優(yōu)化的總基因組提取方法試劑盒法提取總DNA，結(jié)合單因素試驗(yàn)和L16(45)正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，對(duì)ISSR－PCR反應(yīng)體系的影響因素:Mg2+、dNTPs、引物濃度、Taq DNA聚合酶、模板DNA濃度進(jìn)行優(yōu)化，并確定最適循環(huán)次數(shù)、延伸時(shí)間和退火溫度。綜合評(píng)價(jià)以確立最優(yōu)的新疆貝母屬藥用貝母ISSR－PCR體系，為新疆貝母屬8種藥用貝母的遺傳多樣性分析提供依據(jù)。

1 材料與儀器

實(shí)驗(yàn)材料于2012年5—6月從新疆不同產(chǎn)地采集，每個(gè)產(chǎn)地隨機(jī)選取樣品植株，每株采集其幼嫩葉置于硅膠袋中迅速干燥，然后置－20℃冰箱中保存，試驗(yàn)樣品經(jīng)新疆貝母專家段咸珍及新疆醫(yī)科大學(xué)盛萍教授鑒定，樣品信息見表1，憑證標(biāo)本存放于新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院中藥資源教研室。

表1 新疆貝母屬藥用貝母供試種類及產(chǎn)地

Plant Genomic DNA Kit(TIANGEN BIOTECH)(離心柱型)試劑盒，Taq DNA聚合酶，dNTPs，Mg2+，10 × Buffer，2000 kb DNA Maker，Gelview，瓊脂糖凝膠等。引物根據(jù)加拿大哥倫比亞大學(xué)公布的第9套ISSR引物序列，由上海生工有限公司合成。

Anke TGL－16C離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);DYY－7C型電泳儀(北京六一儀器廠);Bio－Rad C1000 PCR擴(kuò)增儀(BIO－RAD美國(guó));瓊脂糖凝膠成像儀(上海培清科技有限公司);K5500核酸蛋白測(cè)定儀等。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法

2.1.1 總DNA的提取及檢測(cè)

通過(guò)課題組前期對(duì)貝母屬藥用貝母總DNA提取方法(改良的CTAB法、改良的SDS法與試劑盒法)的比較研究，得出試劑盒法最佳。故實(shí)驗(yàn)采用試劑盒Plant Genomic DNA Kit(離心柱型)提取植物基因組總DNA，操作步驟參照說(shuō)明。所得基因組DNA用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性，用核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)其濃度及純度，并將總DNA濃度稀釋至50 ng/μL至4℃冰箱備用。

2.1.2 ISSR－PCR反應(yīng)體系單因素試驗(yàn)

經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)初步從74條引物中選出條帶清晰多態(tài)性好的UBC853引物，伊犁貝母基因組作為模板DNA，用于單因素考察，對(duì)影響新疆貝母屬植物總DNA的 ISSR－PCR反應(yīng)的 Mg2+、Taq DNA聚合酶、dNTPs、Primer和模板DNA因素分別設(shè)置8個(gè)不同梯度的處理:Mg2+濃度設(shè)置為0.5 mmol/L、1.0 mmol/L、1.5 mmol/L、2.0 mmol/L、2.5 mmol/L、3.0 mmol/L、3.5 mmol/L、4.0 mmol/L;Taq DNA聚合酶濃度設(shè)置為 0.5 U、0.75 U、1.0 U、1.25 U、1.5 U、1.75 U、2.0 U、2.25 U;dNTPs濃度設(shè)置為0.05 mmol/L、0.1 mmol/L、0.15 mmol/L、0.2 mmol/L、0.25 mmol/L、0.3 mmol/L、0.35 mmol/L、0.4 mmol/L;Primer 濃度設(shè)置為 0.1 μmol/L、0.2 μmol/L、0.4 μmol/L、0.6 μmol/L、0.8 μmol/L、1.0 μmol/L、1.2 μmol/L、1.5 μmol/L;模板 DNA 濃度設(shè)置為0.1 ng/μL、0.25 ng/μL、0.5 ng/μL、1.0 ng/μL、1.5 ng/μL、2.0 ng/μL、2.5 ng/μL、3.0 ng/μL。每個(gè)因素最佳水平范圍確定后作為后續(xù)正交設(shè)計(jì)因素水平的基礎(chǔ)條件。退火溫度考察:在PCR儀上設(shè)置 8個(gè)梯度，即 54.0℃、53.6℃、52.8℃、51.5 ℃、49.8 ℃、48.4 ℃、47.5 ℃、47.0 ℃;循環(huán)次數(shù)考察:設(shè)定循環(huán)次數(shù)為35 cycle、38 cycle、40 cycle、45 cycle;延長(zhǎng)時(shí)間考察:設(shè)定延長(zhǎng)時(shí)間為 5 min、6min、7 min、8 min、9 min、10 min、11 min、12 min。反應(yīng)體系 50 μL，每個(gè)體系包含 5 μL 10 ×Buffer。根據(jù)引物Tm值及預(yù)實(shí)驗(yàn)，單因素試驗(yàn)中反應(yīng)程序設(shè)定為:95℃預(yù)變性7 min;95℃變性30 s;50℃退火45 s;72℃延伸90 s;45個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min;4℃保存。

2.1.3 ISSR－PCR反應(yīng)體系正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)

根據(jù)對(duì)ISSR－PCR各項(xiàng)單因素試驗(yàn)考察結(jié)果分析，確定影響PCR反應(yīng)的Mg2+、Taq DNA聚合酶、dNTPs、Primer和模板DNA因素的最佳范圍(見表2)，選取引物UBC853進(jìn)行5因素4水平優(yōu)化，選用L16(45)正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)表(見表3)，表中共16個(gè)處理，每個(gè)處理做3次重復(fù)，來(lái)確定最佳反應(yīng)體系。

表2 ISSR－PCR反應(yīng)體系的因素水平

表3 ISSR－PCR正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表L16(45)

2.1.4 擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)

擴(kuò)增所得的產(chǎn)物用Gelview染色，DL 2000 DNA Maker作為相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，用2%的瓊脂糖凝膠于115 V電壓下電泳50 min，在紫外凝膠成像系統(tǒng)下觀察拍照。

2.1.5 ISSR－PCR優(yōu)化體系穩(wěn)定性檢測(cè)

利用上述已建立的ISSR－PCR反應(yīng)體系，對(duì)74條引物進(jìn)行2次篩選，并選用擴(kuò)增結(jié)果清晰，多態(tài)性好，穩(wěn)定性高的16條引物對(duì)23份新疆貝母屬8種藥用貝母進(jìn)行DNA擴(kuò)增，對(duì)已確立的優(yōu)化體系進(jìn)行驗(yàn)證，檢測(cè)其穩(wěn)定性。

2.2 ISSR－PCR的單因素試驗(yàn)

2.2.1 Mg2+濃度對(duì)ISSR－PCR反應(yīng)的影響

Mg2+濃度是影響ISSR－PCR的重要因素之一，可影響引物與模板的結(jié)合率，濃度過(guò)高會(huì)增強(qiáng)背景干擾，過(guò)低將降低擴(kuò)增產(chǎn)率［8］。且Taq DNA聚合酶是Mg2+依賴性酶，對(duì)其濃度非常敏感，故Mg2+濃度對(duì)PCR反應(yīng)至關(guān)重要。由圖1可看出:濃度為2.0 mmol/L、2.5 mmol/L 時(shí)條帶最為清晰，故選擇 2.0 mmol/L、2.5 mmol/L 上下的1.5 mmol/L、2.0 mmol/L、2.5 mmol/L、3.0 mmol/L 水平作為ISSR－PCR 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的Mg2+水平范圍。

2.2.2 Taq DNA聚合酶濃度對(duì)ISSR－PCR反應(yīng)的影響

Taq DNA聚合酶對(duì)ISSR－PCR擴(kuò)增結(jié)果有著顯著影響，濃度過(guò)高產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增，濃度過(guò)低會(huì)降低新鏈的合成效率，則無(wú)法擴(kuò)增［9］。由圖2可以看出:隨著濃度增加條帶出現(xiàn)彌散，故選擇1.0 U上下的0.75 U、1.00 U、1.25 U、1.50 U 水平作為 ISSR－PCR正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的Taq DNA聚合酶水平范圍。

2.2.3 dNTPs濃度對(duì)ISSR－PCR反應(yīng)的影響

dNTPs是ISSR－CR反應(yīng)中磷酸基團(tuán)的主要來(lái)源，濃度過(guò)高可增加反應(yīng)速度但增加堿基的錯(cuò)誤參入率，低濃度可提高實(shí)驗(yàn)精確性但導(dǎo)致反應(yīng)速度下降，甚至?xí)驗(yàn)閐NTPs的過(guò)早消耗而使產(chǎn)物單鏈化。由圖3可以看出:0.30 mmol/L條帶豐富且清晰，0.15 mmol/L、0.20 mmol/L、025 mmol/L 條帶豐富，故選擇 0.15 mmol/L、0.20 mmol/L、025 mmol/L、0.30 mmol/L水平作為ISSR－PCR正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的dNTPs水平范圍。

2.2.4 Primer濃度對(duì)ISSR－PCR反應(yīng)的影響

不同濃度的引物對(duì)擴(kuò)增結(jié)果的影響較為明顯，引物濃度過(guò)低擴(kuò)增引物下降，濃度過(guò)高會(huì)增加引物二聚體形成［10］。由圖4 可以看出:1.0 μmol/L 條帶最清晰，故選擇1.0 μmol/L 上下的0.6 μmol/L、0.6 μmol/L、1.0 μmol/L、1.2 μmol/L 水平作為 ISSR－PCR正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的Primer水平范圍。

2.2.5 模板DNA濃度對(duì)ISSR－PCR反應(yīng)的影響

模板DNA濃度也是ISSR－PCR反應(yīng)的影響因素之一，由圖5可以看出:濃度由小到大條帶依次變明亮，但隨著濃度增大條帶略有彌散。故選擇0.25 ng/μL、0.5 ng/μL、1.0 ng/μL、1.5 ng/μL 水平作為ISSR－PCR正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的模板DNA水平范圍。

2.2.6 退火溫度的確定

設(shè)定不同梯度的退火溫度，由圖6可以看出:54.0 ℃、53.6 ℃無(wú)條帶;52.8 ℃、51.5 ℃、47.0 ℃均有不同程度的彌散;49.8 ℃、48.4 ℃、47.5 ℃條帶明亮清晰，考慮引物 UBC853的理論 Tm值為53.9℃，47.5℃溫度較低，故最終確立引物引物UBC853的最適退火溫度為49.8℃。

2.2.7 循環(huán)次數(shù)的確定

由圖7可以看出:35 cycle、38 cycle條帶有彌散;40 cycle 2條條帶穩(wěn)定性差;45 cycle的2條條帶均較豐富且明亮清晰，說(shuō)明45cycle較穩(wěn)定，為最佳循環(huán)次數(shù)。

2.2.8 延長(zhǎng)時(shí)間的確定

由圖8 可以看出:5 min、6 min、7 min、11 min 條帶暗;8 min、9 min、10 min、12 min 條帶較豐富明亮，但8 min、9 min、12 min均出現(xiàn)了不同程度的彌散。綜合比較，延長(zhǎng)時(shí)間10 min的條帶清晰豐富明亮，故為最佳延長(zhǎng)時(shí)間。

2.3 ISSR－PCR的正交試驗(yàn)直觀分析

根據(jù)L16(45)正交試驗(yàn)PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果(圖9)，16個(gè)處理3組重復(fù)均有譜帶產(chǎn)生。依據(jù)譜帶的強(qiáng)弱和雜帶的多少對(duì)PCR擴(kuò)增結(jié)果依次打分。條帶數(shù)量豐富、清晰的最佳產(chǎn)物記16分;最差的計(jì)1分，分別對(duì)重復(fù)3次的擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行3次獨(dú)立計(jì)分(見表2)。以特異普帶多態(tài)性高，主帶清晰，背景干擾低及實(shí)驗(yàn)成本為考慮原則，初步選定12組為新疆貝母屬貝母ISSR－PCR的最佳反應(yīng)體系。

2.4 ISSR－PCR正交試驗(yàn)方差分析

用SPSS 18.0軟件對(duì)上述處理評(píng)分結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表4。由F值可看出，該正交設(shè)計(jì)中，各因素對(duì)體系的影響大小依次為:Mg2+＞TaqDNA聚合酶＞模板DNA＞dNTPs＞引物。各因素的P值均小于0.05，說(shuō)明這些因素水平間均存在顯著差異，可進(jìn)一步進(jìn)行因素內(nèi)的多重比較分析。采用S－N－K法對(duì)各因素不同水平的結(jié)果進(jìn)行多重比較，以確定各因素的最佳水平。

2.4.1 Mg2+濃度

隨著 Mg2+濃度從1.5 mmol/L ～3.0 mmol/L 增加，評(píng)分結(jié)果均值由小變大再變小，當(dāng)增加到2.5 mmol/L時(shí)均值最大，且與其他3個(gè)水平之間差異均達(dá)到極顯著水平。故Mg2+選擇2.5 mmol/L為最佳濃度。

2.4.2 dNTPs濃度

隨著 dNTPs濃度從 0.15 mmol/L ～0.30 mmol/L增加，評(píng)分結(jié)果均值由小變大，當(dāng)增加到0.30 mmol/L時(shí)均值最大，且與其他3個(gè)水平之間差異均達(dá)到極顯著水平。故dNTPs濃度選擇0.30 mmol/L為最佳濃度。

2.4.3 引物濃度

隨著 Primer濃度從 0.6 μmol/L ～ 1.0 μmol/L增加，評(píng)分結(jié)果均值下降趨勢(shì)，到1.2 μmol/L評(píng)分結(jié)果上升。0.8 μmol/L與1.0 mmol/L水平之間差異達(dá)到極顯著水平，與 0.6 mmol/L、1.2 mmol/L 水平之間沒有顯著差異。因此，引物濃度選擇0.8 μmol/L為最佳濃度。

2.4.4 Taq DNA 聚合酶

Taq DNA聚合酶在0.75 U～1.50 U之間評(píng)分結(jié)果均值呈下降趨勢(shì)，且水平0.75 U與其他3個(gè)水平之間差異均達(dá)到極顯著水平。故Taq DNA聚合酶最佳用量為0.75 U。

2.4.5 模板DNA濃度

模版 DNA 在0.25 ng/μL ～1.5 ng/μL 之間評(píng)分結(jié)果均值呈上升趨勢(shì)，且水平 1.00 ng/μL與0.25 ng/μL、0.50 ng/μL 水平之間有顯著差異，與1.50 ng/μL水平之間沒有顯著差異。因此，選擇模版DNA的最佳濃度為1.00 ng/μL。

表4 正交設(shè)計(jì)方差分析

2.5 ISSR－PCR優(yōu)化體系的穩(wěn)定性檢測(cè)

利用上述已建立的ISSR－PCR反應(yīng)體系，從74條引物中篩選出16條條帶清晰，多態(tài)性好，穩(wěn)定性高的引物(見表5)。運(yùn)用最優(yōu)組合對(duì)23份新疆貝母屬8種藥用貝母進(jìn)行DNA擴(kuò)增(16條引物的ISSR－PCR擴(kuò)增結(jié)果見表5，部分引物擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果見圖9)，以對(duì)確立的優(yōu)化體系進(jìn)行驗(yàn)證，檢測(cè)其穩(wěn)定性。

由表4可以看出，16條引物共擴(kuò)增出條帶199條，其中多態(tài)性條帶195條，多數(shù)集中在250 bp～1600 bp處，不同的引物擴(kuò)增出的條帶數(shù)在6條～20條，每個(gè)引物的多態(tài)性百分率為 83.33% ～100%，多態(tài)性比率為97.99%。

從圖9及表4中可以看出擴(kuò)增條帶豐富清晰，重復(fù)性好，多態(tài)性高。說(shuō)明建立的新疆貝母屬ISSR－PCR反應(yīng)體系穩(wěn)定可靠，可進(jìn)一步用于后續(xù)新疆貝母屬8種藥用貝母的分子標(biāo)記研究中。

表5 用于新疆貝母屬藥用貝母總DNA的ISSR－PCR反應(yīng)的引物序列、退火溫度及擴(kuò)增結(jié)果

3 討論

ISSR是一種基于PCR反應(yīng)基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)，其擴(kuò)增結(jié)果的穩(wěn)定性、特異性和重復(fù)性受到因素Taq DNA 聚合酶、dNTPs、Mg2+、引物濃度、模板 DNA含量的影響。本研究通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)確定了適合的因素水平范圍，由方差分析結(jié)果得出因素Mg2+對(duì)反應(yīng)體系的影響最大，其余因素的影響大小依次為TaqDNA 聚合酶、模板 DNA、dNTPs、引物。

退火溫度、循環(huán)次數(shù)、延長(zhǎng)時(shí)間對(duì)反應(yīng)體系也有顯著的影響。這些在王果平［7］的研究中未見考察說(shuō)明。退火溫度過(guò)高會(huì)影響引物和模板的結(jié)合，條帶較弱;退火溫度過(guò)低會(huì)產(chǎn)生過(guò)多雜帶。退火溫度實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，試驗(yàn)中的引物UBC853的最適退火溫度為49.8℃與其理論退火溫度(Tm值53.9℃)相差4.1℃，說(shuō)明最適退火溫度應(yīng)在理論退火溫度值的基礎(chǔ)上降低4℃～5℃。本實(shí)驗(yàn)曾對(duì)循環(huán)次數(shù)和延長(zhǎng)時(shí)間做過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)，通過(guò)循環(huán)次數(shù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在小于35 cycle時(shí)，幾乎無(wú)條帶，故設(shè)定循環(huán)次數(shù)為35、38、40、45 cycle，每個(gè)循環(huán)平行做兩組，發(fā)現(xiàn) 40、45 cycle條帶強(qiáng)弱合適，40 cycle的兩組條帶中一組有彌散，說(shuō)明40 cycle穩(wěn)定性略差，45 cycle條帶均較好，穩(wěn)定性好。延長(zhǎng)時(shí)間同樣影響著擴(kuò)增結(jié)果，延長(zhǎng)時(shí)間過(guò)短，譜帶暗淡，過(guò)長(zhǎng)譜帶不穩(wěn)定，而10 min得到的條帶強(qiáng)弱合適，清晰可辨，故延長(zhǎng)時(shí)間為10 min最佳。

單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)可直觀快速的表現(xiàn)出各因素對(duì)反應(yīng)體系的影響，正交試驗(yàn)?zāi)荏w現(xiàn)各因素間互作效應(yīng)的特性。本實(shí)驗(yàn)較王果平［7］研究中單因素的5水平梯度，將水平設(shè)定增加至8個(gè)梯度，考察范圍更加廣泛;正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)為5因素4水平重復(fù)3次進(jìn)行評(píng)分，降低主觀因素的影響， 最終結(jié)合單因素試驗(yàn)與正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，確定新疆貝母屬藥用貝母的ISSR－PCR最佳反應(yīng)體系(50 μL):5 μL 10 × Buffer 、2.5 mmol/L Mg2+、0.30 mmol/L dNTPs 、0.8 μmol/L 引物、0.75 U Taq 酶、1.0 ng/μL 模板 DNA、33.35 μL ddH2O。這與王果平［7］的研究結(jié)果 20 μL 體系有所不同，50 μL 體系雖耗用試劑較多，但增加了實(shí)驗(yàn)的精準(zhǔn)性，降低操作中由移液器帶來(lái)的不可避免的誤差，更加穩(wěn)定可靠。UBC853的最適退火溫度為49.8℃，體系循環(huán)次數(shù)為45 cycle，延伸時(shí)間10 min。且通過(guò)此體系篩選出了16條適合于新疆貝母屬藥用貝母的ISSR引物，對(duì)新疆貝母屬8種藥用貝母共23份樣品進(jìn)行ISSR－PCR擴(kuò)增加以驗(yàn)證，得到結(jié)果重復(fù)性好，多態(tài)性高，說(shuō)明確立的ISSR－PCR優(yōu)化體系適用于新疆貝母屬藥用貝母，為進(jìn)一步研究新疆貝母屬8種藥用貝母的遺傳多樣性打下基礎(chǔ)。

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