魏慧君 房念珍 郭麗麗 吳志浩 周清華

肺癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示2012年全球肺癌死亡病例約為100萬(wàn)人。非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）是肺癌的主要類型，約占原發(fā)性肺癌的80%，其中大約20%的NSCLC適合手術(shù)治療，剩余80%只能接受傳統(tǒng)的放化療[1]。近10年來(lái)，NSCLC總的5年存活率僅有15.8%[1]，其復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是治療失敗和患者死亡的主要原因。因此，早期診斷這種疾病是使患者可以長(zhǎng)期生存的關(guān)鍵所在。

現(xiàn)有一系列基于分子生物學(xué)的方法檢測(cè)到在肺癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，一些腫瘤相關(guān)基因發(fā)生了異常改變并可以在腫瘤發(fā)展的早期階段檢測(cè)到，其中相關(guān)基因啟動(dòng)子區(qū)域的異常甲基化被檢測(cè)到出現(xiàn)在包括NSCLC在內(nèi)的多種惡性腫瘤中，并且早于癌癥惡性表型出現(xiàn)，可以視為一種早期診斷標(biāo)志?；蚣谆降漠惓８淖円炎C實(shí)是影響基因活性的重要機(jī)制之一，可發(fā)生在許多腫瘤的早期發(fā)生階段[2]。在針對(duì)NSCLC患者的研究中，收集相關(guān)組織、血液、痰液等進(jìn)行檢測(cè)，普遍發(fā)現(xiàn)相關(guān)抑癌基因（如RASSF1A、MGMT、APC、E-cadherin、P16等）啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化發(fā)生異常，表明了相關(guān)抑癌基因啟動(dòng)子的異常甲基化有可能作為肺癌早期診斷的標(biāo)志。

近年來(lái)，已有多篇研究就抑癌基因甲基化與NSCLC發(fā)生的關(guān)系之間做了深入探討，但是有關(guān)抑癌基因甲基化率的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)波動(dòng)范圍較大，可能是由樣本大小、統(tǒng)計(jì)方法的差異等原因造成的，為得出相對(duì)準(zhǔn)確的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，本研究以抑癌基因RAS相關(guān)區(qū)域家族1A（Ras association domain family 1A, RASSF1A）為例，全面搜集了有關(guān)RASSF1A基因甲基化和NSCLC之間關(guān)系的臨床研究，利用meta分析探討RASSF1A基因啟動(dòng)子甲基化與NSCLC的相關(guān)性，為臨床的早期診斷提供參考。

1 材料與方法

1.1 資料來(lái)源 檢索中英文數(shù)據(jù)庫(kù)，包括Medline、EMBASE、CNKI和萬(wàn)方，收集公開(kāi)發(fā)表的關(guān)于RASSF1A基因啟動(dòng)子甲基化與NSCLC關(guān)系的臨床研究。檢索語(yǔ)種為英語(yǔ)和漢語(yǔ)，分別以“RASSF1A”、“methylation”、“l(fā)ung cancer”、“l(fā)ung carcinoma”、“non-small cell lung carcinoma”為主題詞和自由詞，檢索Medline和EMBASE英文數(shù)據(jù)庫(kù)；以“RASSF1A”基因、“甲基化”、“肺癌”、“非小細(xì)胞肺癌”、“肺腫瘤”為關(guān)鍵詞或題名檢索CNKI和萬(wàn)方等中文數(shù)據(jù)庫(kù)，檢索日期截止為2015年3月，同時(shí)輔以手工檢索收集各種雜志公開(kāi)發(fā)表的學(xué)術(shù)論文，學(xué)位論文和會(huì)議記錄摘要等。

1.2 文獻(xiàn)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn) ①原創(chuàng)論文；②研究對(duì)象為NSCLC患者且不限制病程分期；③檢測(cè)RASSF1A基因啟動(dòng)子僅采用甲基化特異聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（methylation specific PCR,MSP），實(shí)時(shí)MSP（Real Time-MSP, RT-MSP）及定量MSP（Quantitative -MSP, Q-MSP）方法；④研究結(jié)果提供實(shí)驗(yàn)組（癌組織）與對(duì)照組（正常組織、血清、或支氣管灌洗液等）的甲基化；⑤隨機(jī)選擇病例。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn) ①非臨床研究型論文；②樣本量過(guò)少（n＜10）；③論文質(zhì)量較差或者數(shù)據(jù)不清；④不符合納入標(biāo)準(zhǔn)的。如有作者以第一作者，同一單位發(fā)表多篇相關(guān)且內(nèi)容類似的論文，取最新的研究結(jié)果納入。

1.3 文獻(xiàn)質(zhì)量評(píng)價(jià) 根據(jù)“觀察性流行病學(xué)研究報(bào)告規(guī)范（STROBE）-病例-對(duì)照研究”對(duì)所納入的文獻(xiàn)進(jìn)行了量化評(píng)價(jià)。

1.4 數(shù)據(jù)提取 對(duì)于所納入的文獻(xiàn)進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)提取，包括：①第一作者姓名、研究所在地、標(biāo)題、期刊名稱、發(fā)表年份等；②實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中RASSF1A基因啟動(dòng)子甲基化的發(fā)生率。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 采用STATA/SE 11.0（StataCorp LP, hftp://www.stata.com）軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以NSCLC患者癌組織與正常對(duì)照組RASSF1A基因啟動(dòng)子甲基化率的優(yōu)勢(shì)比OR（odds ratio）或者95%置信區(qū)間（CI）作為統(tǒng)計(jì)指標(biāo)。首先用I2進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)異質(zhì)性評(píng)估，如果納入各研究間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)異質(zhì)性（I2＞0.5），則采用隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行分析。如果研究結(jié)果之間無(wú)異質(zhì)性則采用固定效應(yīng)模型[3]合并數(shù)據(jù)。利用靈敏度分析來(lái)評(píng)估納入的每項(xiàng)研究對(duì)meta分析最終結(jié)果的作用，Begg的漏斗圖和Egger測(cè)試都是用來(lái)評(píng)估可能的發(fā)表偏倚[4]，采用pesrson等級(jí)相關(guān)測(cè)試對(duì)比RASSF1A基因啟動(dòng)子甲基化與實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 文獻(xiàn)情況 檢索相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)，最初檢索到相關(guān)文獻(xiàn)186篇，發(fā)表于2001年-2015年，嚴(yán)格依據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，在閱讀標(biāo)題、摘要及全文后剔除163篇，最終有23篇文獻(xiàn)[5-27]符合要求并納入本meta分析（圖1）。原始研究均提供了較為完整的數(shù)據(jù)資料，23篇研究中，18篇在亞太地區(qū)進(jìn)行（13篇在中國(guó)，2篇在韓國(guó)，3篇在日本），剩下的2篇在美國(guó)，1篇在德國(guó)，1篇在新西蘭，1篇在瑞士。研究還提供了研究對(duì)象的年齡，組織病理學(xué)類型，腫瘤階段，基因甲基化狀態(tài)等基本資料（表1）。

2.2 納入研究的文獻(xiàn)質(zhì)量評(píng)價(jià) 根據(jù)“觀察性流行病學(xué)研究報(bào)告規(guī)范（strengthening the reporting of observational studies in epidemiolog STROBE）-病例-對(duì)照研究”進(jìn)行了量化評(píng)價(jià)，總體比較，英文文獻(xiàn)質(zhì)量好于中文文獻(xiàn)（表2）。

2.3 不同組織甲基化率比較

2.3.1 總體比較 本篇meta分析所納入的研究中經(jīng)統(tǒng)計(jì)NSCLC患者肺癌組織中RASSF1A基因啟動(dòng)子甲基化的發(fā)生率為41.50%（95%CI: 34%-49%），對(duì)照組肺部正常組織中RASSF1A啟動(dòng)子的甲基化率為5.58%（95%CI:2%-9%）。兩組相比，RASSF1A基因啟動(dòng)子甲基化率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）（圖2A）。

表1 納入研究的對(duì)象的基本特征Tab1 Main characteristics of the included studies

表2 納入研究的23篇文獻(xiàn)的質(zhì)量評(píng)價(jià)（STROBE聲明）Tab2 STROBE Statement-checklist criteria of 23 reports included in this study

圖1 文獻(xiàn)篩選流程圖Fig1 Flowchart of the literature search procedure

2.3.2 亞組分析 對(duì)納入的肺癌病例進(jìn)行組織來(lái)源的亞組分析，在7例血漿樣本中RASSF1A基因啟動(dòng)子甲基化的發(fā)生頻率低于相應(yīng)的腫瘤組織（OR=10.99, 95%CI:2.48-48.68）；在14例正常肺組織樣本中RASSF1A基因啟動(dòng)子甲基化頻率低于相應(yīng)的肺癌組織（OR=8.74, 95%CI:4.39-17.41）（圖2B）。

2.4 異質(zhì)性檢驗(yàn)以肺癌中組織中RASSF1A基因啟動(dòng)子甲基化率的優(yōu)勢(shì)比OR為效應(yīng)量，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)異質(zhì)性檢驗(yàn)。肺癌組織與正常肺組織比較I2=82.3%，P＜0.01，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)異質(zhì)性（圖3），因此采用隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行分析。

2.5 敏感性分析 對(duì)納入研究的文獻(xiàn)進(jìn)行敏感性分析，逐一剔除其中的每一篇文獻(xiàn)后計(jì)算OR值，結(jié)果顯示逐一剔除每一篇文獻(xiàn)后OR值均大于1，P＜0.05，說(shuō)明研究結(jié)果較為穩(wěn)定，對(duì)其納入其中的文獻(xiàn)不敏感。

2.6 發(fā)表偏倚的評(píng)估 漏斗圖評(píng)估發(fā)表偏倚（P＜0.05），有8項(xiàng)研究落在了95%CI外，說(shuō)明該研究存在明顯的發(fā)表偏倚（圖4）。

3 討論

DNA甲基化是最早發(fā)現(xiàn)的基因修飾途徑之一，普遍存在于動(dòng)植物中，研究[28]表明DNA甲基化能引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象、穩(wěn)定性及其與蛋白質(zhì)相互作用方式的改變，從而控制基因表達(dá)，導(dǎo)致基因突變或者基因沉默等。抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化異常是基因失活的重要機(jī)制之一，可能導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄沉默，影響了細(xì)胞的代謝、凋亡等，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切聯(lián)系。RAS相關(guān)區(qū)域家族1A（RASSF1A）是由Dammann等[29]在2000年發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，位于染色體3p21.3區(qū)，可以通過(guò)多種途徑抑制腫瘤形成，其啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化可導(dǎo)致基因失活。在正常組織中RASFF1A基因啟動(dòng)子區(qū)域很少發(fā)生甲基化，其主要發(fā)生在腫瘤組織，如肺癌、乳腺癌中[30]。目前RASSF1A基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平已經(jīng)成為多種腫瘤診斷的一個(gè)重要生物學(xué)指標(biāo)，統(tǒng)計(jì)已有文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)RSSF1A啟動(dòng)子的甲基化率在肺癌患者中為12.1%-94.4%[13,23]，在對(duì)照組的標(biāo)本中為0-35.5%[17]，數(shù)據(jù)范圍浮動(dòng)較大，原因可能是由于各研究中所選樣本大小、特征的差異所造成的，因此本研究收集各項(xiàng)有關(guān)RASSF1A基因啟動(dòng)子甲基化與NSCLC關(guān)系的研究，采用meta分析的方法系統(tǒng)的整合數(shù)據(jù)，為臨床提供更可靠的證據(jù)。

圖2 不同組織甲基化率比較。A：肺癌樣本與正常樣本中RASSF1A基因啟動(dòng)子甲基化率的對(duì)比；B：肺癌樣本各亞型中RASSF1A基因啟動(dòng)子甲基化率的森林圖。Fig2 Comparison of methylation rate in different tissues. A: Comprison of RASSF1A gene promoter methylation between lung cancer samples and normal samples. B: Forest plot of RASSF1A gene promoter methylation in subgroup of lung cancer samples.

圖3 異質(zhì)性分析Fig3 Heterogeneity analyse

圖4 Begg漏斗圖法評(píng)估發(fā)表偏倚Fig4 Publication bias evaluation by Begg funnel plot

本研究共納入23篇符合要求的文獻(xiàn)，meta分析后發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，腫瘤組織中的甲基化率高于對(duì)照組（OR=8.72, 95%CI:4.88-15.58,P＜0.05），說(shuō)明RASSF1A啟動(dòng)子高甲基化與肺癌的發(fā)生可能存在正相關(guān)性，即RASSF1A基因啟動(dòng)子甲基化率越高，NSCLC的患病率可能就越高。亞組分析顯示腫瘤組織中的甲基化頻率高于血漿（OR=10.99, 95%CI: 2.48-48.68）和正常對(duì)照組織（OR=8.74, 95%CI: 4.39-17.41），表明肺癌組織中的甲基化頻率對(duì)肺癌的發(fā)生更具影響。綜上，NSCLC中的RASSF1A基因啟動(dòng)子的甲基化率可以給未來(lái)的臨床研究和治療提供依據(jù)。但是由于該meta分析的局限性，分析結(jié)果需謹(jǐn)慎對(duì)待，尚需更多合理的設(shè)計(jì)進(jìn)一步證實(shí)。

本篇meta分析的局限性在于：①研究間存在明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)異質(zhì)性（I2=82.3%,P＜0.01），雖然我們采用了隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行分析，但統(tǒng)計(jì)學(xué)異質(zhì)性對(duì)結(jié)果的穩(wěn)定性產(chǎn)生很大影響。②Begg漏斗圖顯示該研究存在明顯的發(fā)表偏倚，原因可能是多方面的，譬如一些相關(guān)陰性結(jié)果未被關(guān)注或未被及時(shí)發(fā)表，各國(guó)文獻(xiàn)收錄之間存在差異等。所以本篇meta所得出的結(jié)論穩(wěn)定性可能稍差。③本篇只選用了RASSF1A啟動(dòng)子甲基化率作為唯一變量，研究其與NSCLC之間的關(guān)系，但是多篇報(bào)道顯示在NSCLC中，RASSF1A的高甲基化可能聯(lián)合多種因素，如年齡、性別、吸煙狀況等對(duì)癌癥的發(fā)生發(fā)展起到重要的作用，所以在以后的研究中，可以考慮納入多因素變量進(jìn)行全面的統(tǒng)計(jì)分析。

總的來(lái)說(shuō)，RASSF1A基因啟動(dòng)子的甲基化與NSCLC的發(fā)生發(fā)展是有密切聯(lián)系的，其作為NSCLC早期診斷的分子標(biāo)志物有一定的說(shuō)服力，但是還需要更完善更合理的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和研究設(shè)計(jì)來(lái)為日后的臨床治療提供有力的指導(dǎo)。