李文暢，沈洪昇，白　雪，馮文茹，胡人杰，周　潔（.天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所，天津30000；.天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，天津30050）

溫陽通竅中藥復(fù)方對大鼠腦膠質(zhì)瘤作用機制的體內(nèi)實驗研究*

李文暢1，沈洪昇1，白雪2，馮文茹1，胡人杰1，周潔2
（1.天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所，天津300020；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，天津300150）

［目的］研究溫陽通竅中藥復(fù)方對大鼠C6腦膠質(zhì)瘤的抑制作用機制。［方法］C6膠質(zhì)瘤細胞大鼠顱內(nèi)接種，建立腦膠質(zhì)瘤模型。磁共振成像（MRI）條件下將模型動物隨機分為對照組、溫陽通竅復(fù)方低劑量組和高劑量組。除對照組外，其余各組給予對應(yīng)劑量的藥物，3周后取腦膠質(zhì)瘤組織，進行病理組織學(xué)檢測并進行相關(guān)分析，檢測基質(zhì)細胞衍生因子-1（SDF-1）、結(jié)締組織生長因子（CTGF）、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）指標。［結(jié)果］MRI檢測表明體內(nèi)實驗成功構(gòu)建大鼠腦膠質(zhì)瘤模型。組織病理學(xué)觀察結(jié)果顯示，與對照組動物相比，給藥組動物腫瘤微血管減少，可見變性壞死瘤細胞，瘤組織壞死較對照組明顯，高劑量治療組略強。溫陽通竅給藥組SDF-1、CTGF、bFGF較對照組呈降低趨勢。［結(jié)論］溫陽通竅中藥復(fù)方對C6腦膠質(zhì)瘤細胞的增殖確有抑制作用，該作用或許與腫瘤組織中SDF-1、CTGF、bFGF的表達相關(guān)。

C6腦膠質(zhì)瘤；溫陽通竅中藥復(fù)方；SDF-1；CTGF；bFGF

腦膠質(zhì)瘤是神經(jīng)系統(tǒng)最常見的腫瘤，占腦內(nèi)腫瘤的40%～50%［1］，惡性度高，同時也是顱腦內(nèi)預(yù)后最差的腫瘤，近30年來對腦膠質(zhì)瘤的治療并沒有顯著突破［2］。目前常規(guī)治療方法是手術(shù)切除輔以放化療，術(shù)后易復(fù)發(fā)［3］，臨床將卡莫司汀作為基本化療藥物。研究發(fā)現(xiàn)，多種中藥及復(fù)方對腫瘤有抑制作用［4-5］或?qū)鼓[瘤藥物產(chǎn)生增效減毒作用［6］，且因中藥具有較高的安全性，故而被應(yīng)用在腫瘤治療中。溫陽通竅中藥復(fù)方由附子、麻黃、桂枝、蜈蚣、鱉甲、黃芪、川芎、當歸、澤瀉、防己、藁本等藥物組成，攻痰逐濕，清熱解毒，從整體角度祛邪扶正。筆者嘗試以溫陽通竅中藥復(fù)方治療大鼠C6腦膠質(zhì)瘤，檢測其相關(guān)指標，探討溫陽通竅中藥復(fù)方對腦膠質(zhì)瘤的抑制作用。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物及細胞實驗動物：SD大鼠，雄性，體質(zhì)量220～240 g，購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所，動物許可證號SCXK-（軍）2009-007，動物合格證號0001506。大鼠腦膠質(zhì)瘤C6細胞：由天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院惠贈。

1.1.2試劑溫陽通竅中藥復(fù)方生藥材，由天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥劑科提供。培養(yǎng)基（DMEM/F12），Gibco公司，批號1285082。釓雙胺注射液，規(guī)格15 mL∶4.305 g，通用電氣藥業(yè)（上海）有限公司生產(chǎn)，批號11870116。水合氯醛，規(guī)格100 mL∶10 g，購自天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，院內(nèi)制劑。康派特醫(yī)用膠噴霧型，規(guī)格：噴霧型每只1.5 mL，批號120125。Hyclone血清，天津瑞博星科技有限公司，批號GDB0058。RNA提取槍尖、EP管等耗材，購自Axygen公司。RNA提取試劑盒，北京百泰克公司的RP2402。RNA酶抑制劑，購自Invitroge公司，批號15518012。cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，購自Invitrogen公司，批號C28025032。實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）耗材，購自ABI公司，批號4306737、4360954。SYBR染料，購自ABI公司，批號4472918。PCR引物，購自Invitrogen公司。

1.1.3儀器培養(yǎng)瓶，規(guī)格25 mL、75 mL，美國Corning公司，批號：430168。二氧化碳（CO2）孵育箱（C-2021型），TyTe公司。內(nèi)熱蒸汽消毒器（yxQG02），山東新華醫(yī)療器械廠。臺式離心機（LD4-2型），北京醫(yī)用離心機廠。PL-203型電子天平，Mettler-Toledo公司產(chǎn)品。生物光學(xué)顯微鏡，日本產(chǎn)Nikon。96孔板（655180），Greinerbio-one。微量進樣器，規(guī)格25 μL，上海高鴿工貿(mào)有限公司。磁共振成像（MRI），西門子Verio3.0 T成像系統(tǒng)。

1.2實驗方法

1.2.1藥物溶液的制備將生藥材600g用2400mL冷水浸泡，靜置過夜。將浸泡藥物煎制45 min后過濾。取濾渣加入1 500 mL冷水繼續(xù)煎制20 min后過濾。將兩次濾液合并，濃縮得浸膏175 g。實驗時配制成所需濃度。

1.2.2動物造模腫瘤接種過程［7］：1）常規(guī)細胞培養(yǎng)。2）將處于對數(shù)生長期的細胞用2.5 g/L胰蛋白酶消化、離心后，以含瓊脂糖（15 g/L），不含血清的DMEM/F12混合培養(yǎng)液制備細胞懸液，細胞濃度為3×107/mL。3）大鼠用10%的水合氯醛麻醉，固定頭部，常規(guī)消毒、鋪巾、切開，暴露前囟，用牙科鉆于中線右3.5 mm、冠狀縫后1 mm處鉆孔。以顱骨表面計算，進針3.5 mm，退0.5 mm，皮質(zhì)、白質(zhì)交界處，接種C6細胞，以25 μL注射器吸取細胞懸液，接種量為10 μL，注射速度1 μL/min，注射完畢留針5 min。4）骨蠟封閉骨孔。5）表面皮膚傷口用醫(yī)用膠粘合。大約1 h后動物蘇醒，分籠飼養(yǎng)，隨時觀察動物的狀態(tài)。觀察14d后，MRI檢測［8］，投照條件：層厚1.5 mm，F(xiàn)ov 80 mm×80 mm（視野內(nèi)），層距0.15 mm，冠狀、矢狀及橫斷面T1加權(quán)（TR/TE=540/22 ms），T2加權(quán)（TR/TE=4 400/22 ms），注射造影劑釓雙胺注射液每只0.4 mL，T1加權(quán)掃描。

1.2.3觀測指標按隨機數(shù)字表法將造模成功大鼠分成對照組、低劑量組（含生藥6.5 g/kg）和高劑量組（含生藥26 g/kg）。連續(xù)灌胃給藥21 d，對照組灌胃等量蒸餾水。末次給藥后24h，開顱取腦組織，做病理學(xué)觀察，提取腫瘤組織做相關(guān)指標的PCR檢測。

1.3數(shù)據(jù)分析應(yīng)用SPSS18.0 for windows軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，正態(tài)分布計量資料組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，偏態(tài)分布計量資料組間比較采用軼和檢驗，組間兩兩比較采用Nemenyi法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果與分析

2.1大鼠C6腦膠質(zhì)瘤造模模型檢測MRI法檢測造模大鼠，正常大鼠腦組織（見圖1）無明顯病理變化，接種C6腦膠質(zhì)瘤大鼠腦組織（見圖2）可觀察到接種位置異常信號，邊界較清晰。

圖1　正常大鼠腦組織

圖2　C6膠質(zhì)瘤大鼠腦組織

2.2病理學(xué)檢測經(jīng)福爾馬林液固定腦組織標本，取材于腫瘤接種部位，乙醇梯度脫水、包埋，制片、蘇木精-伊紅（HE）染色，顯微鏡觀察，經(jīng)IDA-2000高清晰度數(shù)碼顯微圖像分析系統(tǒng)采圖。病理結(jié)果見圖3、圖4、圖5。

造模大鼠腦組織對照組，可見瘤細胞密集，無一定排列，細胞異型性明顯，細胞核分裂相易見，瘤細胞惡性特征明顯，未見明顯包膜，呈浸潤性生長，可見腫瘤組織變性，中心可見明顯的出血及小片狀、大片狀壞死或柵欄狀壞死。正常腦組織與腫瘤交界處雖能見到腫瘤細胞浸潤，但仍能見到一個較明顯的界線，腫瘤微血管豐富。藥物作用后，瘤細胞仍具惡性特征，腫瘤微血管減少，可見變性壞死瘤細胞，瘤組織壞死較對照組明顯，高劑量治療組略強。提示溫陽通竅中藥復(fù)方具有一定抗腫瘤作用。

2.3相關(guān)指標測定腦膠質(zhì)瘤組織中的基質(zhì)細胞衍生因子-1（SDF-1）、結(jié)締組織生長因子（CTGF）、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）腫瘤生長和轉(zhuǎn)移相關(guān)因子的表達，結(jié)果見表1、圖6、圖7、圖8。結(jié)果表明溫陽通竅高劑量組和低劑量組的3種因子水平均低于對照組。

圖3　對照組（HE染色×100）

圖4　低劑量組（HE染色×100）

圖5　高劑量組（HE染色×100）

表1　腦膠質(zhì)瘤組織指標檢測%

表1　腦膠質(zhì)瘤組織指標檢測%

組別nSDF-1CTGFbFGF對照組80.348 1±0.144 51.016 5±0.292 70.298 1±0.192 1低劑量組80.297 4±0.075 10.552 0±0.329 80.187 5±0.051 1高劑量組80.276 4±0.173 90.699 1±0.521 90.197 9±0.065 2

3　討論

腦膠質(zhì)瘤是原發(fā)性神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中發(fā)病率較高的惡性腫瘤，MRI法可以較準確診斷其發(fā)病情況［9］。由于腦膠質(zhì)瘤發(fā)病位置特殊且易浸潤生長，手術(shù)切除對周圍組織容易造成損傷，故而往往不易切除完全，殘余腫瘤細胞如果不能被機體自身免疫系統(tǒng)抑制和殺滅，則極有可能復(fù)發(fā)。臨床常用化療藥物如卡莫司汀等會產(chǎn)生骨髓抑制、肝腎損傷等毒副作用，腫瘤細胞也會對藥物產(chǎn)生耐藥性［10］。中醫(yī)以整體觀念，辨證論治，調(diào)動患者自身的調(diào)節(jié)機制，以達治愈疾病的目的［11］。近年來，中藥因其安全性較高逐漸成為抗腫瘤研究的新方向。中醫(yī)學(xué)將氣和血視為人體生理功能的重要基礎(chǔ)，認為腦膠質(zhì)瘤是由于臟腑功能失調(diào)，痰濕內(nèi)生，感受外邪，上犯清竅，瘀阻腦絡(luò)而產(chǎn)生。溫陽通竅中藥復(fù)方是治療腦膠質(zhì)瘤的經(jīng)驗方，由附子、麻黃、桂枝、蜈蚣、鱉甲、黃芪、川芎、當歸、澤瀉、防己、藁本組成?，F(xiàn)代藥理證明，方中君藥附子性辛、甘，大熱，有大毒，其性剛雄，通行十二經(jīng)，溫五臟之陽，具有回陽救逆，祛風(fēng)除濕，散寒止痛等功效，且有抗炎抗腫瘤作用，張亞平等［12］認為附子總生物堿能夠改善小鼠乳腺癌的體寒血瘀體征，阻止腫瘤進展；桂枝、麻黃暢達陽氣，使血脈通暢；川芎活血行氣；黃芪補氣升陽，行滯通痹，脫毒排膿［13］；鱉甲主消散，蜈蚣善走竄，兩者軟堅散結(jié)，對腫瘤細胞增長有抑制作用［14-15］，凡氣血凝聚之處皆能開之，亦有黃芪鱉甲湯用于腫瘤治療的臨床案例；藁本祛風(fēng)散寒，澤瀉、防己利水消腫，化濁降脂。本方祛邪扶正，清熱解毒，活血通絡(luò)，軟堅散結(jié)，調(diào)節(jié)機體內(nèi)在功能的平衡，從整體上抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要條件是血管生成，許多生長因子如bFGF、CTGF等都與腫瘤的增長和侵襲密切相關(guān)。SDF-1是細胞趨化因子的一種，該因子的表達及其受體CXCR4與人類多種腫瘤密切相關(guān)［16］。該因子參與腫瘤細胞的增殖與生長，增加了腫瘤細胞向遠處轉(zhuǎn)移的活性，同時，SDF-1能夠加快腫瘤細胞的增殖，提高其生存力，并通過與CXCR4的結(jié)合對腫瘤細胞轉(zhuǎn)移起到趨化作用。CTGF是結(jié)締組織生長因子，它與細胞外基質(zhì)相互作用，可調(diào)節(jié)細胞間的黏附與細胞遷移，促進有絲分裂的發(fā)生，參與血管生成，與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展、浸潤轉(zhuǎn)移均密切相關(guān)［17］。CTGF是轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-beta）的下游介質(zhì)，可被TGF-beta誘導(dǎo)產(chǎn)生。有文獻報道在人乳腺癌細胞MCF-7中CTGF作為前凋亡因子，部分下調(diào)bcl-2蛋白表達，增強Caspase-3活性，能夠促進細胞凋亡［18］。Lee等［19］通過基因角度的分析證明CTGF沉默能夠降低膠質(zhì)瘤細胞的遷移。堿性成纖維細胞生長因子bFGF具有促有絲分裂和誘導(dǎo)血管生成的作用，能夠促進細胞遷移。文獻指出bFGF在腫瘤組織中的含量與腫瘤的惡性程度正相關(guān)［20］。

本課題組對SDF-1、CTGF、bFGF進行了檢測，溫陽通竅中藥復(fù)方作用下腫瘤組織中3個指標含量均低于對照組，盡管沒有統(tǒng)計學(xué)意義，但結(jié)合相關(guān)實驗結(jié)果綜合分析，考慮其對C6腦膠質(zhì)瘤的抑制作用與該因子降低趨勢呈一定的相關(guān)性。在今后相關(guān)實驗中，如增加實驗樣本數(shù)量、延長用藥時間，該相關(guān)指標或許能夠得到更為滿意的結(jié)果。綜上所述，溫陽通竅中藥復(fù)方制劑所具有的抗腫瘤作用機制尚需進一步深入的探討。

圖6　SDF-1

圖7　CTGF

圖8　bFGF

［1］虞歡東，于海濤，夏建國，等.順鉑聯(lián)合吡柔比星對腦膠質(zhì)瘤U87細胞株增殖的抑制作用［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)生，2014，52（15）:1-3.

［2］徐培坤，鄧鵬程，朱立新，等.腦膠質(zhì)瘤中ppENK、EDNRB 和CLDN-7基因甲基化狀態(tài)的研究［J］.安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2014，49（8）:1124-1127.

［3］張?zhí)m鳳，肖學(xué)文.髓鞘堿性蛋白在腦膠質(zhì)瘤的表達和臨床意義［J］.贛南醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2014，34（3）:352-353.

［4］張文謹，彭瑤，連增林，等.復(fù)方苦參注射液對子宮內(nèi)膜癌HEC-1B細胞Bcl-2/Bax、P27表達的影響［J］.天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2012，31（2）:88-91.

［5］陳偉，劉華一.中醫(yī)藥防止胃癌前病變機制的實驗研究進展［J］.天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2007，26（1）:54-56.

［6］胡文雷，張燕.加味生脈散合瓜蔞薤白半夏湯防治阿霉素引起心臟毒性的臨床觀察［J］.中國中醫(yī)藥科技，2014，21（3）:318-320.

［7］王偉民，朱誠，張光霽，等.腦立體定向接種C6細胞建立大鼠腦膠質(zhì)瘤模型［J］.中華實驗外科雜志，1995，12（4）: 221-222.

［8］王自勇，王鵬，楊渭川，等.大鼠C6腦膠質(zhì)瘤生長規(guī)律的MRI與病理學(xué)觀察［J］.安徽醫(yī)學(xué)，2009，30（12）:1423-1426.

［9］李穎，馬林.腦膠質(zhì)瘤動物模型的構(gòu)建和MRI研究進展［J］.中國醫(yī)學(xué)影像學(xué)雜志，2014（5）:387-390.

［10］安玉勝.腦膠質(zhì)瘤細胞系U251中Nanog基因表達和細胞耐藥及侵襲力的關(guān)系［J］.軍醫(yī)進修學(xué)院學(xué)報，2012，33 （11）:1164-1166.

［11］鄭文科，商洪才.中醫(yī)藥在防治腫瘤中的特色和優(yōu)勢［J］.天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2010，29（3）:166-168.

［12］張亞平，杜鋼軍，孫婷，等.附子總生物堿對乳腺癌小鼠的抗腫瘤作用［J］.中草藥，2012，43（10）:1986-1990.

［13］陳璇，東方.黃芪抗腫瘤機制研究進展及臨床應(yīng)用［J］.黑龍江醫(yī)藥，2014，26（1）:985-986.

［14］羅慶東，王月飛，趙紅曄，等.鱉甲煎丸對肝癌荷瘤小鼠腫瘤組織生長及轉(zhuǎn)移的影響［J］.中國實驗方劑學(xué)雜志，2012，18（14）:230-231.

［15］蔡文武，李清龍，苗雄鷹，等.蜈蚣提取液對大鼠胰腺癌治療作用的研究［J］.中國醫(yī)師雜志，2013，15（12）:1646-1649.

［16］鄭淑芳，展曉紅，時麗芳，等.大腸癌中SDF-1與CXCR4的表達及臨床意義［J］.臨床與實驗病理學(xué)雜志，2013，29 （1）:9-13.

［17］Garcia P，Leal P，Ili C，et al.Inhibition of connective tissue growth factor（CTGF/CCN2）in gallbladder cancer cells leads to decreased growth in vitro［J］.Int J Exp Pathol，2013，94（3）:195-202.

［18］Hishikawa K，Oemar BS，Tanner FC，et al.Connective tissue growth factor induces apoptosis in human breast cancer cell line MCF-7［J］.J Biol Chem，1999，274（52）:37461-37466.

［19］Lee HK，Bier A，Cazacu S，et al.MicroRNA-145 is downregulated in glial tumors and regulates glioma cell migration by targeting connective tissue growth factor［J］. PLoS One，2013，8（2）:e54652.

［20］陳文慧，徐萌.腫瘤治療新靶點：堿性成纖維細胞生長因子及其受體信號［J］.中國腫瘤臨床，2014，41（7）:466-470.

In vivo study of traditional Chinese medicine Wenyang Tongqiao effect on rat Glioma mechanism

LI Wen-chang1，SHEN Hong-sheng1，BAI Xue2，F(xiàn)ENG Wen-ru1，HU Ren-jie1，ZHOU Jie2
（1.Tianjin Institute of Medical and Pharmaceutical Sciences，Tianjin 300020，China；2.The Second Hospital Affiliated to Tianjin University of TCM，Tianjin 300150，China）

［Objective］To study Wenyang Tongqiao traditional Chinese herbal compound inhibition on rat C6 glioma mechanism.［Methods］Put C6 glioma cells in rats with intracranial inoculation，and establish glioma model. Under the MRI（magnetic resonance imaging）conditions the animals were randomly divided into a control group model，Wenyang Tongqiao compound low dose and high dose group.In addition to the control group，the rest of the group was given the corresponding doses of the drug.After three weeks，extract glioma tissue，and use histopathological detection and correlation analysis to detect SDF-1（stromal cell-derived factor 1），CTGF（connective tissue growth factor），bFGF（basic fibroblast growth factor）indicators.［Results］MRI detected that successfully rat glioma model in vivo tests is constructed.Histopathological observation showed that，compared with control animals，tumor microvessels of animals administered reduce.Visible necrosis of tumor cells，tumor necrosis are more obvious compared with the control group，and the high dose group was slightly stronger.Wenyang Tongqiao administration group SDF-1，CTGF，bFGF compared with the control group showed a decreasing trend.［Conclusion］Wenyang Tongqiao Chinese herbal compound on C6 glioma cell proliferation inhibition indeed，perhaps related to the role of the SDF-1，CTGF，bFGF expression in tumor tissue.

C6 glioma；Wenyang Tongqiao；SDF-1；CTGF；bFGF

R285.5A

A

1673-9043（2015）03-0156-04

10.11656/j.issn.1673-9043.2015.03.08

天津市科技支撐計劃項目（11JCYBJC12500）。

李文暢（1988-），女，研究實習(xí)員，從事腫瘤藥物研發(fā)。

周潔，E-mail:cnzhoujie@126.com。

（2015-03-01）