陽秋香等

[摘要] 目的 探討貝伐單抗聯(lián)合放療對(duì)人肺癌A549細(xì)胞株裸鼠移植瘤的作用。 方法 將人肺癌A549細(xì)胞接種于24只裸鼠后腿皮下，10 d后腫瘤體積在100～200 mm3之間，按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組（無菌生理鹽水注射）、貝伐單抗組（每次注射貝伐單抗10 mg/kg，每周1次，共3次）、放療組（5 Gy/次，共2次）、貝伐單抗聯(lián)合放療組（聯(lián)用貝伐單抗和放療）。治療過程中測(cè)量腫瘤大小及重量，41 d后處死裸鼠，切取移植瘤組織。采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)各組標(biāo)本的腫瘤微血管密度（MVD）和血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的表達(dá)情況，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 結(jié)果 貝伐單抗聯(lián)合放療組移植瘤瘤體生長與對(duì)照組比較明顯受抑制（P < 0.05），抑瘤率達(dá)82.8%；免疫組織化學(xué)顯示貝伐單抗聯(lián)合放療組MVD、VEGF表達(dá)[（7.37±4.11）、（3.10±0.98）]較對(duì)照組[（14.40±5.01）、（6.00±1.90）]明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。 結(jié)論 貝伐單抗聯(lián)合放療可能通過抑制VEGF表達(dá)而增強(qiáng)非小細(xì)胞肺癌的放射敏感性。

[關(guān)鍵詞] 貝伐單抗；放療；移植瘤；肺癌

[中圖分類號(hào)] R734.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2015）05（b）-0018-04

Effect of Bevacizumab combined with radiotherapy on lung cancer xenografts in nude mice

YANG Qiuxiang ZHANG Huanhuan YUAN Taize LIANG Ying YU Jinxiu WANG Wenjin ZHANG Xiuping

Department of Radiotherapy， the Affiliated Cancer Hospital of Guangzhou Medical University， Guangdong Provicne， Guangzhou 510095， China

[Abstract] Objective To explore the effect of Bevacizumab combined with radiotherapy on lung cancer xenografts in nude mice. Methods The human lung cancer A549 cells were injected sc into the hind legs of nude mice. When the volume of tumor was about 100-200 mm3 after 10 days， nude mice were randomly divided into four groups： control group （injected with saline solution）， Bevacizumab group （treated with Bevacizumab 10 mg/kg， once a week， for three times）， radiotherapy group （5 Gy/fraction， twice） and Bevacizumab in combination with radiotherapy group （treated with Bevacizumab and radiotherapy）. The tumor size and weight were measured during the treatment. The mice were sacrificed after 41 days. The tumor tissues were collected. The expression of microvessel density （MVD） and vascular endothelial growth factor （VEGF） were detected in histologic sections of xenografts by immunohistochemistry and analyzed by statistical method. Results The subcutaneous xenografts in Bevacizumab in combination with radiotherapy group were decreased significantly as compared with control group （P < 0.05）. The tumor inhibition rate was 82.8%. Immunohistochemistry revealed that Bevacizumab in combination with radiotherapy group could remarkably reduce the MVD and the expression of VEGF [（7.37±4.11）， （3.10±0.98）] as compared with the control group [（14.40±5.01）， （6.00±1.90）] （P < 0.05）. Conclusion Bevacizumab enhances the radiosensitivity of non-small cell lung cancer by the inhibition of VEGF expression.

[Key words] Bevacizumab； Radiotherapy； Xenograft； Lung cancer

肺癌是目前世界上發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤。非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占肺癌總數(shù)的80%～85%，大多數(shù)患者就診時(shí)已處于晚期，主要采用放、化療及靶向治療等綜合治療，因腫瘤巨大和/或放射抗拒等原因，療效往往不理想，5年總生存率約為17%[1]。因而通過將放療與靶向治療聯(lián)合來改善放療抵抗、提高放療療效成為目前研究的熱點(diǎn)。貝伐單抗（Bevacizumab）是一種以血管內(nèi)皮生長因子（vascular edothelial growth factor，VEGF）為靶點(diǎn)的分子靶向藥物，已經(jīng)被美國食品與藥物管理局（FDA）批準(zhǔn)用于治療轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌、轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌、轉(zhuǎn)移性腎癌等惡性腫瘤[2]。研究表明貝伐單抗具有放射治療增敏的作用[3]。于丹丹等[4]將貝伐單抗與放療聯(lián)合并觀察其對(duì)乳腺癌移植瘤生長的影響，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合治療組對(duì)腫瘤生長的抑制作用最為顯著，并進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)聯(lián)合治療組缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）、VEGF水平明顯降低，提示貝伐單抗可能通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖和減少血管生成，從而抑制腫瘤生長。另外，一些臨床前研究及臨床試驗(yàn)證明貝伐單抗可以與放射治療聯(lián)合應(yīng)用于膠質(zhì)瘤[5]、骨肉瘤[6]、直腸癌[7]等惡性腫瘤中。但目前貝伐單抗聯(lián)合放射治療應(yīng)用于肺癌的報(bào)道較少。本研究旨在探討貝伐單抗聯(lián)合放療對(duì)非小細(xì)胞肺癌的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 動(dòng)物及細(xì)胞株 24只3～4周齡的BALB/C（nu/nu）裸小鼠（SPF級(jí)，合格證號(hào)：44007200003832）購自廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，雌雄各半，體重13～14 g，于廣州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)層流柜內(nèi)飼養(yǎng)；人肺癌細(xì)胞株A549由廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所提供。

1.1.2 藥物及主要試劑 貝伐單抗購自瑞士羅氏制藥公司，100 mg/支；CD34兔單克隆抗體及VEGF小鼠單克隆抗體均購自美國Abcam公司；免疫組化試劑盒（PV6001/6002/6003）及DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 放療儀器 于中山大學(xué)腫瘤醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心照射，RS 2000 X-線輻射儀，由Rad Source Technologies公司生產(chǎn)，電壓為160 kV，電流25 mA，0.3 mm銅過濾，劑量率為623 cGy/min。

1.2 方法

1.2.1 肺癌細(xì)胞培養(yǎng)及肺癌裸鼠移植瘤動(dòng)物模型建立 將人A549肺癌細(xì)胞置于含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2條件的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長期的A549細(xì)胞制成5×107/mL單細(xì)胞懸液，取0.1 mL接種于裸鼠右側(cè)大腿根部皮下。

1.2.2 貝伐單抗聯(lián)合放射治療對(duì)肺癌裸鼠移植瘤的作用實(shí)驗(yàn) 建立裸鼠移植瘤模型24只，待移植瘤生長10 d，至體積100～200 mm3后，按隨機(jī)數(shù)字表法分為4組：對(duì)照組、貝伐單抗組、放療組和貝伐單抗聯(lián)合放療組，每組6只裸鼠。貝伐單抗組及貝伐單抗聯(lián)合放療組分別于分組后第1、8、17天首先給予貝伐單抗（每只10 mg/kg，生理鹽水稀釋成0.1 mL）腹腔注射。對(duì)照組及放療組給予腹腔注射等量滅菌生理鹽水。于分組后第2、9天放療組及貝伐單抗聯(lián)合放療組同時(shí)給予放射治療，每只裸鼠固定在專門設(shè)計(jì)的鉛制夾具中，充分暴露腫瘤組織，其余不需照射的部位用鉛擋遮住，5 Gy/次，每周1次，共10 Gy/2次。接種前和接種后，每3天稱裸鼠體重，并用游標(biāo)卡尺測(cè)量移植瘤的最長徑（a）和最短徑（b），按公式V=ab2×0.52（mm3）計(jì)算腫瘤體積。接種后第41天，斷頸處死動(dòng)物，取出腫瘤，稱重。抑瘤率的計(jì)算公式為：腫瘤生長抑制率=（對(duì)照組平均瘤質(zhì)量-治療組平均瘤質(zhì)量）/對(duì)照組平均瘤質(zhì)量×100%。

1.2.3 免疫組織化學(xué)染色 CD34兔單克隆抗體及VEGF小鼠單克隆抗體濃度分別為1︰200和1︰100。取出腫瘤組織，10%中性甲醛固定，常規(guī)脫水包埋，4 μm連續(xù)切片，抗原熱修復(fù)，分別滴加一抗和二抗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。腫瘤微血管密度（MVD）的計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)：以CD34標(biāo)記微血管，依據(jù)Veidner標(biāo)準(zhǔn)對(duì)著染的血管進(jìn)行密度分級(jí)。先在低倍鏡（100×）下全面觀察切片，在腫瘤浸潤區(qū)域選取血管內(nèi)皮細(xì)胞染色清晰、背景對(duì)比良好、微血管數(shù)量最密集的視野，在高倍鏡（200×）下記錄5個(gè)視野內(nèi)的微血管數(shù)，取其平均值作為MVD值。VEGF陽性表達(dá)為細(xì)胞質(zhì)呈黃色或棕黃色，VEGF的判定標(biāo)準(zhǔn)：①陽性細(xì)胞所占比例：陽性細(xì)胞數(shù)<1/3為1分，1/3～2/3為2分，>2/3為3分；②陽性著色強(qiáng)度評(píng)分：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；③將陽性細(xì)胞比例與著色強(qiáng)度計(jì)分相乘為最后評(píng)分。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 貝伐單抗聯(lián)合放療對(duì)肺癌移植瘤生長的抑制作用

24只裸鼠全部成瘤，成瘤率為100%。分組時(shí)各組裸鼠體重及移植瘤體積無明顯差異（P > 0.05）。放療組及貝伐單抗聯(lián)合放療組移植瘤瘤體生長與對(duì)照組比較明顯受抑制（P < 0.05），而貝伐單抗聯(lián)合放療組較放療組生長雖有抑制，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）（圖1）。治療結(jié)束后對(duì)照組、貝伐單抗組、放療組、貝伐單抗聯(lián)合放療組的移植瘤質(zhì)量分別為（2.68±0.84）、（1.60±0.06）、（1.08±0.27）、（0.46±0.53）g。對(duì)瘤體重量進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，各治療組的腫瘤質(zhì)量均顯著低于對(duì)照組（P < 0.01），且貝伐單抗聯(lián)合放療組的腫瘤質(zhì)量最輕。貝伐單抗組和放療組抑瘤率分別為40.3%和59.7%，兩者聯(lián)用抑瘤率達(dá)82.8%。

2.2 貝伐單抗聯(lián)合放療對(duì)裸鼠腫瘤微血管密度的影響

CD34反映腫瘤內(nèi)部微血管分布（圖2）。對(duì)照組、貝伐單抗組、放療組、貝伐單抗聯(lián)合放療組的MVD值分別為（14.40±5.01）、（7.87±2.51）、（12.47±7.00）、（7.37±4.11）。貝伐單抗組與貝伐單抗聯(lián)合放療組MVD值均明顯低于對(duì)照組（P < 0.05）。單純放療組與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。

2.3 貝伐單抗聯(lián)合放療對(duì)裸鼠腫瘤VEGF表達(dá)的影響

VEGF在腫瘤細(xì)胞胞漿和血管內(nèi)皮細(xì)胞均有表達(dá)，主要在胞漿。對(duì)照組、貝伐單抗組、放療組、貝伐單抗聯(lián)合放療組的VEGF陽性評(píng)分分別為（6.00±1.90）、（3.33±2.07）、（6.33±2.58）、（3.10±0.98）分。貝伐單抗組及貝伐單抗聯(lián)合放療組VEGF表達(dá)較對(duì)照組顯著下調(diào)，且聯(lián)合治療組更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P = 0.015）。見圖2。

3 討論

放射治療是Ⅲ期不可手術(shù)非小細(xì)胞肺癌治療的一種重要手段。由于放療抵抗，放射治療劑量的增加提高了腫瘤控制率，但周圍正常組織和器官的急、慢性毒副作用加重[8]。因此，國內(nèi)外學(xué)者致力于尋找一種有效、毒副作用較小的放射增敏藥物，提高放射治療療效。

惡性腫瘤的生長必須依賴足夠的血液供應(yīng)，切斷腫瘤的血液供應(yīng)則可抑制腫瘤生長，造成腫瘤細(xì)胞壞死。因此抗血管生成靶向治療成為近幾十年腫瘤治療領(lǐng)域的熱點(diǎn)。貝伐單抗是一種以VEGF為靶點(diǎn)的重組人單克隆IgG1抗體，可結(jié)合VEGF并阻止其與內(nèi)皮細(xì)胞表面的受體（Flt-1和KDR）結(jié)合，抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖和新生血管形成[9-10]。本研究發(fā)現(xiàn)，貝伐單抗能抑制肺癌移植瘤的生長，其抑瘤率為40.3%。此研究結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道[11]相一致，貝伐單抗靶向作用于處于增殖狀態(tài)的血管內(nèi)皮細(xì)胞，阻止VEGF所致血管再生，從而減少血供，促進(jìn)腫瘤壞死。另外，本研究發(fā)現(xiàn)貝伐單抗聯(lián)合放射治療對(duì)肺癌移植瘤的生長抑制作用最大（P < 0.05），提示貝伐單抗在肺癌皮下移植瘤放射治療模型中具有一定的放射增敏作用。Hoang等[12]在放療聯(lián)合貝伐單抗治療頭頸部鱗癌SCC1裸鼠模型的實(shí)驗(yàn)中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)放療聯(lián)合貝伐單抗組移植瘤的生長明顯受抑制，其抑制作用明顯優(yōu)于單純放療組和貝伐單抗組。Ou等[13]在NCI-H141動(dòng)物模型中得出了類似結(jié)果，表明貝伐單抗可以顯著提高放射治療效果。

VEGF是腫瘤血管生成中最重要的調(diào)節(jié)因子，可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖和分化，促進(jìn)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。VEGF表達(dá)受多種因素影響，其中低氧是誘導(dǎo)VEGF的重要刺激因素，放療本身也可以誘導(dǎo)VEGF高表達(dá)[14-15]。本研究進(jìn)一步免疫組化分析顯示貝伐單抗聯(lián)合放療組MVD、VEGF明顯低于對(duì)照組和放療組，可能與貝伐單抗下調(diào)VEGF表達(dá)有關(guān)。但具體機(jī)制尚不清楚。有研究顯示可能與抗血管生成治療引起的血管“正常化”有關(guān)[16]。即抗血管生成藥物能改建腫瘤紊亂的血管網(wǎng)，使之結(jié)構(gòu)、功能趨于正?；?，從而改善局部血液循環(huán)，使乏氧區(qū)的氧供增加，減少乏氧細(xì)胞的產(chǎn)生，降低VEGF與放療耐受相關(guān)因子的產(chǎn)生，最終使放療敏感性增加。

總之，本研究初步表明貝伐單抗聯(lián)合放療可以顯著增強(qiáng)抗腫瘤效應(yīng)，但其具體機(jī)制尚待繼續(xù)探討，下調(diào)VEGF表達(dá)可能是其放射增敏的機(jī)制之一。但本研究并未涉及最佳給藥和放療時(shí)間及劑量的問題，因此尚需進(jìn)一步探索。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Farhat FS，Wissam Houhou. Targeted therapies in non-small cell lung carcinoma：what have we achieved so far？ [J]. Ther Adv Med Oncol，2013，5（4）：249-270.

[2] Hershman DL，Wright JD，Lim E，et al. Contraindicated use of Bevacizumab and toxicity in elderly patients with cancer [J]. Journal of Clinical Oncology，2013，31（28）：3592-3599.

[3] Summers J，Cohen MH，Keegan P，et al. FDA drug approval summary：bevacizumab plus interferon for advanced renal cell Carcinoma [J]. The Oncologist，2010，15（1）：104-111.

[4] 于丹丹，穆曉倩，顧閏，等.貝伐單抗對(duì)乳腺癌皮下移植瘤放療的增敏作用及其機(jī)制[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2013， 30（10）：2095-2097.

[5] McGee MC，Hamner JB，Williams RF，et al. Improved intratumoral oxygenation through vascular normalization increases glioma sensitivity to ionizing radiation [J]. International Journal of Radiation Oncology Biology Physics，2010，76（5）：1537-1545.

[6] 仲召陽，王東，卿毅李，等.貝伐單抗抑制骨肉瘤血管生成及與放療的協(xié)同作用研究[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2009，34（6）：733-736.

[7] Crane CH，Eng C，F(xiàn)eig BW，et al. Phase Ⅱ trial of neoadjuvant bevacizumab，capecitabine，and radiotherapy for locally advanced rectal cancer [J]. Int J Radiat Oncol Biol Phys，2010，76（3）：824-830.

[8] Liu YE，Lin Q，Meng FJ，et al. High-dose accelerated hypofractionated three-dimensional conformal radiotherapy（at 3 Gy/fraction）with concurrent vinorelbine and carboplatin chemotherapy in locally advanced non-small-cell lung cancer：a feasibility study [J]. Radiat Oncol，2013，8：198.

[9] Pavlidis ET，Pavlidis TE. Role of bevacizumab in colorectal cancer growth and its adverse effects：a review [J]. World J Gastroenterol，2013，19（31）：5051-5060.

[10] 王海蘭，詹正宇，馮苗，等.貝伐單抗治療高級(jí)別腦膠質(zhì)瘤的研究進(jìn)展[J].中國腫瘤臨床，2013，40（16）：1001-1004.

[11] Ma X，Yao Y，Yuan D，et al. Recombinant human endostatin endostar suppresses angiogenesis and lymphangiogenesis of malignant pleural effusion in mice [J]. PLoS One，2012，7（12）：e53449.

[12] Hoang T，Huang S，Armstrong E，et al. Enhancement of radiation response with bevacizumab [J]. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research，2012，31（1）：37.

[13] Ou G，Itasaka S，Zeng L，et al. Usefulness of HIF-1 imaging for determining optimal timing of combining bevacizumab and radiotherapy [J]. International Journal of Radiation Oncology Biology Physics，2009，75（2）：463-467.

[14] Zhou S，Gu LB，He J，et al. MDM2 regulates vascular endothelial growth factor mrna stabilization in hypoxia [J]. Mol Cell Biol，2011，31（24）：4928-4937.

[15] Kim YJ，Lee HJ，Kim TM，et al. Overcoming evasive resistance from vascular endothelial growth factor a inhibition in sarcomas by genetic [J]. Int J Cancer，2013，132（1）：29-41.

[16] Goel S，Duda DG，Xu L，et al. Normalizion of the vasculature for treatment of cancer and other diseases [J]. Physiol Rev，2011，91（3）：1071-1121.

（收稿日期：2015-01-13 本文編輯：張瑜杰）