李巧玲，魏冠棉，2，李劭彤，劉峰

（1.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北石家莊050018；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫214122）

HPLC測(cè)定果汁飲料中兩種鄰苯二甲酸酯

李巧玲1，魏冠棉1，2，李劭彤1，劉峰1

（1.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北石家莊050018；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫214122）

建立了高效液相色譜（HPLC）對(duì)果汁飲料中鄰苯二甲酸二乙酯（DEP）和鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）進(jìn)行定性和定量分析的方法。果汁飲料樣品經(jīng)正己烷溶解、超聲波輔助提取、高速離心、過SPE小柱等預(yù)處理后，用HPLC進(jìn)行定性和定量分析。結(jié)果表明：DEP和DBP在1.0 mg/L～40 mg/L濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.999，3個(gè)水平的樣品添加回收率為88.3%～99.9%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.94%～1.95%之間，2種目標(biāo)化合物的檢出限分別為0.1 mg/L和0.05 mg/L。

高效液相色譜；鄰苯二甲酸二乙酯；鄰苯二甲酸二丁酯；果汁飲料

近兩年，隨著塑化劑在一些飲料、酒中的不斷檢出，塑化劑對(duì)食品的污染引起了人們強(qiáng)烈關(guān)注。塑化劑是一種能夠提高材料柔軟性的添加劑，它通過削弱聚合物分子之間的范德華力，增加了聚合物分子鏈的移動(dòng)性，降低了聚合物分子鏈的結(jié)晶性，從而增加了聚合物的塑性[1]。塑化劑對(duì)食物的污染主要來自2個(gè)方面：一方面是由于食品包裝材料（例如聚氯乙烯）中添加了塑化劑，在同食物進(jìn)行接觸的過程中，包裝材料中的塑化劑遷移進(jìn)入食物中[2]；另一方面是非法添加入食品中，例如，代替起云劑。

塑化劑種類繁多，使用最普遍的是鄰苯二甲酸酯類（phthalie acid esters，PAEs）化合物。鄰苯二甲酸酯類化合物是可用于食品包裝材料的增塑劑。《食品容器、包裝材料用添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》（GB9685-2008）中嚴(yán)格規(guī)定了該類塑化劑在食品及食品添加劑中的最大殘留量，其中鄰苯二甲酸二（2-乙基己）酯（DEHP）、鄰苯二甲酸異壬酯（DINP）和鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）最大殘留量分別為1.5、9.0 mg/kg和0.3 mg/kg[3]。鄰苯二甲酸酯類塑化劑都具有類雌激素作用[4]。研究表明，鄰苯二甲酸酯類進(jìn)入人體后與相應(yīng)激素受體結(jié)合，影響生物體內(nèi)激素的正常分泌，使得人體生殖功能產(chǎn)生障礙、發(fā)育遲緩，甚至引發(fā)惡性腫瘤，產(chǎn)生致畸、致癌和致突變性以及免疫抑制性[5-10]。

《食品中鄰苯二甲酸酯的測(cè)定》（GB/T 21911-2008）中規(guī)定了氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法為食品中鄰苯二甲酸酯類化合物的檢測(cè)方法。盡管用高效液相色譜法測(cè)定塑化劑成分已有研究[11-17]，但是對(duì)于飲料中塑化劑含量的測(cè)定報(bào)導(dǎo)較少。本文擬采用超聲波輔助正己烷提取、SPE小柱凈化、富集，高效液相色譜檢測(cè)的方法測(cè)定果汁飲料中DEP和DBP的含量，以期了解飲料中受PAEs污染的程度，找到一種檢測(cè)成本低，適用于各基層單位的PAEs塑化劑的檢測(cè)方法，從而完善飲料中塑化劑的檢測(cè)手段。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

塑料瓶裝安梨汁飲料600 mL，購(gòu)買于超市。

實(shí)驗(yàn)用水為超純水；甲醇（色譜純），正己烷、丙酮、無水硫酸鈉：均為分析純，天津康科德科技有限公司；鄰苯二甲酸二乙酯和鄰苯二甲酸二丁酯標(biāo)品：河北省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院提供；0.45 μm有機(jī)相微孔濾膜：天津市沃爾孚科技發(fā)展有限公司；高純氮?dú)猓杭兌却笥?9.999%。

無水硫酸鈉需在450℃下灼燒4 h～6 h除去含有的結(jié)晶水；正己烷需要重蒸處理。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20A型高效液相色譜儀（配有SPD-20A紫外檢測(cè)器、7725i手動(dòng)進(jìn)樣器、C70-1AS柱溫箱、LC-solution色譜工作站）：日本Shimadzu公司；KUDOSSK5200LHC超聲處理器：上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司；XW-80A渦旋混合器：蘇州江東精密儀器有限公司；超純水制備裝置：上?？道追治鰞x器有限公司；高速離心機(jī)（LG16-A）：北京雷勃爾有限公司；Welch C18SPE固相萃取小柱（20 mg/6 mL，5PK）：Welch Material，Inc.公司；氮?dú)獯蹈蓛x：上海濟(jì)成分析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液的配制

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取DEP和DBP各1.000 0 g，放入同一100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配成濃度為10 g/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。用移液管移取5 mL的10 g/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液于100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，混勻，配成濃度為0.5 g/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，于4℃冰箱中冷藏備用。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用移液管分別移取0.1、0.5、1.0、2.0、4.0 mL的0.5 g/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液放于不同的50 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，混勻，配成濃度為1、5、10、20、40 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

將配好的5種濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各取20 μL按下述色譜條件進(jìn)樣分析。以標(biāo)準(zhǔn)樣品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，得到DEP和DBP的標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)系數(shù)。

1.3.3 樣品的前處理

取5.0 g樣品于干燥的玻璃離心管（避免用塑料的實(shí)驗(yàn)儀器）中，加入正己烷5.0 mL，旋渦振蕩混合2 min，超聲處理10 min后，以7 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，取上清液移取至玻璃試管中。離心管中的殘存物再經(jīng)上述過程提取1次，然后合并上清液，用氮?dú)鈱⑵浯抵? mL，等待凈化。

向Welch C18 SPE柱中依次加入5 mL丙酮、5 mL正己烷淋洗SPE柱后，再向柱子中加入1.0 g無水硫酸鈉，用洗耳球輕輕敲SPE柱，使無水硫酸鈉鋪平，加入待凈化液，流速控制在1 mL/min，依次加入5 mL丙酮、5 mL丙酮-正己烷（1∶25，體積比）洗脫液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，然后用氮?dú)獯蹈桑儆?.5 mL正己烷溶解，過0.45 μm有機(jī)濾膜過濾后，供HPLC分析。

1.3.4 色譜條件

色譜柱為Eclipse XDB-C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫25℃；流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)227 nm；進(jìn)樣量20 μL；流動(dòng)相為甲醇-水體系（85∶15，體積比）。

1.3.5 樣品的測(cè)定

將前處理好的樣品在1.3.4的色譜條件下平行測(cè)定5次，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖，對(duì)試樣中的DEP和DBP的含量進(jìn)行定性和定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取劑選擇

實(shí)驗(yàn)分別考察了用甲醇、石油醚、正己烷等溶劑作為提取劑，提取樣品中的塑化劑成分。從HPLC檢測(cè)的結(jié)果來看，甲醇作為提取劑時(shí)，飲料樣品中沒有檢測(cè)出DEP和DBP，見圖1。

而對(duì)于相同樣品用正己烷或石油醚作為提取劑后，高效液相色譜的測(cè)定結(jié)果表明，飲料中不但存在DEP和DBP，而且正己烷提取的樣品在高效液相色譜圖上雜質(zhì)峰少，效果較為理想，見圖2。因此，選用正己烷作為提取劑。

圖1 甲醇做提取劑的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of methanol extract

圖2 正己烷做提取劑的高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of n-hexane extract

2.2 色譜條件的優(yōu)化

由于PAEs是一類極性較弱的化合物，其結(jié)構(gòu)中含有苯環(huán)，所以在選擇色譜柱時(shí)應(yīng)當(dāng)選擇非極性或弱極性的固定相，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的條件，故以Eclipse XDB-C18為本研究分析所用色譜柱。

鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)在227、245 nm和280 nm處有均有特征吸收峰，由于DEP和DBP在227 nm處的吸收強(qiáng)度優(yōu)于245 nm和280 nm處，因此選擇227 nm作為本研究的檢測(cè)波長(zhǎng)，這樣得到的檢出限較低。

以甲醇—水體系作為流動(dòng)相，流動(dòng)相的配比能顯著地影響分離效果。當(dāng)甲醇—水流動(dòng)相體積比為90∶10時(shí)，盡管可以在4分鐘內(nèi)完成DEP和DBP的分離，但DEP有拖尾現(xiàn)象。之后對(duì)V甲醇∶V水分別為75∶15、80∶20、85∶15的流動(dòng)相亦進(jìn)行了詳細(xì)的探討，發(fā)現(xiàn)V甲醇∶V水=85∶15時(shí)，DEP和DBP兩個(gè)峰的分離效果最好，如圖3所示，故選擇流動(dòng)相甲醇—水體系配比為85∶15。

圖340 mg/mL DBP和DEP混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的高效液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of 40 mg/mL DBP and DEP standard solution

2.3 混合標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

按1.3.4的色譜條件，分別取20 μL的1、5、10、 20、40 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定。分別以DEP和DBP的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得到的回歸方程及相關(guān)系數(shù)見表1。

表1 DBP和DEP的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限Table 1Regression equations，correlation coefficients and detection limits of DEP and DBP

DEP和DBP在1 mg/L～40 mg/L范圍內(nèi)峰面積與濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2均大于0.999。根據(jù)3倍噪音的峰面積響應(yīng)值和方法回收率，得到DEP和DBP的最低檢出限[19]。測(cè)定表明，DEP的檢出限為0.1 mg/L，DBP的檢出限為0.05 mg/L，此數(shù)值低于國(guó)標(biāo)《食品中鄰苯二甲酸酯的測(cè)定》中各鄰苯二甲酸酯化合物的檢出限（1.5 mg/kg），可以滿足對(duì)飲料中DBP和DEP的檢測(cè)分析。

2.4 方法回收率及精密度的測(cè)定

本試驗(yàn)分別取5.0 g的飲料樣品3份，DEP和DBP的添加水平分別是5、10、20 mg/L，按照前述樣品前處理方法及檢測(cè)條件分別測(cè)定，同時(shí)做空白樣品2份，每份樣品檢測(cè)6次，確定加標(biāo)回收率。測(cè)得的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差如表2所示。

表2 樣品的加標(biāo)回收率（n=6）Table 2Recovery of sample（n=6）

結(jié)果表明，飲料樣品在3個(gè)添加水平下，DEP和DBP的回收率在88.3%～99.9%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.94%～1.95%之間，說明該方法準(zhǔn)確度和精密度良好，能夠滿足樣品測(cè)試的要求。

2.5 飲料中DEP和DBP的含量測(cè)定

飲料中DEP和DBP的含量測(cè)定的高效液相色譜圖見圖4。

圖4 飲料樣品的高效液相色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of beverage sample

由圖4可知，DEP的保留時(shí)間在2.6 min左右，DBP的保留時(shí)間在5.7 min左右。圖4同圖3相對(duì)照可知，飲料樣品中含有DEP和DBP。根據(jù)表1的相關(guān)方程，通過外標(biāo)法計(jì)算得出飲料樣品中DEP和DBP的含量分別為2.713 mg/kg和4.628 mg/kg。這表明飲料在生產(chǎn)加工或儲(chǔ)運(yùn)過程中可能被PAEs類增塑劑污染。

2011年6月國(guó)家衛(wèi)生部辦公廳發(fā)布了《衛(wèi)生部辦公廳關(guān)于通報(bào)食品及食品添加劑中鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)最大殘留量的函》（衛(wèi)辦監(jiān)督函[2011]551號(hào)），規(guī)定食品、食品添加劑中DBP最大殘留量為0.3 mg/kg，DEP的限量在我國(guó)并沒有明確規(guī)定。由此可以看出本實(shí)驗(yàn)所用樣品中DBP的含量已經(jīng)超出了國(guó)家規(guī)定限量值。分析原因可能為：一方面是飲料在生產(chǎn)加工過程中被PAEs類增塑劑污染；另一方面是包裝容器中的PAE s向飲料中的遷移引起的。

3 結(jié)論

該研究表明，飲料樣品經(jīng)超聲波輔助正己烷提取、SPE小柱凈化、富集等預(yù)處理后，可以用高效液相色譜法測(cè)定樣品中的鄰苯二甲酸酯類塑化劑。該方法的回收率高、重現(xiàn)性好、檢出限較低，操作簡(jiǎn)單，可推廣應(yīng)用于一般單位檢測(cè)飲料中鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)。

從對(duì)飲料樣品的檢測(cè)結(jié)果來看，飲料中塑化劑的含量超過了國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求的限量。造成塑化劑超標(biāo)的原因有待于進(jìn)一步探索。由于塑化劑從包裝材料遷移進(jìn)入食品中與食品的儲(chǔ)存時(shí)間、儲(chǔ)存溫度、包裝材料的成分等因素關(guān)系密切，建議可從上述幾個(gè)方面對(duì)包裝材料中塑化劑的遷移情況進(jìn)行深入探討，為制定塑料包裝飲料的儲(chǔ)存條件提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

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Determination of Two Phthalic Acid Esters in Fruit Beverage by High Performance Liquid Chromatography

LI Qiao-ling1，WEI Guan-mian1，2，LI Shao-tong1，LIU Feng1
（1.College of Bioscience and Bioengineering，Hebei University of Science and Technology，Shijiazhuang 050018，Hebei，China；2.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，Jiangsu，China）

A method based on high performance liquid chromatography（HPLC）was developed for the determination of diethyl phthalate（DEP）and dibutyl phthalate（DBP）in fruit beverage.The sample was dissolved by n-hexane，extracted by ultrasonic wave，centrifuged by the high-speed centrifuge，next was purified with Welch C18 SPE column，then identified and quantified by HPLC.The results showed that linearity of response over 2 phthalic acid esters was good from 1.0 to 40.0 mg/L with correlation coefficients higher than 0.999.The average recoveries ranged from 88.3%to 99.9%for two compounds at three different spiked levels. The relative standard deviations were in the range of 0.94%-1.95%.The detection limits of DEP and DBP were 0.1 mg/L and 0.05 mg/L，respectively.

high performance liquid chromatography；diethyl phthalate；dibutyl phthalate；fruit beverage

2013-12-23

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.02.027

國(guó)家科技支撐計(jì)劃（2012BAD29B04-1-1）；河北省科技支撐項(xiàng)目（12220402D）

李巧玲（1973—），女（漢），教授，博士后，研究方向：食品安全與檢測(cè)。