陳 剛，周 謙，王 旻*，顧覺(jué)奮*

(1.中國(guó)藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，天然藥物活性組分與藥效國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 210009;2.江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院心血管科，江蘇南京 210028)

紫杉醇(paclitaxel，商品名taxol)，是一線(xiàn)抗腫瘤藥物，20世紀(jì)60年代中期，在太平洋紅豆杉(Taxus brevifolia)樹(shù)皮中被發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)30年的研究和臨床試驗(yàn)，于1992年12月29日，被美國(guó)食品藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)為治療卵巢癌新藥。目前臨床和科研所需的紫杉醇主要是從紅豆杉中直接提取，但是紫杉醇在植物體中平均僅含0.015%，大量砍伐會(huì)導(dǎo)致樹(shù)種瀕臨滅絕。同時(shí)，紫杉醇本身資源很匱乏，且植株生長(zhǎng)緩慢，這對(duì)紫杉醇的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用造成了很大的困難?；瘜W(xué)合成雖已完成，但由于產(chǎn)量低，經(jīng)費(fèi)高，不具有產(chǎn)業(yè)化意義。半合成方法雖比較成熟，但需要消耗大量紅豆杉樹(shù)木，與直接提取的方法并無(wú)本質(zhì)區(qū)別，仍不能從根本上解決資源匱乏的問(wèn)題，組織培養(yǎng)法因其成本高而難以大規(guī)模生產(chǎn)。顯然，尋找紫杉醇的新來(lái)源具有十分重要的意義。

植物內(nèi)生真菌(Plant Endophytic Fungi)是指生長(zhǎng)于植物組織的內(nèi)部，分布于葉鞘、種子、花、莖、葉片和根中度過(guò)全部或近乎全部生活周期而不引起明顯病害癥狀的一類(lèi)微生物。內(nèi)生真菌長(zhǎng)期生活在植物體內(nèi)的特殊環(huán)境中，并與宿主協(xié)同進(jìn)化，可能產(chǎn)生與宿主相同或相似的具有生物活性的次生代謝產(chǎn)物。1993年美國(guó)化學(xué)家 Stierle和植物病理學(xué)家Strobel最早從短葉紅豆杉(Taxus brevifolia)的韌皮部分離出一株產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌Taxomyces andreanae，產(chǎn)量約為25～50 ng/L發(fā)酵液體積。此后，各國(guó)學(xué)者紛紛開(kāi)展紫杉醇內(nèi)生真菌的研究工作，陸續(xù)從西藏紅豆杉、云南紅豆杉、歐洲紅豆杉、中國(guó)紅豆杉等分離到產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌，其宿主植物幾乎涉及紅豆杉的各個(gè)種。此外，研究人員在與紅豆杉有相同環(huán)境要求的其它植物中也分離到了可產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌。利用真菌發(fā)酵產(chǎn)紫杉醇與從植物中提取有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，真菌不僅能在簡(jiǎn)單的培養(yǎng)基上良好生長(zhǎng)，產(chǎn)生大量的發(fā)酵產(chǎn)物，還可以在生物反應(yīng)器中人為控制各種參數(shù)，并可通過(guò)誘變育種等手段改變菌種性能以提高紫杉醇產(chǎn)量，因此便于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的實(shí)現(xiàn)，前景十分廣闊;而且對(duì)于植物來(lái)源天然藥物新生成途徑的開(kāi)發(fā)及瀕危藥用植物的保護(hù)具有十分重要的經(jīng)濟(jì)及生態(tài)效益。因此，利用內(nèi)生真菌生產(chǎn)紫杉醇是解決藥源問(wèn)題的有效途徑［1］。

圖1 紫杉醇的化學(xué)結(jié)構(gòu)

1 產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌的分離與鑒定方法

1.1 產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌的分離與培養(yǎng)方法［2－3］

從宿主植物分離內(nèi)生真菌主要有兩種方法:⑴標(biāo)準(zhǔn)的真菌分離純化方法。取健壯的植物組織，用清水沖洗干凈，再用75%酒精、0.1%升汞等進(jìn)行消毒，用無(wú)菌水漂洗剩余消毒劑后將外層組織削去，內(nèi)部組織削成小片，置入添加青霉素或鏈霉素的PDA培養(yǎng)基或水瓊脂培養(yǎng)基中，菌絲長(zhǎng)出后，采用尖端菌絲挑取法挑取形態(tài)不同的菌絲置于新的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。⑵平板灌注法。將外皮層除去，再用酒精、升汞等消毒，無(wú)菌水漂洗，將組織樣品加入適量無(wú)菌水中，放入研缽中充分研磨，取勻漿注入融化的PDA培養(yǎng)基中，搖勻，置平板，25℃恒溫培養(yǎng)。待菌絲長(zhǎng)出后，挑取其尖端接種至新的培養(yǎng)基上，據(jù)此，不斷純化直至純培養(yǎng)，斜面保存?zhèn)溆谩?/p>

培養(yǎng)基的種類(lèi)與培養(yǎng)條件的選擇對(duì)菌種的生長(zhǎng)與代謝產(chǎn)物的積累是非常重要的，目前，常用的培養(yǎng)基有馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA)、察氏培養(yǎng)基、馬丁氏培養(yǎng)基及麥芽浸膏瓊脂培養(yǎng)基或是與酵母浸膏結(jié)合的培養(yǎng)基等。培養(yǎng)溫度與pH值反應(yīng)自然條件情況，典型的溫度范圍是18～25℃，pH自然。培養(yǎng)過(guò)程中還可以通過(guò)添加誘導(dǎo)物、代謝產(chǎn)物合成抑制劑及前體物質(zhì)以促進(jìn)紫杉醇的積累。常用的誘導(dǎo)物有植物激素、無(wú)機(jī)離子、多糖、茉莉酸等。通過(guò)添加代謝產(chǎn)物合成抑制劑可以抑制其它次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成，常用的有麥角固醇、酪氨酸、RNA酶抑制劑、硫酸氧礬等。添加前體物質(zhì)可通過(guò)增加底物量來(lái)加快反應(yīng)速度、提高產(chǎn)率，如10－去乙酰巴卡亭Ⅲ和巴卡亭Ⅲ等。

1.2 產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌的鑒定［4］

傳統(tǒng)的菌種鑒定是根據(jù)菌群的性狀、形態(tài)特征、生長(zhǎng)特性及生理生化指標(biāo)等方面的相近或相異的程度加以歸并或分開(kāi)，再根據(jù)這些菌群相互之間差異的大小和親緣關(guān)系遠(yuǎn)近的區(qū)別，列為綱、目、科、屬、種等分類(lèi)單位。如果通過(guò)這些處理后還不能查出菌種的歸類(lèi)，那就以新的種屬來(lái)對(duì)待。

由于某些真菌的屬、種之間形態(tài)學(xué)或生理生化差異極不顯著，而且形態(tài)特征有時(shí)會(huì)受環(huán)境因素的影響，常規(guī)條件下培養(yǎng)產(chǎn)孢會(huì)比較困難，所以采用傳統(tǒng)的分類(lèi)方法對(duì)菌株進(jìn)行分類(lèi)鑒定相當(dāng)困難。隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，近年來(lái)已形成多種全新的方法，如DNA中的(G+C)%含量測(cè)定、核酸雜交技術(shù)、限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析、電泳核型分析、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA分析、多位點(diǎn)酶電泳、β－微管蛋白(TB)基因的序列對(duì)比等，其中，rDNA序列分析由于快速、簡(jiǎn)便及高特異性顯示出了極大的優(yōu)勢(shì)，一系列分子標(biāo)記應(yīng)用于真菌的分類(lèi)鑒定中，rDNA是rRNA基因以及與之相鄰的間隔區(qū)的合稱(chēng)，真核生物的 rDNA序列均有非常明顯的特點(diǎn)，18S，5.8S，28S rDNA基因序列進(jìn)化緩慢而相對(duì)保守，但這3個(gè)基因序列之間的ITS序列的進(jìn)化則相當(dāng)迅速，所以，可利用其保守區(qū)設(shè)計(jì)通用引物，對(duì)其變異區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增和對(duì)擴(kuò)增片段測(cè)序，然后與DNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)中的已有序列進(jìn)行對(duì)比，通過(guò)分析同源性，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)等得到真菌的分類(lèi)地位，ITS區(qū)序列分析可獲得屬、種間、種內(nèi)的分類(lèi)地位廣泛適用于較低分類(lèi)階元。若只需獲得系統(tǒng)發(fā)育中種級(jí)以上的分類(lèi)地位，則可對(duì)18S rDNA或28S rDNA進(jìn)行分析，其中18S比28S基因更保守，所以更多的用于界、門(mén)、綱、目、科、屬、種間的分類(lèi)分析。目前，在產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌的鑒定中，人們往往采取形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)相結(jié)合的策略，以期最準(zhǔn)確的獲得菌種的分類(lèi)地位。

2 紫杉醇的提取與檢測(cè)技術(shù)

2.1 紫杉醇的提取

進(jìn)行提取之前首先要獲得足夠的發(fā)酵產(chǎn)物，先將菌種接至基本培養(yǎng)基上一段時(shí)間，獲得足夠菌絲后，再接種至發(fā)酵培養(yǎng)基上積累次生代謝產(chǎn)物。例如Li等［5］將F.mairei K178在基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d后，按5%的接種量接入500 mL的錐形瓶中，170 r/min，25℃培養(yǎng)12 d。也有學(xué)者直接利用改良的MID培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，例如Pandi等在每升MID培養(yǎng)基中加入1 g蛋白胨，對(duì)菌株Botryodiplodia theobromae Pat.培養(yǎng) 22 d，而后進(jìn)行紫杉醇的提?。?］。

紫杉醇的提取要全面考慮預(yù)處理方法，所用溶劑，濃縮的溫度、壓力等條件。常用有機(jī)溶劑，如氯仿、甲醇、乙酸乙酯等。同時(shí)，不同的提取方法也會(huì)對(duì)結(jié)果帶來(lái)一定影響。Pandi等［7］將發(fā)酵產(chǎn)物過(guò)濾除菌絲體，濾液加入Na2CO3，且邊加邊振蕩，以除脂肪酸的污染，用2倍體積的二氯甲烷進(jìn)行提取，收集有機(jī)相，35℃下減壓濃縮，所得固體用甲醇溶解。Chen等則將菌絲體攪拌均勻后，直接用甲醇進(jìn)行提取，離心并收集上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去有機(jī)溶劑，加入等體積蒸餾水和次甲基氯化物溶解固體并進(jìn)行提取，待有機(jī)相揮發(fā)后再用甲醇溶解過(guò)柱純化。Dai等將發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行離心并收集上清液，菌絲體攪拌15～20 min以釋放目標(biāo)產(chǎn)物，離心，合并兩組上清液，50℃濃縮至原體積的1/3，用氯仿提取，提取物加Na2SO4在35℃下濃縮，所得固體再用甲醇溶解［2］。

2.2 紫杉醇的檢測(cè)

真菌發(fā)酵液中紫杉醇的測(cè)定可用TLC、HPLC、MTLC、HPLC/LC－MS、MS、微管蛋白依賴(lài)的生物化學(xué)檢測(cè)、受體蛋白介導(dǎo)的生物測(cè)定法、免疫分析法、生物活性測(cè)定等。通常情況下，樣品的HPLC與標(biāo)準(zhǔn)品停滯時(shí)間在誤差范圍內(nèi)相近，加上質(zhì)譜分子量譜，可以初步判斷是紫杉醇。若單獨(dú)采用HPLC檢測(cè)是不足以確定所測(cè)樣品就是紫杉醇，因?yàn)橛行┪镔|(zhì)具有與紫杉醇相近的滯留時(shí)間，如球毛殼甲素、三尖杉寧堿等。HPLC－MS法的主要特點(diǎn)是高速、高壓、高效及高靈敏度，是目前較常用的方法，然而需要對(duì)樣品事先處理，工作費(fèi)時(shí)、繁重，且對(duì)儀器要求較高，尤其是對(duì)活性形式不能有效識(shí)別。微管蛋白依賴(lài)的生物學(xué)方法則不能夠檢測(cè)有潛在價(jià)值的非活性同源物，如巴卡亭Ⅲ或10－去乙酰巴卡亭Ⅲ?；谑荏w蛋白的生物學(xué)測(cè)定對(duì)紫杉醇具有一定的特異性，而且擁有抗原與抗體反應(yīng)相似的可逆性，但它不能有效識(shí)別紫杉醇類(lèi)似物及其代謝產(chǎn)物，交叉反應(yīng)性比較弱僅能對(duì)紫衫烷中某一種或某一類(lèi)有效識(shí)別，具有一定的局限性。ELISA檢測(cè)通常采用競(jìng)爭(zhēng)抑制免疫酶分析法(competitive inhibition enzyme immunoassay，CIEIA)，該法是利用對(duì)紫杉醇有專(zhuān)一特性的單抗進(jìn)行測(cè)定，簡(jiǎn)單易行，靈敏度高，能夠大批量的處理樣品，在檢測(cè)極低濃度的紫杉醇時(shí)優(yōu)勢(shì)更為突出，但費(fèi)用昂貴，且對(duì)紫杉醇和其結(jié)構(gòu)類(lèi)似物多烯紫杉醇識(shí)別率不高。生物學(xué)活性檢測(cè)有對(duì)癌細(xì)胞毒性、動(dòng)物細(xì)胞的毒性及卵菌的敏感性等方法。以上方法的聯(lián)合使用，往往更能提供可信的證據(jù)［8－9］。

3 產(chǎn)紫衫醇的內(nèi)生真菌

到目前為止，研究者發(fā)現(xiàn)能產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌已有20多個(gè)屬(部分見(jiàn)表1)，隨著植物內(nèi)生真菌研究的深入，越來(lái)越多的產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌被發(fā)現(xiàn)，這充分說(shuō)明了產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌的物種多樣性。Kumaran等從日本紅豆杉的葉中分離到的Phomopsis BKH27，紫杉醇產(chǎn)量達(dá)到了418μg/L，是最早分離到的產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌Taxomyces andreanae 8360倍，經(jīng)測(cè)試對(duì)人腫瘤細(xì)胞有很強(qiáng)的細(xì)胞毒作用［10］。程首先等以從紅豆杉樹(shù)皮中分離得到的高產(chǎn)紫杉醇菌013為出發(fā)菌株，采用紫外線(xiàn)誘變、亞硝基胍誘變交替進(jìn)行的方法，同時(shí)復(fù)合含1%乙酰胺的理性化篩選模型，獲得一株遺傳性狀穩(wěn)定的鏈格孢單孢變種ST026，搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量可穩(wěn)定達(dá)到227000 μg/L，比出發(fā)菌株產(chǎn)量提高81.6%，已進(jìn)入中試和產(chǎn)業(yè)化研究［11］。Zhang等利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，將農(nóng)桿菌與產(chǎn)紫杉醇的Cladosporium cladosporioides MD2協(xié)同培養(yǎng)，使紫杉醇合成的限速酶過(guò)量表達(dá)，發(fā)現(xiàn)對(duì)紫杉醇的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化有所幫助［12］。Soliman等將紅豆杉內(nèi)生真菌Paraconiothyrium SSM001與同樣來(lái)源的Alternaria屬內(nèi)生菌共同培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)紫杉醇產(chǎn)量達(dá)到了原來(lái)的3倍，再加入同樣來(lái)源的Phomopsis屬內(nèi)生菌時(shí)產(chǎn)量達(dá)到原來(lái)的8倍，這些結(jié)果證明相同植物宿主的內(nèi)生菌群可以直接或間接地影響紫杉醇的合成［26］。

表1 產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌(2004年)

4 存在的問(wèn)題與前景

通過(guò)真菌發(fā)酵生產(chǎn)紫杉醇具有明顯的優(yōu)勢(shì)，但其產(chǎn)業(yè)化道路并不平坦，還存在著一些亟待解決的重大問(wèn)題。如產(chǎn)率低是制約產(chǎn)業(yè)化的一個(gè)重要因素，產(chǎn)量越高，對(duì)細(xì)胞的毒害作用就越嚴(yán)重，菌株生長(zhǎng)速度也就減慢，生長(zhǎng)緩慢又限制了紫杉醇的產(chǎn)量。再如產(chǎn)紫杉醇的穩(wěn)定性，據(jù)報(bào)道產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌Taxomyces andreanae無(wú)法重復(fù)獲得紫杉醇，可能原因有紫杉醇并非最終產(chǎn)物，不同的培養(yǎng)時(shí)間和條件，可能轉(zhuǎn)化成其它紫杉烷或者被分解?；蚪M的不穩(wěn)定性也可能導(dǎo)致合成紫杉醇的某些基因的丟失。

解決以上問(wèn)題可從幾方面入手:一是繼續(xù)從自然界中篩選更好的適合發(fā)酵的原始出發(fā)菌株;二是對(duì)現(xiàn)有高產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌進(jìn)行菌種改造，以期能夠產(chǎn)生大量菌絲體來(lái)提高紫杉醇產(chǎn)量，如誘變育種、原生質(zhì)體融合、構(gòu)建基因工程菌等;三是優(yōu)化發(fā)酵工藝，可以采取優(yōu)化培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基成分、添加誘導(dǎo)物、前體物質(zhì)及代謝產(chǎn)物抑制物等方法。相信隨著研究的深入，紫杉醇合成機(jī)制的進(jìn)一步揭示及一系列基礎(chǔ)問(wèn)題的解決以生產(chǎn)紫杉醇為目的的微生物產(chǎn)業(yè)途徑前景光明。

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