王 璐 路書彥 仝瑩瑩

（河南省產(chǎn)品質量監(jiān)督檢驗院，河南 鄭州 450004）

紅曲霉可利用多種碳源和氮源，合成多種色素、洛伐他汀等生理活性物質。適當強度的超聲波作用于液體培養(yǎng)過程，可提高微生物發(fā)酵的速度，縮短反應時間，提高代謝產(chǎn)物的質量和產(chǎn)量。本文針對超聲波對紅曲霉液體發(fā)酵代謝產(chǎn)物的影響進行研究。

1 實驗材料

1.1 菌株

紅曲霉（紫色紅曲，Monascus purpurcus）由長江大學生命科學學院微生物實驗室提供。

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：麥芽糖5%、豆芽汁20%、瓊脂2%～3%，0.1MPa滅菌25min；

種子培養(yǎng)基：可溶性淀粉6%、黃豆粉0.5%、KNO30.25%、ZnSO40.05%、MgSO40.05%，0.1Mpa滅菌25min；

液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖10%、酵母膏0.3%、KNO30.2%、KH2PO40.1%、MgSO4·7H2O 0.05%、KCl 0.05%、FeSO40.001%，0.1Mpa滅菌25min；

2 實驗方法

2.1 菌株的培養(yǎng)

2.1.1 菌液的制備

菌懸液的制備：將斜面培養(yǎng)基上的菌株用40mL無菌水沖洗下來，轉入裝有玻璃珠的150mL培養(yǎng)瓶中，震蕩后用6層無菌紗布過濾，濾液即為菌懸液。

種子液的制備：在250mL錐形瓶中加入72mL種子培養(yǎng)基，滅菌后接入3mL菌懸液，29℃振蕩培養(yǎng)36h。

2.1.2 發(fā)酵培養(yǎng)

將制備好的菌懸液按6%的接種量接入已滅菌的液體培養(yǎng)基，29℃搖床180rmp培養(yǎng)10d。

2.1.3 代謝產(chǎn)物分離

發(fā)酵液用濾紙過濾，收集濾出物烘干至恒重，即得紅曲霉菌絲干重；

濾液中取出1.5mL，12000rmp 離心10min，去上清進行色素的測定。

2.2 紅曲霉液態(tài)發(fā)酵實驗

所用培養(yǎng)設備為立式雙門回旋搖床，設置溫度為30℃，轉速為141r/min。

將菌懸液接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在相應時間進行相應超聲波處理。并留出24 瓶培養(yǎng)瓶作為對照。從培養(yǎng)第3天開始每天取出處理組和對照組各3瓶，進行代謝產(chǎn)物的提取和測定。

本文基于2008年1月—2016年12月觀測數(shù)據(jù)，選取部分遠震事件(震中處于30°～90°之間，震級M>6.0，清晰P波初至與高信噪比)作為研究對象(圖1)，研究區(qū)內共有33個臺站，可以將重慶及周邊地區(qū)完全包含在內(圖2)，研究所用數(shù)據(jù)皆來自于國家測震臺網(wǎng)數(shù)據(jù)備份中心[10]。

2.2.1 紅曲霉色素含量的測定

發(fā)酵液經(jīng)濾紙過濾后，取出1.5mL，12000rmp 離心10min，取上清在380～550nm 處進行紫外掃描。確定其紫外吸峰的波長。

2.2.2 超聲波處理對紅曲霉代謝影響的單因素實驗

所用設備為超聲波清洗儀，由處理次數(shù)，處理時間，處理強度，作用方式和作用功率的不同，設置單因素實驗。

由于處理次數(shù)過多，處理間隔短，單次處理時間過長，處理功率過大都會導致菌絲球破裂菌體死亡，經(jīng)過預實驗的摸索，確定單因素設置如表1。

表1 單因素及其水平的選擇

每個單因素單水平實驗操作均為將菌懸液接入液體培養(yǎng)基中，放入29℃搖床中培養(yǎng)，共32 瓶。其中24 瓶為實驗組（8瓶1組，3組重復），8瓶為空白組。根據(jù)單因素實驗水平的設置確定實驗組處理方式進行處理，從培養(yǎng)72h開始，每24h取出每組1瓶進行代謝產(chǎn)物的測定，培養(yǎng)十天實驗結束。

（1）確定使用功率為320W，處理時間為2min，開始作用時間為培養(yǎng)48h，間隔作用時間為24h。設置3個實驗組，分別為處理1次、2次和3次；并設置1個空白組。

（2）確定使用功率為320W，處理時間為1min，間隔作用時間為24h，共處理3次。設置3個實驗組，開始處理時間分別為培養(yǎng)后48h、72h和96h；并設置1個空白組。

（3）確定使用功率為320W，開始作用時間為培養(yǎng)72h，間隔作用時間為24h，共處理3次。設置3個實驗組，分別為處理1min、2min和3min；并設置1個空白組。

（4）確定使用功率為320W，處理時間為1min，開始作用時間為培養(yǎng)72h，共處理3次。設置3個實驗組，處理間隔時間分別為12h、24h和36h；并設置1個空白組。

2.3 結果與分析

2.3.1 超聲波處理次數(shù)對紅曲霉紅曲色素代謝產(chǎn)物代謝的影響

培養(yǎng)72h 后，每24h 取出每組3 瓶，進行代謝產(chǎn)物的測定，取得平均值進行紅曲色素代謝曲線的繪制，結果如圖1 所示。結果表明，超聲波處理能使紅曲色素的產(chǎn)量明顯增加，處理次數(shù)越多增強的效果越明顯。

2.3.2 超聲波處理方式對紅曲霉紅曲色素代謝產(chǎn)物代謝的影響

培養(yǎng)72h后，每24h取出每組3瓶，進行代謝產(chǎn)物的測定，取得平均值進行紅曲色素代謝曲線的繪制。結果如圖2所示。結果表明，超聲波作用將改變紅曲霉紅色素和黃色素代謝曲線，在培養(yǎng)72h后開始進行超聲波處理可得到最多的紅曲霉色素。

2.3.3 超聲波處理時間對紅曲霉紅曲色素代謝產(chǎn)物代謝的影響

培養(yǎng)72h 后，每24h 取出每組3 瓶，進行代謝產(chǎn)物的測定，取得平均值進行代謝曲線的繪制。結果如圖3 所示。結果表明，超聲波作用的時間和紅曲霉紅色素和黃色素的代謝量并不呈線性關系，得出超聲波對紅曲霉處理1min為超聲波處理時間的最優(yōu)條件。

2.3.4 超聲波處理間隔時間對紅曲霉紅曲色素代謝產(chǎn)物代謝的影響

培養(yǎng)72h 后，每24h 取出每組3 瓶，進行代謝產(chǎn)物的測定，取得平均值進行代謝曲線的繪制。結果如圖4 所示。結果表明，超聲波處理的間隔時間長短和紅曲霉紅色素和黃色素的代謝量無明顯關系，根據(jù)色素代謝的全過程，得出超聲波對紅曲霉以間隔時間為24h 處理時能得到最大的色素量。

圖1 超聲波處理次數(shù)與紅曲色素中色素產(chǎn)量的關系

圖2 超聲波處理方式與紅曲色素中色素產(chǎn)量的關系

圖3 超聲波處理方式與紅曲色素中色素產(chǎn)量的關系

圖4 超聲波處理方式與紅曲色素中色素產(chǎn)量的關系

2.4 結論

微生物的發(fā)酵受到許多因素的影響，如溫度、溶氧量、培養(yǎng)基、菌種、pH值等，其中任何一個因素發(fā)生變化，都有可能引起細胞產(chǎn)量和蛋白質產(chǎn)物穩(wěn)定性發(fā)生巨大的變化。研究發(fā)現(xiàn)，在紅曲霉培養(yǎng)72h后進行超聲波處理，間隔每24h 處理1 次共處理3 次，處理時間為1min，使用功率為320W 的超聲波處理為紅曲霉代謝產(chǎn)品最優(yōu)處理條件。

［1］劉雷萍.紅曲中生物活性物質研究進展［J］.食品工業(yè)科技，2003（9）：90-93.

［2］ 楊勝利，王金宇，鄒彥平，等.超聲波照射對紅曲Monacolin K 產(chǎn)量的影響［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2002，29（2）：66-68.

［3］郭紅珍，王秋芬，馬立芝.不同培養(yǎng)條件對紅曲霉產(chǎn)紅曲色素的研究［J］.食品科學，2008，29（1）：215-218.

［4］ 楊勝利，王金宇，鄒彥平，等.超聲波照射對紅曲Monacolin K 產(chǎn)量的影響［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2002，29（2）：66-68.