張?zhí)N慧（山東中醫(yī)藥大學(xué)，高血壓國(guó)家中醫(yī)臨床研究基地，濟(jì)南250014）

桑仙降壓顆粒對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠心肌VEGF及nm23的干預(yù)*

張?zhí)N慧
（山東中醫(yī)藥大學(xué)，高血壓國(guó)家中醫(yī)臨床研究基地，濟(jì)南250014）

［目的］觀察桑仙降壓顆粒對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）心肌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）及nm23的影響，探討其對(duì)高血壓病心肌血管生長(zhǎng)促進(jìn)因子、抑制因子的干預(yù)作用。［方法］SHR隨機(jī)分為3組，空白對(duì)照組、吲噠帕胺西藥對(duì)照組、桑仙降壓顆粒組，以Wistar大鼠為正常對(duì)照，4周及8周后觀察SHR心肌VEGF及nm23的表達(dá)。［結(jié)果］實(shí)驗(yàn)前正常對(duì)照組與空白對(duì)照組相比VEGF及nm23蛋白光密度值差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)4、8周后相較空白對(duì)照組，桑仙降壓顆粒組VEGF表達(dá)明顯增多而nm23蛋白密度值顯著減少。［結(jié)論］桑仙降壓顆粒能增強(qiáng)VEGF的表達(dá)及降低nm23的蛋白密度值。

自發(fā)性高血壓大鼠；桑仙降壓顆粒；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；nm23

高血壓是最常見(jiàn)的慢性病，也是心腦血管病最主要的危險(xiǎn)因素之一，近年來(lái)，國(guó)家日益重視高血壓的防治研究工作［1］。本研究以自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）為動(dòng)物模型，通過(guò)對(duì)SHR心肌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）及nm23的干預(yù)，以觀測(cè)桑仙降壓顆粒對(duì)高血壓心肌血管生長(zhǎng)促進(jìn)因子、抑制因子的作用，以期為其能否對(duì)血管生長(zhǎng)起到有益作用進(jìn)行嘗試。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物與分組4周齡Wistar大鼠，18只，雌雄各半，體質(zhì)量210～250 g，由山東醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物室提供［動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（魯）20090001］。4周齡SHR，42只，雌雄各半，體質(zhì)量200～240 g，由中國(guó)醫(yī)科院阜外心血管醫(yī)院提供（醫(yī)動(dòng)字第01-108號(hào)）。以A標(biāo)示正常對(duì)照組即Wistar大鼠組；SHR隨機(jī)分為B、C、D組，B：SHR給予蒸餾水為空白對(duì)照組，C：SHR給予桑仙降壓顆粒為實(shí)驗(yàn)組，D：SHR給予吲噠帕胺為西藥對(duì)照組；觀測(cè)時(shí)相點(diǎn)：0組的觀測(cè)時(shí)間為Wistar大鼠、SHR4周齡；1、2的觀測(cè)時(shí)間為Wistar大鼠、SHR給藥后4周、8周。在3個(gè)觀測(cè)時(shí)間點(diǎn)分別觀測(cè)，隨機(jī)分組為A0、B0；A1、B1、C1、D1；A2、B2、C2、D2。每組6只。

1.2藥物桑仙降壓顆粒組方有桑寄生、淫羊藿、丹參、川芎等，由山東中醫(yī)藥大學(xué)中藥制劑室按正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)選工藝制成，每克含生藥6 g，臨用前加蒸餾水稀釋成含生藥0.8 g/mL的藥液。吲噠帕胺片每粒2.5 mg，由天津力生制藥股份有限公司提供，實(shí)驗(yàn)前加生理鹽水適量，制備成濃度0.025 g/L混懸液，置4℃冰箱保存?zhèn)溆茫褂们罢袷?，充分搖勻。

1.3試劑Anti-Nm23-H1為北京博奧森生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；VEGF免疫組化染色試劑盒、生物素化山羊抗兔IgG，鏈霉親和素2生物素（SABC）和DAB顯色劑，均由武漢博士德生物工程有限公司提供。

1.4實(shí)驗(yàn)儀器METTLER AE20型電子分析天平，海特勒托利多（上海）儀器有限公司提供；康樂(lè)電熱恒溫水浴槽，上海醫(yī)療器件七廠提供；光學(xué)顯微鏡，由山東省中醫(yī)院病理科提供。

2　方法及檢測(cè)

2.1制備用戊巴比妥鈉（40 mg/kg）體質(zhì)量腹腔注射，麻醉后立即經(jīng)腹主動(dòng)脈注入4℃生理鹽水，切開下腔靜脈放血，待沖洗液干凈無(wú)色后，立即開胸，快速分離、摘取心臟，置入4℃生理鹽水中快速?zèng)_洗3次。

2.2VEGF蛋白含量檢測(cè)采用免疫組化SP法。結(jié)果判斷：參照AXIOTIS等標(biāo)準(zhǔn)［2］，由兩位病理醫(yī)生采用盲法（獨(dú)立檢測(cè)）在高倍鏡（×400）下讀片。每張切片高倍鏡下隨機(jī)選取10個(gè)不重復(fù)的視野（不足10個(gè)視野的，按實(shí)際觀察到的視野計(jì)數(shù)），共紀(jì)錄1 000個(gè)細(xì)胞，綜合染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行判定。1）按切片中細(xì)胞著色深淺評(píng)分：0分為細(xì)胞無(wú)顯色；1分為黃色；2分為棕黃色；3分為棕褐色。2）按陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占同類細(xì)胞數(shù)的百分比評(píng)分：1分為＜25%；2分為≥25%且≤50%；3分為＞50%且≤75%；4分為＞75%。取1）、2）兩項(xiàng)評(píng)分的乘積作為總積分：0～3分為（-）；＞3分且≤6分為（+）；＞6分且≤9分為（++）；＞9分（+++）。染色結(jié)果由兩名病理醫(yī)師采取雙盲法評(píng)定。（-/+）為低表達(dá)，（++/+++）為高表達(dá)。

2.3nm23蛋白的表達(dá)采用免疫組化SP法。每張切片高倍鏡下隨機(jī)選取10個(gè)不重復(fù)的視野（不足10個(gè)視野的，按實(shí)際觀察到的視野計(jì)數(shù)），共紀(jì)錄1 000個(gè)細(xì)胞。其結(jié)果判定同VEGF。

2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法數(shù)據(jù)采用SPSS18.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較若方差齊采用LSD法，兩兩比較若方差不齊采用Dunnett’s T3法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3　實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1VEGF蛋白含量檢測(cè)實(shí)驗(yàn)前，空白對(duì)照組VEGF蛋白光密度值與正常對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。實(shí)驗(yàn)4周，與正常對(duì)照組相比，空白對(duì)照組VEGF蛋白光密度值降低（P＜0.05）；與空白對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組與西藥對(duì)照組VEGF蛋白光密度值均有顯著升高（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)8周，空白對(duì)照組大鼠VEGF蛋白光密度值明顯降低，與正常對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與空白對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組與西藥對(duì)照組VEGF蛋白光密度值均非常顯著升高（P＜0.01）；實(shí)驗(yàn)組與西藥對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見(jiàn)表1、表2、圖1。

3.2nm23蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn)前，空白對(duì)照組大鼠nm23蛋白光密度值與正常對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。實(shí)驗(yàn)4周，空白對(duì)照組大鼠nm23蛋白光密度值升高，與正常對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與空白對(duì)照組比較，西藥對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組nm23蛋白光密度值均有降低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。實(shí)驗(yàn)8周，空白對(duì)照組大鼠nm23蛋白光密度值明顯升高，與正常對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與空白對(duì)照組比較，西藥對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組nm23蛋白光密度值均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；西藥對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)意義（P＞0.05）。結(jié)果見(jiàn)圖2、表3、表4。

表1　實(shí)驗(yàn)前正常對(duì)照組和空白對(duì)照組VEGF蛋白光密度值積分比較分

表1　實(shí)驗(yàn)前正常對(duì)照組和空白對(duì)照組VEGF蛋白光密度值積分比較分

注：與正常對(duì)照組比較，*P＞0.05。

組別正常對(duì)照組空白對(duì)照組n 6 6 VEGF蛋白光密度表達(dá)積分7.25±0.55* 7.18±0.48*

表2　實(shí)驗(yàn)4周、8周后各組VEGF蛋白光密度值積分比較（分

表2　實(shí)驗(yàn)4周、8周后各組VEGF蛋白光密度值積分比較（分

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與空白對(duì)照組相比，△△P＜0.01，△P＜0.05；與西藥對(duì)照組相比#P＞0.05。

組別正常對(duì)照組空白對(duì)照組西藥對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組n 6 6 6 6實(shí)驗(yàn)4周后7.19±0.49 5.11±0.33* 6.15±0.29△6.11±0.51△實(shí)驗(yàn)8周后6.33±0.34 3.29±0.65** 4.32±0.45△△5.57±0.38△△#

圖1　VEGF蛋白表達(dá)（免疫組化染色×400）

4　討論

微血管損害存在于各期高血壓［3］，在高血壓及心、腦、腎靶器官病變的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸中發(fā)揮重要作用。因此，改善微血管損害應(yīng)成為防治高血壓的有效措施［4］。促進(jìn)血管新生是改善微血管損害的有效途徑，血管新生是指原有微血管內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)過(guò)生芽、遷移、增殖與基質(zhì)重塑等形成新毛細(xì)血管的過(guò)程［5-7］。血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖是血管新生發(fā)生最基本和最重要的環(huán)節(jié)，內(nèi)皮細(xì)胞的遷移是血管生成的重要步驟［8-11］。VEGF是誘導(dǎo)微血管形成作用最強(qiáng)、特異性最高的血管生長(zhǎng)因子［12］，能特異性地直接作用血管內(nèi)皮細(xì)胞，引起血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)血管形成，其作為血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性有絲分裂刺激因子，與Flt/Flk兩個(gè)受體之間發(fā)生高度親和作用，在它們發(fā)生結(jié)合以后便表現(xiàn)出強(qiáng)大的刺激血管新生的作用，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、分化與遷徙，促進(jìn)微血管形成。VEGF是目前唯一被證明對(duì)血管生成嚴(yán)格特異性的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，它在血管形成的起始、發(fā)展以及成熟過(guò)程中起到積極作用，是一種血管生成標(biāo)志物［13-17］。

nm23基因是1988年美國(guó)Steeg等［18］用消減雜交分離的方法從小鼠黑色素瘤K-1735細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)并分離出的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因。隨著進(jìn)一步研究，發(fā)現(xiàn)nm23表達(dá)與VFGF表達(dá)明顯呈負(fù)相關(guān)，nm23低表達(dá)可能促進(jìn)VFGF高表達(dá)，導(dǎo)致腫瘤血管生成［19］。由于nm23與VFGF在促進(jìn)微血管生成方面具有協(xié)同作用，因此將nm23表達(dá)作為抑制因子引入到對(duì)心肌血管生長(zhǎng)的觀測(cè)中。

圖2　nm23蛋白表達(dá)（免疫組化染色×400）

表3　實(shí)驗(yàn)前正常對(duì)照組和空白對(duì)照組nm23蛋白光密度值積分比較分

表3　實(shí)驗(yàn)前正常對(duì)照組和空白對(duì)照組nm23蛋白光密度值積分比較分

注：與正常對(duì)照組比較，*P＞0.05。

組別正常對(duì)照組空白對(duì)照組n 6 6 nm23蛋白光密度表達(dá)積分4.02±0.81* 4.45±1.01*

表4　實(shí)驗(yàn)4周、8周各組nm23蛋白光密度值積分比較分

表4　實(shí)驗(yàn)4周、8周各組nm23蛋白光密度值積分比較分

注：與正常對(duì)照組比較，**P＜0.01；與空白對(duì)照組相比，△△P＜0.01；與西藥對(duì)照組相比，#P＞0.05。

組別正常對(duì)照組空白對(duì)照組西藥對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組n 6 6 6 6實(shí)驗(yàn)4周后3.82±0.54 6.87±0.65** 3.67±0.44△△3.71±1.13△△實(shí)驗(yàn)8周后3.95±0.38 7.01±1.32** 4.85±0.58△△4.69±0.70△△#

研究表明桑仙降壓顆粒增加SHR心肌微血管密度，具有保護(hù)微血管的作用［20］。本研究以VEGF及nm23為觀測(cè)點(diǎn)，結(jié)果表明：實(shí)驗(yàn)4周、8周后，與正常對(duì)照組相比，空白對(duì)照組VEGF蛋白密度值降低，而nm23蛋白密度值升高；但與空白對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組與西藥對(duì)照組VEGF蛋白光密度值均明顯增加，nm23蛋白表達(dá)卻明顯降低，從而提示桑仙降壓顆粒能有效增加血管生長(zhǎng)促進(jìn)因子表達(dá)、降低抑制因子表達(dá)，可能對(duì)減少高血壓引起的微血管損害起到有益作用，其是否還可通過(guò)影響其他血管生成促進(jìn)因子、抑制因子進(jìn)而減輕高血壓及其靶器官微血管損害有待進(jìn)一步研究。

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Intervention of Sangxian Jiangya granule on VEGF and NM23 of spontaneously hypertensive rats

ZHANG Yun-hui
（Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250014，China）

［Objective］To observe effect of Sangxian Jiangya granule on myocardial vascular endothelial growth factor（VEGF）and nm23，and to discuss the intervention of Sangxian Jiangya granule on the growth and inhibition factor of vascular endothelial cell.［Methods］Spontaneously hypertensive rats were randomly divided into 3 groups: control group，indapamide control group of Western medicine，Sangxian Jiangya group，using Wistar rats as normal control group.After 4 and 8 weeks，myocardial VEGF expression of nm23 was observed.［Results］Compared with the blank control group，in Sangxian Jiangya group the VEGF protein density was markedly increased and nm23 protein density was significantly decreased.［Conclusion］SangxianJiangya granulecould enhanceVEGFexpression and decrease nm23 protein density value.

spontaneously hypertensive rats；Sangxian Jiangya granule；VEGF；nm23

R285.5

A

1673-9043（2015）03-0152-04

10.11656/j.issn.1673-9043.2015.03.07

山東省中青年科學(xué)家基金課題（2006 BS03047）；山東省自然基金課題（30873241）；泰山學(xué)者資金資助項(xiàng)目。

張?zhí)N慧（1972-），副教授，碩士研究生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹嗅t(yī)藥治療心血管疾病的臨床與實(shí)驗(yàn)研究。

（2015-02-01）