黃文斯 王穎 朱海濤 吳熒熒 謝曉東 王冬青

原發(fā)性支氣管肺癌分小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC）和非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC），其中SCLC占20%左右。在腫瘤中肺癌的發(fā)病率和病死率最高，且其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)居高不下[1]。腫瘤的發(fā)生發(fā)展不僅與細(xì)胞增殖失控有關(guān)，還與細(xì)胞凋亡受阻相關(guān)，即增殖凋亡失衡的結(jié)果，其決定了腫瘤的生長速率，放療和化療可引起細(xì)胞壞死，一般的激素制劑、抗癌藥物等是通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制，從而達(dá)到治療的目的?？梢姷蛲霾粌H在正常機(jī)體的正常發(fā)育、分化及死亡中產(chǎn)生重要影響，而且在腫瘤治療方面也發(fā)揮重要作用，深受重視[2,3]。多種中草藥中，有些藥已證明對腫瘤細(xì)胞有抑制作用。我國是個天然的藥物大國，中草藥的應(yīng)用歷史悠久，在治療的藥物中，抗腫瘤中成藥的不良反應(yīng)較小，因此抗腫瘤中成藥成為了人們關(guān)注的治療方法[4]。澳洲茄堿提取于中藥龍葵，龍葵還包括龍葵堿（solanine）、澳洲茄邊堿（solamargine,SM），其為茄科草本植物，富含多種甾體生物堿，而生物堿類化合物多能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，腫瘤細(xì)胞凋亡通路的受阻與腫瘤的發(fā)生發(fā)展緊密相關(guān)[5,6]。澳洲茄堿作用于肺癌的報道尚少，本研究旨在探討澳洲茄堿對肺癌H446細(xì)胞凋亡的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 澳洲茄堿（純度＞98%）為上海億林生物科技有限公司產(chǎn)品，胎牛血清（fetal calf serum,FBS）購于GIBCO公司，CCK8試劑、Annexin V/PI 凋亡試劑盒均購于南京諾維贊生物技術(shù)有限公司，β-actin、CASP3、BAX、BCL2及辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔、羊抗鼠二抗則購于武漢博士德生物工程有限公司，分子凈化工作臺（蘇州生化凈化設(shè)備廠），CO2培養(yǎng)箱及酶標(biāo)儀（Thermo公司），顯微鏡（Olympus 公司），流式細(xì)胞儀（Becton Dickinson公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人肺癌H446細(xì)胞以10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(含青、鏈霉素各100 U/mL) ，于37 ℃和5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞單層貼壁狀態(tài)，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 CCK8試劑檢測細(xì)胞活性 收集呈對數(shù)生長的H446細(xì)胞，制成濃度為2.5×104/mL的單細(xì)胞懸液，接種于96孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)為5×103個。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，棄原培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組每孔加入200 μL澳洲茄堿，濃度分別為0 μmol/L、3.4 μmol/L、6.8 μmol/L、13.6 μmol/L、27.2 μmol/L，只加培養(yǎng)基無細(xì)胞孔作空白對照組，每組設(shè)置5個復(fù)孔。將4塊96孔板置于培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)3 h、6 h、12 h、24 h，棄原培養(yǎng)液，PBS洗一遍后，每孔中加入100 μL的CCK8與無血清培養(yǎng)基的混合液（比例1:10），于37 ℃避光孵育1 h，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上以450 nm波長測定各孔吸光度（optical density, OD）值，記錄并計算存活率及抑制率。

1.4 倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及DAPI核染后核變化H446細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板中，每孔1×105個，0 μmol/L、3.4 μmol/L、6.8 μmol/L、13.6 μmol/L的澳洲茄堿作用24 h后，用PBS清洗兩遍，4%多聚甲醛固定15 min，用0.1%triton-X 100處理5 min后每孔加入濃度為1 μg/mL的DAPI染液，常溫避光孵育10 min，后用PBS清洗3遍后，于倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核的變化。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 將H446細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于6孔板中，每孔1×106，貼壁后與濃度為0 μmol/L、3.4 μmol/L、6.8 μmol/L、13.6μmol/L的澳洲茄堿共培養(yǎng)24 h。消化后離心5 min、1,000 rpm，用預(yù)冷的PBS洗滌2遍，重懸細(xì)胞于100 μL的Annexin V結(jié)合緩沖液中，向每孔緩沖液中加入5 Ml Annexin V和 5 Ml PI，將細(xì)胞放置室溫下15 min，后向每孔中再加入400 μL的緩沖液，輕輕混勻，1 h內(nèi)上機(jī)，記錄并分析結(jié)果。

1.6 蛋白免疫印跡（Western blot）法檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá) 以不同濃度（0 μmol/L、3.4 μmol/L、6.8 μmol/L、13.6 μmol/L）的澳洲茄堿處理H446細(xì)胞，24 h后收集，加入細(xì)胞裂解液（內(nèi)含蛋白酶抑制劑和PMSF），震蕩離心，取上清測總蛋白量，100 ℃煮沸10 min后置于-20 ℃保存。每組取蛋白樣品40 μg，于10%SDS-PAGE進(jìn)行電泳，電泳后將凝膠的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，將膜置于5%的脫脂奶粉中，常溫下進(jìn)行封閉處理1 h，孵育1:500稀釋的抗體BCL2、BAX和CASP3，4 ℃過夜。膜經(jīng)TBST（150 mmol/L NaCl, 10 mmol/L Tris, 0.1%Tween-20, pH7.6）洗滌3次，每次10 min，加入相應(yīng)辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1:2,000）常溫孵育1 h，再次經(jīng)TBST洗滌3遍，每次5 min，用ECL化學(xué)發(fā)光液進(jìn)行曝光[7]。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 統(tǒng)計數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示。多樣本比較使用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 澳洲茄堿抑制H446的增殖 通過CCK8實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)分析，濃度3.4 μmol/L、6.8 μmol/L、13.6 μmol/L、27.2 μmol/L加藥組24 h細(xì)胞存活率分別為85.64%、64.68%、20.96%、16.77%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）（圖1），經(jīng)過簡單計數(shù)，對照組與濃度3.4 μmol/L、6.8 μmol/L、13.6 μmol/L、27.2 μmol/L加藥組的細(xì)胞個數(shù)分別為5,000個/孔、4,326個/孔、3,328個/孔、1,248個/孔和998個/孔，與CCK8所得結(jié)果相近。

2.2 澳洲茄堿誘導(dǎo)H446細(xì)胞凋亡 倒置顯微鏡觀察，濃度為0 μmol/L、3.4 μmol/L、6.8 μmol/L、13.6 μmol/L的澳洲茄堿作用于H446細(xì)胞24 h后，對照組細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞核完整，而加藥組細(xì)胞體積變小，核皺縮，輪廓不規(guī)整。DAPI染核后通過熒光顯微鏡觀察，藥物濃度越大，核變化越大，以13.6 μmol/L組變化最明顯，細(xì)胞核固縮，邊集（圖2）。流式細(xì)胞分析儀檢測的結(jié)果，0 μmol/L、3.4 μmol/L、6.8 μmol/L、13.6 μmol/L的澳洲茄堿作用24 h后可出現(xiàn)細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，流式細(xì)胞術(shù)檢測的凋亡率與正常對照組相比明顯增高，以濃度為13.6 μmol/L的作用尤為明顯（P＜0.001）（圖3）。

2.3 澳洲茄堿影響凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá) 通過Western blot法可觀察到，隨著藥物濃度的增加，凋亡相關(guān)蛋白BAX、CASP3表達(dá)量增加，而凋亡抑制基因蛋白BCL2表達(dá)量減少，均以濃度為13.6 μmol/L的藥物作用明顯（P＜0.001）（圖4）。

圖1 CCK8檢測澳洲茄堿對H446細(xì)胞的增殖作用。分別用濃度為0 μmol/L、3.4 μmol/L、6.8 μmol/L、13.6 μmol/L、27.2 μmol/L的澳洲茄堿作用于H446細(xì)胞，于3 h、6 h、12 h、24 h用CCK8試劑檢測。單因素方差分析，3 h、6 h、12 h、24 h的不同濃度與對應(yīng)的對照組比較均有統(tǒng)計學(xué)意義，***：P≤0.001。Fig1 Detect proliferation of H446 by CCK8. With concentration of 0 μmol/L, 3.4 μmol/L, 6.8 μmol/L, 13.6 μmol/L, 27.2 μmol/L of solanine, CCK8 detected the proliferation of H446 cells in 3 h, 6 h,12 h and 24 h. It had statistical significance compared with the corresponding controls in 3 h, 6 h, 12 h and 24 h analyzed with one-way analysis of variance, ***: P≤0.001.

圖2 澳洲茄堿作用于H446細(xì)胞后細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化（×100）。濃度為0 μmol/L、3.4 μmol/L、6.8 μmol/L、13.6 μmol/L的澳洲茄堿作用于H446細(xì)胞24 h后對細(xì)胞形態(tài)的觀察及DAPI染色后觀察細(xì)胞核的變化。Fig2 Change of cell morphology in H446 cells by solanine (×100). Incubated with 0 μmol/L, 3.4 μmol/L, 6.8 μmol/L, 13.6 μmol/L solasonine for 24 h, then detected the changes of H446 cells’ morphology and nucleus staining by DAPI.

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測澳洲茄堿作用于H446細(xì)胞后的凋亡率。A：濃度為0 μmol/L、3.4 μmol/L、6.8 μmol/L、13.6 μmol/L的澳洲茄堿作用于H446細(xì)胞24 h后流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率；B：細(xì)胞凋亡結(jié)果單因素方差分析，結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義。***：P＜0.001。Fig3 Detection of apoptosis rate of H446 cells incubated with solanine by flow cytometry. A: H446 cells was incubated with 0 μmol/L, 3.4 μmol/L, 6.8 μmol/L, 13.6 μmol/L of solanine for 24 h, apoptosis rate was detected by flow cytometry; B: The results analyzed by Oneway analysis of variance showed that it had statistical significance. ***: P＜0.001.

圖4 Western blot檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的變化。A：用濃度為0 μmol/L、3.4 μmol/L、6.8 μmol/L、13.6 μmol/L的澳洲茄堿作用于H446細(xì)胞24 h后檢測細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白BCL2、BAX和CASP3表達(dá)量的變化；B、C和D：BCL2,BAX和CASP3蛋白Western blot灰度單因素方差分析表明，結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義。*：P＜0.05；***：P＜0.001。Fig4 Changes of apoptosis-related proteins detected by Western blot.A: After incubated with 0 μmol/L,3.4 μmol/L, 6.8 μmol/L, 13.6 μmol/L of solanine, western blot was used to detect the changes of apoptosis-related proteins BCL-2,BAX and CASP3 in H446 cells; B,C and D: The one-way analysis of variance results showed that it had statistical significance. *: P＜0.05;***: P＜0.001.

3 討論

澳洲茄堿提取于龍葵，有文獻(xiàn)[8,9]報道龍葵可抑制細(xì)胞突變，在腫瘤生長及增殖方面也有抑制作用，其可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，并可抑制腫瘤轉(zhuǎn)移，恢復(fù)細(xì)胞正常生理活動，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫的同時具有細(xì)胞毒性作用。肺癌用中醫(yī)解釋，則為體內(nèi)正氣不足而邪毒外侵，所致氣血瘀滯，內(nèi)聚濁痰，故出現(xiàn)咳嗽咳痰、胸痛咯血等癥狀。龍葵恰好具有清熱解毒、活血消腫的功效[10]，而澳洲茄堿作為龍葵的主要成分之一，也許可成為一個治療肺癌的新方向。

腫瘤的發(fā)生和發(fā)展與腫瘤細(xì)胞的增殖凋亡失衡密切相關(guān)。在細(xì)胞的生理活動中，增殖與凋亡處于平衡狀態(tài)，而凋亡是細(xì)胞死亡的主要調(diào)控程序[11]，人體中突變細(xì)胞的異常增殖、細(xì)胞凋亡的異常調(diào)節(jié)可促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。

本研究通過CCK8實(shí)驗(yàn)篩選出澳洲茄堿對H446細(xì)胞增殖抑制作用濃度及合適時間。實(shí)驗(yàn)得出澳洲茄堿對H446細(xì)胞的增殖抑制作用具有明顯的濃度依賴性，而濃度為13.6 μmol/L與27.2 μmol/L作用相近，故在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇0 μmol/L、3.4 μmol/L、6.8 μmol/L、13.6 μmol/L四個濃度。而實(shí)驗(yàn)篩選出的作用時間，不具有明顯的時間依賴性，但以24 h作用抑制增殖效果最強(qiáng)，故選用24 h作為實(shí)驗(yàn)的最佳時間。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，澳洲茄堿可降低H446細(xì)胞的存活率，減少其增殖，從而進(jìn)一步對H446細(xì)胞凋亡產(chǎn)生作用。

澳洲茄堿對肺癌細(xì)胞H446凋亡的影響，通過對細(xì)胞形態(tài)學(xué)的觀察、流式細(xì)胞術(shù)及凋亡相關(guān)蛋白（BCL2、BAX、CASP3）表達(dá)情況闡述其作用機(jī)制。

細(xì)胞形態(tài)學(xué)結(jié)果表明，澳洲茄堿作用于H446細(xì)胞后，細(xì)胞出現(xiàn)皺縮，細(xì)胞核固縮、邊集、凋亡小體形成等細(xì)胞凋亡的表現(xiàn)，以藥物濃度為13.6 μmol/L最明顯，而對照組未見明顯細(xì)胞形態(tài)變化；流式細(xì)胞術(shù)AnnexinVFITC標(biāo)記法對細(xì)胞凋亡比例的測定結(jié)果顯示，澳洲茄堿可促進(jìn)H446細(xì)胞的凋亡，并呈明顯的濃度依賴，細(xì)胞早晚期凋亡率均升高。對凋亡相關(guān)蛋白（BCL2、BAX、CASP3）而言，BCL2家族是細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵因素，其中BCL2是抑制凋亡基因的代表，而BAX是促進(jìn)凋亡的基因，二者在腫瘤細(xì)胞凋亡程序中具有重要調(diào)控作用[12,13]；CASP家族在細(xì)胞凋亡機(jī)制中占中心地位，其中CASP3是最重要的凋亡執(zhí)行者，它活化后標(biāo)志了細(xì)胞進(jìn)入不可逆的凋亡階段[14,15]。本研究通過將澳洲茄堿作用于H446細(xì)胞后，應(yīng)用Western blot實(shí)驗(yàn)得出抑制凋亡的基因代表BCL2表達(dá)下調(diào)，而CASP3表達(dá)上調(diào)，從而說明細(xì)胞處于凋亡不可逆狀態(tài)，而BAX促凋亡基因編碼的BAX蛋白增加進(jìn)一步說明細(xì)胞走向凋亡。

綜上所述，澳洲茄堿通過抑制H446細(xì)胞增殖，增加H446細(xì)胞的凋亡率，激活促凋亡基因，從而進(jìn)一步上調(diào)促凋亡基因蛋白的表達(dá)并下調(diào)抑凋亡蛋白的表達(dá)，這可能是澳洲茄堿誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞H446的凋亡機(jī)制。通過本研究及其他報道的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，澳洲茄堿在臨床腫瘤的治療上可能有潛在的發(fā)展，值得進(jìn)一步研究。