梁雅麗 趙邑 郝冬亮

(1.山西省生物研究所基因工程藥物實(shí)驗(yàn)室 山西太原 030006;2.中國(guó)環(huán)境干部管理學(xué)院 河北秦皇島 066102)

自20世紀(jì)70年代分子生物技術(shù)誕生以來(lái),重組蛋白分離純化技術(shù)得到了一定發(fā)展,發(fā)展重心在優(yōu)化蛋白質(zhì)純化步驟、純度、節(jié)省成本等方面。研究重組蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)能在一定程度上促進(jìn)重組蛋白分離純化技術(shù)的發(fā)展,極具現(xiàn)實(shí)意義。

1 準(zhǔn)備和預(yù)處理樣品

樣品準(zhǔn)備受重組蛋白可溶性的影響。從包涵體力回收蛋白質(zhì)首先要做的就是細(xì)胞裂解,一般使用超聲/高壓勻漿或是研磨,通過(guò)增加能量、流量以及時(shí)間來(lái)減少細(xì)胞碎片。另外,預(yù)處理也是減少細(xì)胞碎片必不可少的環(huán)節(jié),如在高壓勻漿前要做好加熱和酶預(yù)處理工作,促使桿菌釋放熱穩(wěn)定酶;通過(guò)預(yù)處理酵母和假絲酵母酶提升細(xì)胞破碎效果;低壓均將縮短時(shí)間、降低能耗以及減少細(xì)胞碎片;通過(guò)洗滌包涵體和整合細(xì)胞破碎達(dá)到優(yōu)化下游程序目的。

2 層析技術(shù)

2.1 層析方法

很多蛋白質(zhì)純化方案都是基于多步驟層析方式次序排列之上的,但有些時(shí)候一些步驟是可以省略的。蛋白質(zhì)與多肽作為結(jié)構(gòu)可變及功能繁多的分子,層析行為也具有復(fù)雜性,所以要慎重選擇基質(zhì)。復(fù)雜蛋白質(zhì)的純化僅使用單一層析方法不能滿足需求,在不具備標(biāo)準(zhǔn)條件的情況下,只有多選擇多試用。Wu等借助SP瓊脂糖FF對(duì)分泌重組內(nèi)源血管產(chǎn)生的抑制因子實(shí)施了離子交換層析,借助瓊脂糖-肝素Hi-Trap對(duì)其實(shí)施了親和層析純化,分離出純度為98%的蛋白質(zhì)。Wang等借助CHO-GS系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)嵌合抗體的表達(dá),再用親和層析方式得到純度為91%的蛋白質(zhì),然后再用反相高性能液體色譜法實(shí)施進(jìn)一步純化,得到純度在99%以上的蛋白質(zhì)。

在液相層析技術(shù)里,當(dāng)前研究重點(diǎn)是如何改進(jìn)純化操作系統(tǒng)性能以強(qiáng)化載體介質(zhì)性能。此外,灌注層析、置換層析、擴(kuò)張柱床吸附等技術(shù)都在不斷發(fā)展。

就下游純化過(guò)程而言,可以使用陶瓷羥磷灰石代替離子交換與疏水相互作用。Stok等在芽孢桿菌里表達(dá)BI,具體純化步驟為先進(jìn)行離子交換,然后進(jìn)行凝膠過(guò)濾,最后進(jìn)行羥磷灰石層析。Wada等基于桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)之上通過(guò)微粒體形式對(duì)重組環(huán)前列腺素合酶進(jìn)行表達(dá),經(jīng)由磷酸鈣凝膠吸收,以及DEAD-瓊脂糖和羥磷灰石柱層析純化,最后獲得重組環(huán)前列腺合酶。此外,戴文氏桿菌致死因子融合蛋白質(zhì)純化,運(yùn)用苯基瓊脂糖→Q-瓊脂糖→羥磷灰石三種層析步驟,得到純度高于95%的蛋白質(zhì)[1]。

2.2 親和層析

傳統(tǒng)親和層析就是用單(多)克隆抗體為親和配基,但在親和配基前必須要對(duì)單克隆抗體進(jìn)行純化處理。Wagner等借助哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng),把馬的IgG1重鏈恒定區(qū)作為馬細(xì)胞因子表達(dá)的檢測(cè)和純化標(biāo)簽。

在親和標(biāo)簽里,親和配基特異性比較低。如鋅、銅等金屬離子在蛋白質(zhì)里與組氨酸殘基兩者結(jié)合,組氨酸殘基數(shù)不同的蛋白質(zhì)就會(huì)被金屬離子親和過(guò)程分離。要增加親和配基特異性,可在蛋白質(zhì)C端增加組氨酸數(shù)量。純化蛋白質(zhì)之后,就可切除組氨酸尾巴。Fang等重組了6xHis-VacⅢ基因并在E.實(shí)現(xiàn)表達(dá),表達(dá)的His融合蛋白質(zhì)存在形式基本上都是包涵體。Chatterjee等分析了構(gòu)建在蛋白質(zhì)C(N)端結(jié)合6組氨酸或Sterptag標(biāo)記的表達(dá)載體,并表達(dá)L-2羥基酮脫氫酶,借助輔助因子或重組煙草蝕刻病毒蛋白質(zhì)達(dá)到消除標(biāo)記的目的[2]。純化時(shí)用固定金屬或Sterptactin進(jìn)行親和層析,通過(guò)rTEV達(dá)到消除組氨酸標(biāo)記的目的,促使L-2羥基酮脫氫酶獲得完全活性。

基于共價(jià)鍵之上,染色配基與親和基質(zhì)能實(shí)現(xiàn)緊密連接,它們可能具有毒性,但和蛋白質(zhì)的相互作用屬于非特異性,容易把一種染色配基與特定目的蛋白質(zhì)聯(lián)系起來(lái),但得到的稅收產(chǎn)物純度不高。相較于抗體,肽鏈屬于穩(wěn)定性更高的配基,而且還具備特異性;相較于燃料,肽鏈沒(méi)有毒性。肽鏈與蛋白質(zhì)相互作用具備溫和性,產(chǎn)生的洗脫分離條件也具備溫和性,肽鏈數(shù)據(jù)能經(jīng)由噬菌體生成或化學(xué)合成,在噬菌體肽鏈數(shù)據(jù)庫(kù)里,給定長(zhǎng)度的隨意一個(gè)基因片段被合成,接著再插進(jìn)噬菌體基因里,確定肽鏈順序之后,就可以進(jìn)行化學(xué)合成,并將其固定在支持物上面。一般來(lái)說(shuō),融合蛋白質(zhì)具有易純化的特點(diǎn),用于蛋白質(zhì)純化的標(biāo)記有很多,如聚組氨酸、聚精氨酸等,參與親和純化的蛋白質(zhì)融合伙伴也有很多,如蛋白質(zhì)A和乳糖抑制物等。重組人胰高血糖素樣肽-1經(jīng)過(guò)高密度發(fā)酵之后,培養(yǎng)出的菌體超聲波破碎后就用Glutathione-Sspharose4B裂解液實(shí)施親和層析,獲得GST融合蛋白質(zhì),接著再經(jīng)由CNBr裂解和QAESspharose柱層析與脫鹽兩個(gè)步驟,獲得純度高于90%的人胰高血糖素樣肽-1。

生物學(xué)活性分析表明:人胰高血糖素樣肽-1有明顯的降血糖活性。Lu等基于pGEX-6p-3之上,利用E.表達(dá)APXa與PAXb兩種大米抗壞血酸過(guò)氧化酶APX基因。APX的表達(dá)形式是GST融合蛋白質(zhì),借助谷胱甘肽瓊脂糖4B實(shí)施親和層析,分別獲得產(chǎn)量40毫克和73毫克。

來(lái)源于環(huán)狀芽孢桿菌WL-12的殼聚糖酶A1殼聚糖結(jié)合區(qū)的組成是45個(gè)氨基酸,是殼聚糖特異性的有效體現(xiàn)。殼聚糖結(jié)合區(qū)和乙內(nèi)酰脲酶基因編碼區(qū)的C端相融合,以E.為載體進(jìn)行表達(dá),產(chǎn)物中可溶性蛋白質(zhì)含量為8%。經(jīng)由SDS-PAGE分析,表明融合蛋白質(zhì)和親和介質(zhì)兩者的連接具有較高的穩(wěn)定性、特異性及可逆性。

3 結(jié)語(yǔ)

重組蛋白質(zhì)的分離純化是一項(xiàng)十分系統(tǒng)和復(fù)雜的技術(shù),除了本文論述的層析技術(shù)之外,還可以通過(guò)凍融循環(huán)實(shí)現(xiàn)大腸桿菌胞質(zhì)里重組蛋白的有效分離。在信息化時(shí)代,未來(lái)重組蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)將會(huì)朝著全自動(dòng)化、高分辨率等方向發(fā)展。

[1]牛瑞,秦勝利.蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)研究進(jìn)展[J].化工科技市場(chǎng),2010(04):16-18.

[2]呂微,蔣劍春,徐俊明.蛋白質(zhì)提取及分離純化研究進(jìn)展[J].精細(xì)石油化工進(jìn)展,2010(11):52-56.