時(shí)冬寧

(遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 遼寧大連 116081)

1 引言

土壤真菌(soil fungi)是指土壤中具有真核細(xì)胞的單細(xì)胞或多細(xì)胞分枝絲狀體或單細(xì)胞個(gè)體。土壤真菌在環(huán)境中發(fā)揮著重要的作用。例如,許多土壤真菌是植物病原菌,對(duì)其研究有利于根除農(nóng)業(yè)病害;還有一些土壤真菌與植物共生,它們對(duì)森林中植被的生存起著重要作用;此外,土壤真菌也是生態(tài)環(huán)境中的分解者,將動(dòng)植物殘?bào)w變成有用的碳源、氮源,重新被吸收利用,從而為生態(tài)平衡做出重要貢獻(xiàn)。真菌與動(dòng)植物一樣,是一個(gè)獨(dú)特的生物界,土壤真菌的研究受到越來(lái)越多的重視,保護(hù)真菌工作也逐漸開(kāi)展起來(lái)。分子生物學(xué)方法是在分子水平上研究生命現(xiàn)象的科學(xué)。運(yùn)用分子生物學(xué)方法研究土壤真菌,直接提取DNA,避免了傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法,彌補(bǔ)了傳統(tǒng)方法分離率低的缺陷,能夠分離出許多難培養(yǎng)的真菌,從而為豐富真菌資源,研究真菌分布,提供了有利的方法。

2 土壤真菌多樣性的分子生物學(xué)研究方法

近年來(lái)興起的分子生物學(xué)研究方法如:變性梯度凝膠電泳技術(shù)(DGGE)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA技術(shù)(RAPD)、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)(AFLP)、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)(RFLP)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性技術(shù)(SSCP)、核糖體基因間區(qū)分析(RISA)、熒光原位雜交技術(shù)(FISH)、高通量技術(shù)等已經(jīng)較為成熟,為土壤真菌的研究提供有效的保證[1]。本文主要介紹以下三種技術(shù)。

2.1 變性梯度凝膠電泳技術(shù)(DGGE)

不同的DNA有不同的變性濃度,DGGE技術(shù)利用這一特點(diǎn)通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠中變性劑濃度梯度的不同,從而將序列不同的DNA分開(kāi)。理論上DGGE技術(shù)能夠?qū)⒅淮嬖趩螇A基差異的DNA分開(kāi)。DGGE技術(shù)在研究土壤真菌的群落結(jié)構(gòu)中發(fā)揮重要作用。它能夠同時(shí)研究多個(gè)樣品,分離優(yōu)勢(shì)菌群,操作簡(jiǎn)單,可重復(fù)。DGGE技術(shù)在土壤真菌的分子生態(tài)學(xué)研究中具有獨(dú)特的優(yōu)越性,已經(jīng)成為一個(gè)快速分析土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的有力工具,為土壤真菌的深入研究提供依據(jù)。如Miao Wang等[2],運(yùn)用DGGE方法研究環(huán)境改變對(duì)土壤真菌群落的影響,研究表明氮源增加顯著改變了土壤真菌類群的組成。

2.2 高通量測(cè)序技術(shù)

高通量測(cè)序技術(shù)是分子生物學(xué)領(lǐng)域的一次重要變革。高通量測(cè)序技術(shù)一次能夠測(cè)定幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條的DNA分子序列。通過(guò)對(duì)大量序列的分析比對(duì)來(lái)研究土壤真菌的分布特點(diǎn)。高通量測(cè)序技術(shù)領(lǐng)域的發(fā)展,使得核酸序列的測(cè)定速度增加、測(cè)定成本下降。因此,高通量測(cè)序技術(shù)將不斷的被大家采用和推廣,必將擁有廣闊的發(fā)展空間。Xiao-gang Li等[3],運(yùn)用454焦磷酸測(cè)序技術(shù),分析花生耕作地的土壤真菌,從18個(gè)土壤樣品中獲得194783條序列片段,通過(guò)分析表明花生產(chǎn)量下降與土壤中病原真菌的增加有關(guān)。

2.3 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)(AFLP)

AFLP技術(shù)是基于PCR反應(yīng)的一種選擇性擴(kuò)增限制性片段的方法。AFLP技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是可靠性高,分辨率高、穩(wěn)定性好、效率高,是目前一種被廣泛應(yīng)用的分子標(biāo)記。用此技術(shù)研究土壤真菌能得到很好的效果。李潞濱等[4],對(duì)19株中國(guó)蘭屬植物菌根共生絲核菌進(jìn)行了AFLP分析,結(jié)果表明蘭花地理分布、所屬種和生態(tài)類型是影響中國(guó)蘭屬植物菌根真菌多樣性及其與蘭花間專一性關(guān)系的關(guān)鍵因素。

3 前景

當(dāng)今時(shí)代分子生物學(xué)已經(jīng)應(yīng)用到越來(lái)越多的領(lǐng)域,通過(guò)分子生物學(xué)方法研究真菌,不但直接的反應(yīng)了真菌種類和類群的變化趨勢(shì),并且能夠?yàn)橥寥览砘再|(zhì)的變化提供依據(jù),從而反應(yīng)環(huán)境變化的趨勢(shì),為現(xiàn)在越來(lái)越受到重視的生態(tài)環(huán)境問(wèn)題提供了有效的方法。但是如今分子生物學(xué)的研究還沒(méi)有廣泛的開(kāi)展起來(lái),隨著分子生物學(xué)的進(jìn)一步發(fā)展,將會(huì)進(jìn)一步多層次,多角度的研究土壤真菌,從而為土壤真菌的進(jìn)一步探索和發(fā)現(xiàn)提供強(qiáng)有力的技術(shù)支持。

[1]周桔,雷霆.土壤微生物多樣性影響因素及研究方法的現(xiàn)狀與展望[J].生物多樣性,2007,15(3):306-311.

[2]Miao Wang,Shuai Shi,Fei Lin,Ping Jiang.Response of the soil fungal community to multi-factor environmental changes in a temperate forest[J].Applied Soil Ecology,81(2014)45-56.

[3]Xiao-gang Li,Chang-feng Ding,Tao-lin Zhang,Xing-xiang Wang.Fungal pathogen accumulation at the expense of plant-beneficial fungi as a consequence of consecutive peanut monoculturing[J].Soil Biology&Biochemistry,72(2014)11-18.

[4]李潞濱,胡陶,楊凱等.中國(guó)蘭屬植物菌根真菌的AFLP多樣性分析[J].園藝學(xué)報(bào),2008,35(l):81-86.