翟苗苗，劉慶平，張常春，鐘進(jìn)義

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，山東青島 266021)

明日葉(Angelica keiskei Koidzumi)是一種野生芹科植物，今天摘葉明日就能發(fā)新幼芽，因此取名為明日葉［1］。明日葉的主要效應(yīng)成分為查爾酮(chalcone AC)，研究發(fā)現(xiàn)其具有抗氧化、抗癌等作用且毒性非常低，因此吸引了很多科學(xué)家研究此活性與作用。研究證實(shí)明日葉查爾酮具有清除氧自由基作用，而氧化損傷是輻射對機(jī)體損傷的重要機(jī)制之一，在國內(nèi)外對其抗輻射作用卻鮮有研究，因此本實(shí)驗(yàn)通過測定小鼠肝組織總抗氧化能力(T－AOC)，脂質(zhì)過氧化物(MDA)，超氧化物歧化酶(SOD)含量的變化和細(xì)胞增殖與細(xì)胞凋亡活性的高低，來證實(shí)AC對急性輻射損傷后機(jī)體抗氧化能力的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級健康昆明種小鼠50只，雌雄各半，體重22～25g，由山東魯抗醫(yī)藥實(shí)驗(yàn)中心提供，在本實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要儀器與試劑

主要儀器:美國Varian公司生產(chǎn)的2100 C型6 MV直線加速器X射線源;Q－911全自動(dòng)放免儀，中國科技大學(xué)實(shí)業(yè)總公司;XDS－1B型倒置顯微鏡、DP72型圖像采集設(shè)備，日本OLMPUS公司。

主要試劑:總抗氧化能力(T－AOC)、脂質(zhì)過氧化物(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)等制備的肝組織，采用南京建成生物工程研究所提供的檢測試劑盒進(jìn)行檢測;Bcl－2一抗、二抗和即用型SABC免疫組化試劑盒均購自于武漢博士德生物工程有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組與處理

將50只昆明種小鼠隨機(jī)分為正常對照組、輻射損傷組、明日葉查爾酮(AC)低、中、高劑量組共5組，每組10只，雌雄各半。低、中、高劑量組每日經(jīng)口灌胃給予劑量為4、20、40 mg/(kg·bw)/d明日葉查爾酮，正常對照組與輻射損傷組給予生理鹽水，連續(xù)5 d。在第6天實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行X射線一次性全身照射，照射距離為1.1 m，輻射劑量為4 Gy，正常對照組不照射。各組小鼠均按前述方法分別給予明日葉查爾酮和生理鹽水5天，第6天脫臼處死，取組織待檢。

2.2 檢測指標(biāo)

2.2.1 肝組織 T－AOC，MDA，SOD 活性測定

取肝臟稱重。肝組織切碎，冰浴下勻漿，3500 r/min離心5min，T－AOC檢測采用菲啉比色法，MDA檢測采用硫代巴比妥比色法，SOD檢測采用黃嘌呤氧化酶法，取上清檢測。

2.2.2 肝組織Bcl－2蛋白表達(dá)水平的檢測

免疫組化法測定，取肝臟經(jīng)固定、脫水、透明處理、包埋后制成組織切片，將切片進(jìn)行脫蠟和水化、滅活內(nèi)源性酶、熱修復(fù)和封閉處理后滴加一抗和二抗，DAB顯色，再經(jīng)蘇木素復(fù)染，在高倍鏡視野(×400)下觀和拍照，用Image－Pro Plus圖像分析軟件進(jìn)行光密度分析。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料做單因素方差分析，以 p＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

(1)各組小鼠肝臟組織總抗氧化能力T－AOC、脂質(zhì)過氧化物MDA含量和超氧化物歧化酶SOD活性檢測結(jié)果:與正常對照組相比較，輻射損傷組T－AOC、SOD 出現(xiàn)顯著性降低(p＜0.05)，MDA 含量顯著性增高(p＜0.05)，高劑量組較輻射損傷組TAOC、SOD 出現(xiàn)顯著性升高(p＜0.05)，MDA 含量顯著性降低(p＜0.05)。結(jié)果見表1。

表1 明日葉查爾酮對小鼠X射線照射后T－AOC、MDA和SOD含量的影響()

表1 明日葉查爾酮對小鼠X射線照射后T－AOC、MDA和SOD含量的影響()

注:a與正常對照組相比較p＜0.05;b與高劑量組相比較，p＜0.05。

T－AOC MDA SOD正常對照組別3.901 ±0.304 1.864 ±0.324 71.938 ±1.0513.91 ±1.045 1.467 ±0.364 72.061 ±1.045輻射損傷 1.429 ±0.308ab 3.751 ±0.432ab 34.665 ±1.178ab低劑量組 2.399 ±0.504 3.246 ±0.378 37.886 ±1.26中劑量組 3.793 ±0.279 2.309 ±0.375 62.056 ±1.638高劑量組

(2)各組小鼠肝臟Bcl－2蛋白水平測定結(jié)果:與輻射損傷組比較，高劑量組的Bcl－2陽性表達(dá)的細(xì)胞多、染色深，呈強(qiáng)表達(dá);Bax則陽性表達(dá)的細(xì)胞少、染色淺，呈弱表達(dá)，圖像分析結(jié)果顯示，高劑量組Bcl－2為 76.975 ±1.847，較輻射損傷組顯著性升高(p＜0.05)。見表2。

表2 明日葉查爾酮對小鼠X射線照射后肝組織Bcl－2蛋白的影響()

表2 明日葉查爾酮對小鼠X射線照射后肝組織Bcl－2蛋白的影響()

注:a與正常對照組相比較p＜0.05;b與高劑量AC組相比較p＜0.05。

Bcl－2正常對照組別n 10 76.975 ±1.84710 82.361 ±1.958輻射損傷 10 56.383 ±2.282ab低劑量組 10 60.723 ±1.672b中劑量組 10 67.096 ±1.588高劑量組

4 討論

電離輻射反應(yīng)產(chǎn)生大量自由基，使DNA、生物膜、蛋白質(zhì)等生物大分子結(jié)構(gòu)改變、功能異常甚至喪失，從而產(chǎn)生輻射損傷效應(yīng)［2］。生物體本身存在有一系列如過氧化氫酶、超氧化物歧化酶等清除自由基的抗氧化酶，它們可以清除過多的H2O2、O－2，有效低·OH［3］，從而減輕自由基對機(jī)體的損傷。

機(jī)體總抗氧化能力(T－AOC)取決于機(jī)體內(nèi)的抗氧化劑，其主要是通過抑制或清除自由基，提高內(nèi)源性抗氧化物質(zhì)水平來拮抗大量自由基對機(jī)體生物大分子的損害，在維持體內(nèi)氧化和抗氧化系統(tǒng)平衡中發(fā)揮重要的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與正常對照組相比，輻射損傷組總抗氧化能力顯著性降低，三個(gè)劑量組較輻射損傷組均較輻射損傷組升高，并且存在劑量反應(yīng)關(guān)系，高劑量組與輻射損傷組有顯著性差異，可以說明AC可以提高機(jī)體輻射損傷后的抗氧化能力。

MDA是反映機(jī)體脂質(zhì)過氧化程度的指標(biāo)［4］，其含量的變化可間接反映組織中自由基含量的變化。SOD反應(yīng)機(jī)體自由基水平和氧化應(yīng)激水平，其活力的高低可間接反映機(jī)體清除自由基的能力［5］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與正常對照組相比，輻射損傷組MDA含量顯著增加，SOD活性均明顯降低 提示輻射增強(qiáng)脂質(zhì)過氧化作用，破壞了抗氧化酶系統(tǒng)，與輻射損傷組相比，高劑量組與輻射損傷組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示明日葉查爾酮對X射線引起的肝組織氧化損傷有一定的防護(hù)作用。

Bcl－2基因是人體最主要的抗凋亡基因。現(xiàn)有研究已證明bcl－2基因可抑制各種刺激下多種細(xì)胞的凋亡。大量有關(guān)AC抗腫瘤的研究已表明，有些天然或人工合成的含羥基、甲氧基、氮基、硼酸基和鹵基等的查爾酮具有細(xì)胞毒性作用，能抑制惡性腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡，下調(diào)Bcl－2蛋白的表達(dá)［6］。而對正常細(xì)胞卻無毒和致突變作用，能拮抗細(xì)胞損傷，保護(hù)細(xì)胞正常的分化增殖，上調(diào)Bcl－2蛋白的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與輻射損傷組相較，隨AC含量的增高，Bcl－2蛋白含量增加，高劑量AC組與輻射損傷差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示AC使肝細(xì)胞凋亡水平降低，進(jìn)而提高肝細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)能力和輻射耐受性。

總之，通過本實(shí)驗(yàn)的研究綜合得出，明日葉查爾酮對小鼠急性輻射損傷有一定的防護(hù)措施，具有增強(qiáng)小鼠抗氧化能力，提高細(xì)胞增殖與降低細(xì)胞的凋亡率的作用，具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究探索。

［1］廖頭根，汪秋安，方偉玲，等.新型查爾酮類化合物的合成及其生物活性研究［J］.有機(jī)化學(xué);2006，26(5)，685－689.

［2］侯軍峰，焦凱，張盈華.中藥復(fù)方對X線照射小鼠T淋巴細(xì)胞亞群和抗氧化能力的作用［J］.中國免疫學(xué)雜志;2003，19(1):54－56.

［3］夏壽萱.放射生物學(xué)［M］.北京:軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社，1998:37－42.

［4］陳海剛，馬勝偉，林欽，等.氯化三丁基錫對黑鯛鰓和肝組織SOD、MDA 和 GPx的影響［J］.南方水產(chǎn)，2009，5(2):23－27.

［5］馬征，黃凰，張瑩瑩，等.白藜蘆醇對輻射損傷的保護(hù)作用［J］.中南大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，38(6):597－601.

［6］陳建忠.查爾酮類化合物的抗腫瘤活性及其構(gòu)效關(guān)系研究進(jìn)展［J］.中國藥房，2014，25(5):467－470.