高　杰，蒲位凌，任曉亮，任德飛，孫立麗，戚愛棣（天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，天津300193）

·中藥研究·

血必凈注射液中洋川芎內(nèi)酯I的降解動(dòng)力學(xué)研究*

高杰，蒲位凌，任曉亮，任德飛，孫立麗，戚愛棣
（天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，天津300193）

［目的］研究洋川芎內(nèi)酯I（Sen I）在血必凈注射液及水溶液中，不同pH緩沖液、不同溫度下降解的動(dòng)力學(xué)規(guī)律，為血必凈注射液及洋川芎內(nèi)酯I的提取、貯藏及使用條件提供依據(jù)。［方法］建立高效液相色譜分析方法，考察不同pH（1～13）和溫度（65、75、85、95℃）對(duì)Sen I穩(wěn)定性的影響，利用速率方程、化學(xué)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型及Arrhenius公式分析Sen I在不同條件下的降解規(guī)律并計(jì)算相關(guān)降解反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)。［結(jié)果］Sen I在堿性條件下降解較快，符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)規(guī)律，并隨堿性增強(qiáng)，降解速度明顯加快。溫度對(duì)降解速度影響較大，溫度升高，降解明顯加快。經(jīng)計(jì)算得，Sen I在水溶液和血必凈注射液中降解活化能分別為177.94 kJ/mol和194.86 kJ/mol。［結(jié)論］在堿性和高溫條件下，洋川芎內(nèi)酯I更易降解。同樣條件下，Sen I在血必凈注射液中的穩(wěn)定性都要高于其水溶液。

洋川芎內(nèi)酯I；血必凈注射液；pH；溫度；降解動(dòng)力學(xué)

血必凈注射液是由紅花、赤芍、川芎、丹參、當(dāng)歸等五味中藥的提取物組成的現(xiàn)代中藥制劑，具有活血化瘀，疏通脈絡(luò)，潰散毒邪，消除內(nèi)毒素的功效，臨床主要與抗生素并用治療膿毒癥［1-5］。近年來有關(guān)血必凈的不良反應(yīng)也時(shí)有報(bào)道，主要為過敏和休克反應(yīng)［6-9］。造成其過敏反應(yīng)的可能原因之一是在高溫滅菌或貯藏過程中由于有效成分降解，降解物作為半抗原，與血漿蛋白結(jié)合成為高致敏原而誘發(fā)過敏［9］。

洋川芎內(nèi)酯I（Sen I）為川芎中發(fā)揮藥效作用的主要成分之一。其結(jié)構(gòu)如圖1所示，其中含有內(nèi)酯、不飽和雙鍵等結(jié)構(gòu)，容易通過氧化、水解、光解和異構(gòu)化等反應(yīng)發(fā)生結(jié)構(gòu)改變［10-13］。左愛華等［14］研究發(fā)現(xiàn)，在自然光照下，Sen I通過異構(gòu)化反應(yīng)部分轉(zhuǎn)化為其同分異構(gòu)體（E）-6，7-反式-雙羥基藁本內(nèi)酯。Sen I的降解和新的降解產(chǎn)物生成都可能造成注射液質(zhì)量的降低甚至過敏反應(yīng)的發(fā)生。關(guān)于Sen I系統(tǒng)穩(wěn)定性研究鮮見報(bào)道，為了更好地儲(chǔ)存并控制其質(zhì)量，有必要對(duì)其在不同條件下的穩(wěn)定性進(jìn)行系統(tǒng)分析。

圖1　Sem I結(jié)構(gòu)

本研究利用恒溫加速法，以化學(xué)動(dòng)力學(xué)為理論基礎(chǔ)［15］，通過測(cè)定血必凈注射液中的主要活性成分Sen I在不同pH及溫度下含量隨時(shí)間的變化，考察pH和溫度對(duì)Sen I穩(wěn)定性的影響，以期從血必凈注射液主要活性成分在不同條件下的穩(wěn)定性為切入點(diǎn)，對(duì)SenI和相關(guān)制劑的貯藏及使用條件提供依據(jù)。

1　儀器與試藥

Waters e2695高效液相色譜儀，Waters 2998 PDA檢測(cè)器（美國Waters公司）；BT1250D分析天平（Sartorius公司）；HH-8S數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市盛藍(lán)儀器制造有限公司）；DELTA 320 pH計(jì)（瑞士METTLER TOLEDO公司）；XW-80A旋渦混合儀（上海滬西分析儀器廠）。

血必凈注射液（天津紅日藥業(yè)股份有效公司，規(guī)格：每支10 mL，批號(hào)1205301）；Sen I對(duì)照品（南京拓海生物科技有限公司，純度≥98%）；高效液相色譜法（HPLC）分析用甲醇為色譜純（Sigma公司），娃哈哈純凈水，氫氧化鈉、磷酸、甲酸均為分析純。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18 （4.6 mm×150 mm，5 mm）；流動(dòng)相：甲醇（A）-0.3%甲酸水（B），梯度洗脫，見表1；流速：1 mL/min；柱溫：35℃；檢測(cè)波長：λ=280 nm；進(jìn)樣量：10 μL。其色譜圖見圖2。

表1　梯度洗脫條件

圖2　Sen I對(duì)照品（a）和血必凈注射液（b）的HPLC色譜圖

2.2方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.1線性關(guān)系考察精確稱取10.82 mg Sen I于10 mL棕色量瓶中，以純水定容，配制成濃度為1.082 g/L的Sen I儲(chǔ)備液。精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，制得濃度分別為0.36、1.8、3.6、7.2、9.1、14.5、18.1 mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件，將上述7份對(duì)照品溶液分別進(jìn)樣10 μL，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，濃度（X，mg/L）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：Y?=4.246×104X-1 532，r=0.999 9。結(jié)果表明，Sen I在質(zhì)量濃度為0.36～18.1 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.2精密度取“2.2.1”項(xiàng)下濃度為7.2 mg/L的對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計(jì)算得RSD值為1.2%。表明儀器及進(jìn)樣精密度良好。

2.2.3重復(fù)性取Sen I對(duì)照品儲(chǔ)備液6份，分別用去離子水稀釋至7.2 mg/L，進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果Sen I含量RSD為1.6%，表明方法重復(fù)性良好。

2.2.4加樣回收率實(shí)驗(yàn)精密量取SenI儲(chǔ)備液30μL 和500 μL血必凈注射液（已知其中Sen I含量為60.7 mg/L）于5 mL棕色容量瓶中，渦旋混勻，以純水定容至刻度。平行配制6份，分別取上述溶液10 μL進(jìn)行HPLC測(cè)定，記錄峰面積，通過外標(biāo)法計(jì)算含量，得平均加樣回收率為99.22%，RSD為1.7%，見表2。

表2　加樣回收率實(shí)驗(yàn)（n=6）

2.3Sen I水溶液在不同環(huán)境下的穩(wěn)定性研究

2.3.1不同pH的緩沖液及Sen I儲(chǔ)備液的配制用適量濃鹽酸、磷酸鈉、氫氧化鈉溶液配制pH 1～13的一系列緩沖液。另外，將10 mL棕色容量瓶高溫高壓滅菌后，精確稱取10.82 mg Sen I于容量瓶中，以甲醇定容，配制成濃度為1.082g/L的SenI儲(chǔ)備液。

2.3.2Sen I在不同pH下的穩(wěn)定性研究取Sen I儲(chǔ)備液50 μL，置于經(jīng)高溫高壓滅菌5 mL的棕色容量瓶中，用一系列緩沖溶液分別定容至刻度，渦旋混勻，得到Sen I在不同pH條件下的樣品溶液，分別用HPLC測(cè)定溶液中Sen I的初始濃度（C0）。將樣品溶液密封并于室溫條件下放置，間隔一定的時(shí)間對(duì)樣品取樣，測(cè)定溶液中Sen I的剩余濃度（Ct）。按照上述方法重復(fù)實(shí)驗(yàn)1次。以Sen I相對(duì)剩余濃度的對(duì)數(shù)［ln（Ct/C0）］與時(shí)間（t）作圖，見圖3。Sen I在中性和酸性條件下穩(wěn)定，在堿性條件下不穩(wěn)定，且隨堿性增強(qiáng)，降解明顯加快。

2.3.3SenI在不同溫度下的穩(wěn)定性研究移取50μL Sen I儲(chǔ)備液置于5 mL滅菌容量瓶中，以超純水定容，混勻，制得樣品溶液，并分別用HPLC測(cè)定溶液中Sen I的C0。將樣品溶液密封，分別置于溫度為65、75、85、95℃的恒溫水浴鍋中，間隔一定的時(shí)間對(duì)樣品取樣，測(cè)定溶液中Sen I的Ct。按照上述方法重復(fù)實(shí)驗(yàn)1次。以Sen I ln（Ct/C0）與t作圖，見圖4。通過對(duì)Sen I在水溶液中在不同溫度下降解得到的擬合曲線方程可知其表觀速率常數(shù)k，并根據(jù)Arrhenius方程lnk=lnA-Ea/RT，可計(jì)算其降解反應(yīng)活化能，結(jié)果見表3。結(jié)果表明，Sen I在水溶液中的降解反應(yīng)速率隨溫度的升高而加快，該反應(yīng)呈現(xiàn)一級(jí)動(dòng)力學(xué)規(guī)律，反應(yīng)的活化能較高，表明Sen I常溫下在中性水溶液中較為穩(wěn)定性。

圖3　不同pH緩沖液中Sen I lnCt/C0與t的關(guān)系圖

圖4　Sen I在不同溫度下lnCt/C0與t的關(guān)系圖

表3　在不同溫度下Sen I降解動(dòng)力學(xué)曲線擬合結(jié)果

2.4Sen I在血必凈注射液中的穩(wěn)定性研究

2.4.1血必凈注射液中的Sen I在不同pH下的穩(wěn)定性研究用適量濃鹽酸、磷酸鈉、氫氧化鈉溶液配制pH1～13的一系列緩沖液。取血必凈注射液1 mL，置于經(jīng)高溫高壓滅菌的5 mL棕色容量瓶中，用一系列緩沖溶液分別定容至刻度，渦旋，得注射液在不同pH條件下的樣品溶液，分別用HPLC測(cè)定溶液中Sen I的C0。將樣品溶液密封并于室溫條件下放置，間隔一定的時(shí)間對(duì)樣品取樣，測(cè)定溶液中Sen I 的Ct。按照上述方法重復(fù)實(shí)驗(yàn)1次。以Sen I ln（Ct/ C0）與t作圖，見圖5，可知注射液中Sen I的降解模型符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)。根據(jù)數(shù)據(jù)可知注射液中Sen I在堿性環(huán)境中不穩(wěn)定，在酸性和中性條件下穩(wěn)定。

圖5　不同pH下Sen I在血必凈注射液中l(wèi)nCt/C0與t的關(guān)系圖

2.4.2血必凈注射液中的Sen I在不同溫度下的穩(wěn)定性研究移取1 mL血必凈注射液于5 mL滅菌容量瓶中，以超純水定容，混勻，制得樣品溶液，并分別用HPLC測(cè)定注射液中Sen I的C0。將樣品溶液密封，分別置于溫度為65、75、85、95℃的恒溫水浴鍋中，間隔一定的時(shí)間對(duì)樣品取樣，測(cè)定溶液中Sen I的Ct。按照上述方法重復(fù)實(shí)驗(yàn)1次。由不同時(shí)間對(duì)Sen I ln（Ct/C0）與t作圖，見圖6。通過對(duì)Sen I在注射液中不同溫度下降解得到的擬合曲線方程可知其表觀速率常數(shù)k，并根據(jù)Arrhenius方程lnk= lnA-Ea/RT，可計(jì)算其反應(yīng)活化能，結(jié)果見表4。結(jié)果表明，Sen I在血必凈注射液中的降解反應(yīng)速率隨溫度的升高而加快，該反應(yīng)呈現(xiàn)一級(jí)動(dòng)力學(xué)規(guī)律，反應(yīng)的活化能較高，表明Sen I在血必凈注射液中較為穩(wěn)定性。

2.5各pH條件下的半衰期和有效期預(yù)測(cè)Sen I分別在水溶液和血必凈注射液中不同pH下降解，測(cè)得兩種介質(zhì)中Sen I的相對(duì)剩余含量，根據(jù)一級(jí)反應(yīng)速率方程ln（C0/Ct）=kt，計(jì)算降解速率常數(shù)k、有效期t0.9和半衰期t0.5，見表5。Sen I在不同溶液中降解速率常數(shù)（lnk）對(duì)pH作圖，見圖7。結(jié)果表明，Sen I在水溶液和血必凈注射液中的降解趨勢(shì)一致，在注射液中的穩(wěn)定性稍高于水溶液中。

圖6　在不同溫度下Sen I在血必凈注射液中l(wèi)n（Ct/C0）與t關(guān)系圖

表4　在不同溫度下注射液中Sen I降解動(dòng)力學(xué)曲線擬合結(jié)果

表5　在不同pH溶液中Sen I實(shí)驗(yàn)結(jié)果的比較

圖7　在不同溶液中Sen I的lnk比較

2.6各溫度下半衰期及有效期預(yù)測(cè)Sen I分別在水溶液和血必凈注射液中不同溫度（65、75、85、95℃）下降解，測(cè)得兩種介質(zhì)中Sen I的相對(duì)剩余含量相比較，根據(jù)公式t0.5=ln2/k和t0.9=0.105 4/k預(yù)測(cè)有效期t0.9和半衰期t0.5，見表6。結(jié)果表明，Sen I在水溶液和血必凈注射液中的降解趨勢(shì)一致，在注射液中的穩(wěn)定性高于水溶液中。

表6　在不同溫度下Sen I實(shí)驗(yàn)結(jié)果的比較

3　結(jié)論與討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在堿性和高溫條件下，Sen I的降解屬于一級(jí)動(dòng)力學(xué)反應(yīng)。通過對(duì)比Sen I在水溶液和血必凈注射液中的降解速度可知，兩者降解趨勢(shì)大體一致，但Sen I在血必凈注射液中比在水溶液中穩(wěn)定性大大提高，即制劑水平下Sen I較穩(wěn)定。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示Sen I的提取、使用、貯存應(yīng)避免堿性環(huán)境，為相關(guān)制劑研究和質(zhì)量控制提供了依據(jù)。

在pH1～13一系列的緩沖溶液體系下，Sen I在酸性環(huán)境中比較穩(wěn)定，幾乎未發(fā)生降解。另外，為準(zhǔn)確表征其降解速率變化較快的區(qū)間，水溶液實(shí)驗(yàn)中在降解速度變化較大的pH區(qū)間（pH 9～11）進(jìn)一步縮小pH間隔以更精確的描繪降解速率隨pH變化的趨勢(shì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在注射液和水溶液中，lnk 對(duì)pH進(jìn)行回歸分析（圖7），基本呈線性。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以用來粗略計(jì)算在不同pH條件下Sen I的降解速率常數(shù)，預(yù)測(cè)剩余含量。

Sen I為內(nèi)酯型結(jié)構(gòu)，其中含有不飽和共軛雙鍵。內(nèi)酯在堿催化下較易發(fā)生水解開環(huán)反應(yīng)；雙鍵易發(fā)生氧化、異構(gòu)化等反應(yīng)。在對(duì)其降解的樣品進(jìn)行梯度洗脫，發(fā)現(xiàn)其中有幾種新物質(zhì)出現(xiàn)，初步判定其為Sen I的降解產(chǎn)物。其降解產(chǎn)物及降解機(jī)制需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)確定。

波長及流動(dòng)相選擇：考慮分析時(shí)間及分離效果等因素，采用甲醇-甲酸水為流動(dòng)相，由于注射劑成分較復(fù)雜，采用梯度洗脫，排除其他成分干擾。Sen I的最大吸收波長為280 nm，在此波長下，Sen I響應(yīng)值較高，而且在該色譜條件下，其他成分不干擾Sen I測(cè)定，故選擇280 nm為測(cè)定波長。

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Degradation kinetics of Senkyunolide I in Xuebijing injection

GAO Jie，PU Wei-ling，REN Xiao-liang，REN De-fei，SUN Li-li，QI Ai-di
（College of Traditional Chinese Medicine，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

［Objective］To study the degradation kinetic characteristics of Senkyunolide I（Sen I）in Xuebijing injection and aqueous solution under different pH buffer and temperatures.［Methods］HPLC method was established to study the effect on the Senkyunolide I under different pHs and temperatures（65，75，85，95℃）.Based on the chemical reaction kinetics and Arrhenius equation，the model of degradation of Sen I and the parameters of degradation kinetics were confirmed.［Results］The results indicated that the degradation of Sen I in aqueous solution and Xuebijing injection conforms to the first-order degradation kinetic.In the injection and aqueous solution，respectively，the energy of activation（Ea）was 177.94 kJ/mol and 194.86 kJ/mol.［Conclusion］Sen I is unstable in alkaline solution and high temperature in both aqueous and Xuebijing injection.Under the same condition，Sen I in Xuebijing injection was more stable than that in aqueous solution.

Senkyunolide I；Xuebijing injection；pH；temperature；degradation kinetics

R285.5

A

1673-9043（2015）03-0160-05

10.11656/j.issn.1673-9043.2015.03.09

教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金（2011 1210110010）。

高杰（1986-），男，碩士研究生，主要從事中藥注射液成分分析及安全性方面的研究。

任曉亮，E-mail:xiaoliang_ren@sina.com。

（2015-01-15）