詹羽姣，盛 萍，姚 藍(lán)，史 紅，張 煊

(新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830011)

貝母是一種常用中藥，在我國(guó)有悠久的用藥歷史［1］。2010年版《中國(guó)藥典》收載的貝母藥材有川貝母、浙貝母、伊貝母等，其中伊貝母包括新疆貝母Fritillaria walujewii、伊犁貝母 F.pallidiflora 2種植物的干燥鱗莖［2］。在臨床應(yīng)用方面與川貝母相同，是中醫(yī)處方和中成藥生產(chǎn)常用的名貴藥材。因其野生品種僅分布在新疆［3］，故新疆當(dāng)?shù)厝艘矊⒋?種植物的干燥鱗莖統(tǒng)稱為新疆貝母。而實(shí)際上，在民間，新疆分布量較豐富的其他6種貝母如黃花貝母F.verticillaea、額敏貝母F.meleagris等的干燥鱗莖也同時(shí)入藥使用，導(dǎo)致國(guó)內(nèi)藥材市場(chǎng)一直處于新疆貝母品種嚴(yán)重混亂現(xiàn)狀，而貝母屬植物鱗莖形態(tài)較為相似，難以用傳統(tǒng)鑒別方法鑒定藥材品種，臨床療效令人堪憂。

目前對(duì)新疆貝母屬藥用植物的研究，主要集中在化學(xué)成分、生物堿類成分含量測(cè)定、藥理作用等方面［4－6］。而ISSR這種新型分子標(biāo)記技術(shù)，也已廣泛應(yīng)用于植物品種鑒定及遺傳多樣性分析等研究中［7－9］。但有關(guān)新疆貝母屬藥用植物的ISSR分子標(biāo)記的報(bào)道僅見(jiàn)于王果平等對(duì)新疆貝母屬植物的初步研究［10］，然而，這些對(duì)于新疆貝母屬藥用貝母遺傳多樣性分析及種的準(zhǔn)確鑒定仍顯不足。本文運(yùn)用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)，采用POPGEN和NTSYS軟件對(duì)新疆貝母屬分布量較豐富的8種藥用貝母進(jìn)行遺傳多樣性綜合分析，擬從DNA分子特證進(jìn)行品種分類鑒別，探討新疆分布廣泛的8種藥用貝母種間親緣關(guān)系，促進(jìn)新疆貝母屬藥用貝母的合理利用及資源保護(hù)，為保證臨床安全、合理用藥提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料

Plant Genomic DNA Kit(TIANGEN BIOTECH)(離心柱型)試劑盒，Taq DNA 聚合酶，dNTPs，Mg2+，10 × Buffer，2000kb DNA Marker，Gelview 等。引物根據(jù)加拿大哥倫比亞大學(xué)公布的第9套ISSR引物序列，由上海生工有限公司合成。實(shí)驗(yàn)材料于2012年5～6月從新疆不同產(chǎn)地采集，經(jīng)新疆貝母專家段咸珍及新疆醫(yī)科大學(xué)盛萍教授鑒定，樣品信息見(jiàn)表1，憑證標(biāo)本存放于新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院中藥資源教研室。

表1 新疆貝母屬8種藥用貝母種質(zhì)來(lái)源信息表

1.2 儀器

Anke TGL－16C離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);DYY－7C型電泳儀(北京六一儀器廠);Bio－Rad C1000 PCR擴(kuò)增儀(BIO－RAD美國(guó));瓊脂糖凝膠成像儀(上海培清科技有限公司)等。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法

2.1.1 基因組總DNA提取及檢測(cè)

采用試劑盒Plant Genomic DNA Kit(離心柱型)進(jìn)行植物基因組總DNA的提取(方法經(jīng)課題組比較后選定)，操作步驟參照說(shuō)明。提取后用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其DNA的完整性，用核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)其濃度及純度，并將總DNA濃度稀釋至50 ng/μL至4℃冰箱備用。

2.1.2 擴(kuò)增程序及成像

選取2份材料(新疆貝母、伊犁貝母)進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，從74條引物中篩選出16條條帶清晰，多態(tài)性豐富且重復(fù)性較好的引物用于全部樣品的PCR擴(kuò)增(表2)。采用課題組已優(yōu)化的ISSR－PCR反應(yīng)體系(50 μL 體系):2.50 mmol/L Mg2+，0.30 mmol/L dNTPs，0.80 μmol/L Primer，0.75 U Taq DNA 聚合酶，1.00 ng/μL 模板 DNA，5 μL 10 × Buffer，33.4 μL ddH2O。擴(kuò)增程序:95℃預(yù)變性7 min;95℃變性30 s;退火(根據(jù)不同引物設(shè)定溫度)45 s;72℃延伸90 s;45個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min;4℃保存。擴(kuò)增所得產(chǎn)物用Gelview染色，DL2000 DNA Marker作相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，用2%的瓊脂糖凝膠于115 V電壓下電泳50 min，在紫外凝膠成像系統(tǒng)下觀察拍照。

2.1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

ISSR電泳結(jié)果采用0/1賦值記帶，有電泳帶(包括強(qiáng)帶和弱帶)記為“1”，無(wú)電泳帶記為“0”。形成0/l矩陣圖輸入計(jì)算機(jī)。用Popgene32軟件分析得到遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性參數(shù)，利用NTSYSPC軟件進(jìn)行聚類分析，用SHAN程序構(gòu)建聚類圖。

2.2 結(jié)果與分析

2.2.1 ISSR擴(kuò)增結(jié)果多態(tài)性分析

新疆貝母屬8種藥用貝母23份樣品的ISSRPCR擴(kuò)增電泳結(jié)果產(chǎn)生了清晰的條帶，部分引物擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1。16條引物共擴(kuò)增出199條條帶，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多集中在250～1600 bp，其中195條具有多態(tài)性，多態(tài)性比率(PPB)為97.99%，不同引物擴(kuò)增出的條帶數(shù)在6～20條，多態(tài)性條帶在5～20條，每個(gè)引物的多態(tài)性百分率為83.33% ～100%，引物序列、擴(kuò)增結(jié)果及多態(tài)性見(jiàn)表2。其中，引物4與引物SSR1的擴(kuò)增圖譜可獨(dú)立將8種藥用貝母區(qū)分開(kāi)，16條引物擴(kuò)增結(jié)果中，13條引物里均出現(xiàn)藥用貝母的特異性條帶，即與其余藥用貝母相比較，托里貝母在引物UBC825中多出一條800 bp的條帶，在引物UBC822中缺少一條750 bp的條帶;灘貝母在引物UBC822中多出一條350 bp的條帶，引物UBC900中多出一條250 bp的條帶;大白花貝母在引物4中缺少一條500 bp的條帶，在此相同引物的450 bp處新疆貝母缺此條帶;額敏貝母在引物UBC849中多出一條200 bp的條帶，同時(shí)在引物UBC868中缺少一條600 bp條帶;裕民貝母同時(shí)在引物UBC900的875 bp處和引物UBC899的500 bp處缺少條帶，而在引物UBC855的200 bp處多出一條條帶。

圖1 部分引物對(duì)23份樣品的擴(kuò)增結(jié)果

表2 新疆貝母屬8種藥用貝母ISSR擴(kuò)增結(jié)果和多態(tài)性分析

依據(jù)擴(kuò)增條帶最豐富的引物4和引物SSR1的擴(kuò)增結(jié)果，分別作新疆貝母屬8種藥用貝母的ISSR標(biāo)記檢索表。(表3、表4)

表3 新疆貝母屬藥用貝母ISSR標(biāo)記檢索表

4.有550 bp條帶·········灘貝母F.karelinii 4.無(wú)550 bp條帶5.有850 bp條帶·········額敏貝母F.meleagroides 5.無(wú)850 bp條帶·········托里貝母F.tortifolia 2.無(wú)500 bp條帶3.有600 bp條帶·········伊犁貝母F.pallidiflora 3.無(wú)600 bp條帶4.有800 bp條帶··········新疆貝母F.walujewii 4.無(wú)800 bp條帶··········大白花貝母F.verticillata var.albidoflora

表4 新疆貝母屬藥用貝母ISSR標(biāo)記檢索表

2.無(wú)1000 bp條帶··········灘貝母F.karelinii

2.2.2 新疆貝母屬8種藥用貝母遺傳多樣性分析

采用Popgene32軟件對(duì)新疆貝母屬8種藥用貝母共23份樣品進(jìn)行分析(見(jiàn)表5)，結(jié)果顯示8種藥用貝母各品種間的多態(tài)性位點(diǎn)百分率(PPB)介于1.01% ～45.23%，其中托里貝母的多態(tài)性位點(diǎn)百分率(45.23%)最高，裕民貝母的多態(tài)性位點(diǎn)百分率(1.01%)最低。23份貝母的等位基因數(shù)(Na)為1.9799 ±0.1407，有效等位基因數(shù)(Ne)為1.5230 ±0.3369，Nei’s多樣性指數(shù)(H)為 0.3084 ±0.1615，Shannon’s信息指數(shù)(I)為 0.4669 ±0.2064，表明大部分藥用貝母在DNA分子水平上有較高的遺傳多樣性。

表5 新疆貝母屬8種藥用貝母的遺傳多樣性

2.2.3 新疆貝母屬8種藥用貝母的遺傳分化

計(jì)算8種藥用貝母的遺傳分化水平，結(jié)果顯示其總的基因多樣度(Ht)為0.3146±0.0265，遺傳多樣度(Hs)為0.0904±0.0043，居群間的遺傳分化指數(shù)(Gst)為0.6985，即總的遺傳變異中有69.85%存在于其品種間，30.15%存在于其品種內(nèi)，說(shuō)明新疆貝母屬8種藥用貝母的遺傳多樣性變異大部分存在于不同的品種間?；蛄?Nm*)為0.2159，表明不同品種間的基因交流程度有限。

2.2.4 8種藥用貝母聚類分析及親緣關(guān)系

新疆貝母屬8種藥用貝母通過(guò)UPGMA法進(jìn)行聚類分析(見(jiàn)圖2)，顯示品種間遺傳相似系數(shù)介于0.58～0.99，每份材料均可被明顯區(qū)分開(kāi)來(lái)。在GS為0.64處可將23份材料聚為四類，第一類有兩個(gè)品種，包括新疆貝母、伊犁貝母;第二類有三個(gè)品種，包括黃花貝母、托里貝母、大白花貝母;第三類有兩個(gè)品種，包括額敏貝母、裕民貝母;第四類有一個(gè)品種，灘貝母。由遺傳相似性可以看出，采集的大部分貝母具有較高的遺傳多樣性，每份樣品的分類也正與其品種的來(lái)源相符。

為進(jìn)一步分析新疆貝母屬8種藥用貝母間的遺傳分化程度，計(jì)算其Nei’s遺傳一致度(I)和遺傳距離(D)見(jiàn)表6。從中可以看出其遺傳一致度(I)介于0.6411 ～0.8536，遺傳距離(D)介于0.1582 ～0.4446。新疆8種藥用貝母中大白花貝母和托里貝母遺傳一致度最高為0.8536，遺傳距離最小為0.1582，說(shuō)明其遺傳差異較小，親緣關(guān)系最近;額敏貝母和黃花貝母遺傳一致度最低為0.6411，遺傳距離最遠(yuǎn)為0.4446，其遺傳差異較大，親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

圖2 新疆貝母屬8種藥用貝母材料基于ISSR分析的UPGMA聚類圖

表6 新疆貝母屬8種貝母遺傳一致度(I對(duì)角線以上)和遺傳距離(D對(duì)角線以下)

3 討論

貝母屬(Fritillaria L.)全世界約有130種，在我國(guó)有61種，50個(gè)變種，5變型，其中具藥用價(jià)值的20余種，主要分布于四川、新疆、浙江等省。在新疆，貝母屬藥用貝母主要分布于新疆塔城地區(qū)、吉木薩爾縣、新源縣、霍城縣、鞏留縣、吉木乃等的山區(qū)及草地，分布范圍廣泛，生態(tài)分布多樣，具有較好的資源基礎(chǔ)。本研究從新疆不同的產(chǎn)地選取藥用貝母各2～4份，樣品覆蓋新疆貝母屬藥用貝母分布量較豐富的分布區(qū)，包含了新疆藥材市場(chǎng)上最常用的8種藥用貝母，對(duì)其遺傳多樣性進(jìn)行研究。遺傳多樣性是每種生物所固有的特性，可以幫助了解物種的群體遺傳結(jié)構(gòu)和多樣性水平，為研究物種起源、品種分類、品種保護(hù)及保證臨床用藥等提供依據(jù)［11］。而ISSR是檢測(cè)物種遺傳多樣性的一種快速、高效的方法，結(jié)合了 SSR 和 RAPD 的優(yōu)點(diǎn)［12－13］，具有操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好、信息量大等優(yōu)點(diǎn)。

從ISSR－PCR擴(kuò)增結(jié)果來(lái)看，新疆貝母屬8種藥用貝母的遺傳多樣性為97.99%，這與王果平的研究結(jié)果相一致［10］，說(shuō)明新疆8種藥用貝母具有較高的遺傳多樣性。同時(shí)，從ISSR－PCR擴(kuò)增結(jié)果還可以看出，8種藥用貝母在不同引物的位點(diǎn)處均能出現(xiàn)各自的特異性條帶，引物4與引物SSR1均可獨(dú)立將其區(qū)分開(kāi)，并且引物4和引物SSR1制作的ISSR標(biāo)記檢索表可用于新疆貝母屬8種藥用貝母品種鑒定的檢索，說(shuō)明其在分子特征水平上可被鑒定區(qū)分開(kāi)來(lái)。

新疆貝母屬8種藥用貝母中多態(tài)性比率最高的(45.23%)低于總體的遺傳多態(tài)性(97.99%)，全部品種的等位基因數(shù)(Na):1.9799，有效等位基因數(shù)(Ne):1.5230，Nei’s 多樣性指數(shù)(H):0.3084，Shannon’s信息指數(shù)(I):0.4669，都高于各品種間的數(shù)值，可看出采集的23份藥用貝母具有較好的代表性。其中托里貝母的多態(tài)性比率(45.23%)高于了新疆貝母(39.70%)和伊犁貝母(35.18%)，灘貝母的多態(tài)性比率(34.17%)與新疆貝母和伊犁貝母的相近，說(shuō)明托里貝母和灘貝母的遺傳純度較高。額敏貝母、裕民貝母的多態(tài)性位點(diǎn)百分率很低，分別為5.03%和1.01%，其采集狀況又均為野生，說(shuō)明自然環(huán)境或人為破壞對(duì)其的生長(zhǎng)產(chǎn)生了影響，種質(zhì)退化比較嚴(yán)重，存在著遺傳風(fēng)險(xiǎn)，必須采取有力的措施來(lái)有效的保護(hù)野生種質(zhì)。從新疆貝母屬8種藥用貝母的遺傳分化水平可揭示，遺傳變異中有69.85%存在于不同品種間，品種間的基因交流有限，存在著遺傳分化。

根據(jù)Nei’s遺傳距離對(duì)新疆貝母屬8種藥用貝母進(jìn)行聚類分析，所得聚類圖顯示其各品種間遺傳相似系數(shù)介于0.58～0.99，可將23份材料聚為四類且正與其品種來(lái)源相符，新疆貝母、伊犁貝母為第一類，即為伊貝母;黃花貝母、托里貝母、大白花貝母為第二類，說(shuō)明黃花貝母、大白花貝母和托里貝母親緣關(guān)系較近，這與羅毅波提出的大白花貝母為黃花貝母的變種相符合［14］，也與王果平和吳曉青的研究結(jié)果相一致［10，15］;額敏貝母、裕民貝母為第三類，這與王果平將新疆貝母、伊犁貝母、裕民貝母聚為一類，額敏貝母為一類的研究不盡相同［10］;灘貝母單獨(dú)分為第四類。通過(guò)Nei’s遺傳一致度(I)和遺傳距離(D)的分析顯示大白花貝母和托里貝母遺傳差異最小，額敏貝母和黃花貝母親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。這與吳曉青提出的裕民貝母與托里貝母關(guān)系較近和Leon提出的裕民貝母與黃花貝母關(guān)系最近的研究結(jié)果有一定差異［14，16］。造成此類差異的原因可能是與受試材料的選擇不盡一致;采集地點(diǎn)和采集時(shí)間的不同;采集的種質(zhì)狀況及采樣數(shù)量不同有關(guān)。

被譽(yù)為止咳潤(rùn)肺“圣藥”的貝母屬植物，隨著中藥市場(chǎng)的不斷發(fā)展和人民日常生活的需要，貝母已成為價(jià)格昂貴供求緊張的中藥材之一。隨著新疆野生伊貝母藥材資源破壞嚴(yán)重，在新疆同時(shí)入藥使用的其他野生和栽培藥用貝母幾十年來(lái)不僅供應(yīng)本區(qū)，還大量支援其他兄弟省區(qū)，以彌補(bǔ)市場(chǎng)的緊缺和供需矛盾。從新疆貝母屬藥用貝母的現(xiàn)狀來(lái)看，大部分的遺傳純度已經(jīng)達(dá)到較高的水平，多態(tài)性與新疆貝母和伊犁貝母無(wú)明顯差異，總體上均具有較豐富的遺傳多樣性，遺傳純度較高，有望增補(bǔ)為伊貝母項(xiàng)下新品種。這一現(xiàn)象也有利于擴(kuò)大新疆貝母資源，為保證臨床安全用藥，合理用藥提供了科學(xué)依據(jù)。

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