吳愛兵 李金媚 吳昆鵬 莫艷麗 羅怡平 葉海茵 沈湘 李姝君 梁亞海 劉美蓮 楊志雄

肺癌位居全球男性和女性癌癥病死率的首位，且呈逐年上升的趨勢(shì)[1]。肺癌主要分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌，其中非小細(xì)胞肺癌是主要的發(fā)病類型，約占85%[2]。在非小細(xì)胞肺癌中，以肺腺癌的發(fā)病率最高。肺癌早期往往無(wú)明顯癥狀，56%的肺癌患者在確診時(shí)即伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，僅15%的患者在病灶局限時(shí)被發(fā)現(xiàn)[2]，因此肺癌細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移的研究成為臨床亟待解決的問(wèn)題。近年來(lái)越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)肺癌侵襲轉(zhuǎn)移的發(fā)生與microRNA有密切關(guān)系。

MicroRNA是生物體內(nèi)一類長(zhǎng)度約為20個(gè)-23個(gè)核苷酸的非編碼小RNA，是由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的約70個(gè)-90個(gè)堿基大小的單鏈RNA前體（pre-miRNA）經(jīng)過(guò)Dicer酶加工后生成的成熟體microRNA-3p和microRNA-5p，通過(guò)靶向結(jié)合mRNA的3’端非編碼區(qū)（3’untranslated regions, 3’UTR），影響目的基因的蛋白表達(dá)水平，從而影響細(xì)胞的增殖、分化、凋亡與侵襲轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為[3]。MicroRNA已被證實(shí)在多種腫瘤的轉(zhuǎn)移形成中發(fā)揮重要作用，包括乳腺癌、肝癌、前列腺癌和結(jié)腸癌等[4]。

MiR-373是miRNAs-371-372-373家族的成員之一，miR-371/miR-372/miR-373的前體都是相同的，均由染色質(zhì)19q13.42轉(zhuǎn)錄而來(lái)[5]。MiR-373的前體（pre-miR-373）在細(xì)胞質(zhì)中經(jīng)過(guò)Dicer酶加工后生成成熟體miR-373-3p（即miR-373）和miR-373-5p（即miR-373*），然而miR-373*在自然界中極少存在。MiR-373在不同的腫瘤中的作用不盡相同，具有組織特異性，扮演著癌基因和抑癌基因的角色，影響著腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移、增殖與周期等生物學(xué)行為。研究表明miR-373在乳腺癌[6]、人纖維肉瘤[7]及胰腺癌[8]中對(duì)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力有重要調(diào)控作用。然而miR-373在肺癌中的作用機(jī)制尚未十分明確，為了探討其與肺癌的關(guān)系，本研究通過(guò)檢測(cè)成熟體hsa-miR-373-3p（又稱miR-373）在非小細(xì)胞癌中的表達(dá)情況，同時(shí)比較在肺腺癌細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)及干擾miR-373-3p后對(duì)肺腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人肺腺癌細(xì)胞株A549、H1299、H1975、SPC-A1、PC9和正常支氣管上皮細(xì)胞HBE均由本實(shí)驗(yàn)室提供；非小細(xì)胞肺癌組織標(biāo)本51例和癌旁組織標(biāo)本39例收集于廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院；RNA提取劑Trizol、反轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自TAKARA；PCR引物合成及細(xì)胞培養(yǎng)用的1640培養(yǎng)基購(gòu)自Invitrogen；胎牛血清（FBS）購(gòu)自BI；miR-373-3p mimics和miR-373-3p inhibitor購(gòu)自GenePharma；Lipofectamine? 3000 Transfection Reagent和OPTI-MEN減血清培養(yǎng)基購(gòu)自Life Technologies；24孔transwell小室（孔徑8 μm）購(gòu)自Corning Costar；侵襲實(shí)驗(yàn)所用基質(zhì)膠（ Matrigel）購(gòu)自BD；基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9, MMP-9）和MMP14單克隆兔抗人抗體購(gòu)自CST；RIPA裂解液、BCA蛋白定量及超敏發(fā)光試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR） 檢測(cè)肺癌組織和肺癌細(xì)胞株中的miR-373-3p收集肺癌標(biāo)本，冰上研磨成粉末狀后加入Trizol提取總RNA，應(yīng)用 PrimeScript?miRNA cDNA Synthesis Kit將microRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，通過(guò)熒光定量PCR法檢測(cè)肺癌組織miR-373-3p的相對(duì)表達(dá)水平。收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肺腺癌細(xì)胞，PBS洗兩遍，加入Trizol提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行qRTPCR檢測(cè)。Has-miR-373-3p和內(nèi)參U6的上游引物序列分別為：5’-GAAGTGCTTCGATTTTGGGGTGT-3’和5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，其共同下游引物Uni-miR qPCR已包含在TAKARA試劑盒內(nèi)。應(yīng)用羅氏LightCycler?進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。每孔10 μL體系，設(shè)置3個(gè)平行樣，U6作為內(nèi)參。樣本經(jīng)過(guò)3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)，所得數(shù)據(jù)使用2-ΔCt或者2-ΔΔCt（ΔCt=Ct目的基因-CtU6）進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549和H1299細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)匯合度達(dá)60%-70%時(shí)，利用lipo3000轉(zhuǎn)染試劑將hsa-miR-373-3p mimics及其陰性對(duì)照（negative control, NC）瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至H1299細(xì)胞中，將hsa-miR-373-3p inhibitor和NC瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染時(shí)換為無(wú)血清無(wú)雙抗的1640培養(yǎng)基，6 h后換成含10%FBS的培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞，提取RNA，用qRT-PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞中miR-373-3p及MMP-9、MMP-14基因mRNA的改變。轉(zhuǎn)染序列如下：hsa-miR-373-3p mimics：sense 5’-GAAGUGCUU CGAUUUUGGGGUGU- 3’，anti-sense 5’-ACCCCAAAA UCGAAGCACUUCUU-3’；mimics NC：sense 5’-UUCU CCGAACGUGUCACGUTT- 3’；anti-sense 5’-ACGUGA CACGUUCGGAGAATT-3’；hsa-miR-373-3p inhibitor：5’-ACACCCCAAAAUCGAAGCACUUC-3’，inhibitorNC：5’-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’。MMP-9上游引物：5’-GCAATGCTGATGGGAAACCC- 3’；MMP-9下游引物：5’-AGAAGCCGAAGAGCTTGTCC- 3’。MMP-14上游引物：5’-ATCTGCCTCTGCCTCACCTA- 3’；MMP-14下游引物：5’-AAGCCCCATCCAAGGCTAAC- 3’。

1.2.3 遷移實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H1299和A549細(xì)胞接種于6孔板，轉(zhuǎn)染48 h后，以每孔200 μL的0.25%胰酶消化細(xì)胞，用無(wú)血清的1640培養(yǎng)基重懸并調(diào)整細(xì)胞密度為3×105/mL，取100 μL細(xì)胞懸液加入24孔transwell小室的上室，下室預(yù)先加入500 μL含10%FBS的1640培養(yǎng)基，放置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后取出小室，用PBS洗兩遍，甲醇固定10 min，結(jié)晶紫染色10 min。用棉簽小心搽拭小室上層細(xì)胞，將小室纖維膜取下，用中性樹脂將膜封于載玻片中，100倍顯微鏡下取6個(gè)隨機(jī)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.4 侵襲實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549和H1299細(xì)胞接種于6孔板，轉(zhuǎn)染48 h后，以每孔200 μL的0.25%胰酶消化細(xì)胞，用無(wú)血清的1640培養(yǎng)基重懸并調(diào)整細(xì)胞密度為3×105/mL，取100 μL細(xì)胞懸液加入24孔transwell小室的上室。上室預(yù)先加入50 μL基質(zhì)膠，室溫下風(fēng)干4 h；下室預(yù)先加入500 μL含10%FBS的1640培養(yǎng)基。于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后取出小室，用PBS洗兩遍，甲醇固定10 min，結(jié)晶紫染色10 min。用棉簽小心搽拭小室上層細(xì)胞，將小室纖維膜取下，用中性樹脂將膜封于載玻片中，100倍顯微鏡下取6個(gè)隨機(jī)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.5 Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)MMP-9、MMP-14蛋白表達(dá)水平 收集轉(zhuǎn)染72 h后的的A549和H1299細(xì)胞，加入RIPA裂解液和蛋白酶抑制劑提取總蛋白，BCA蛋白定量法檢測(cè)蛋白濃度，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，將電泳分離的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%BSA室溫封閉1 h，分別加入1:1,000兔抗人MMP-9及MMP-14抗體，4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗3次，每次10 min，加入辣根過(guò)氧化酶偶聯(lián)的抗兔二抗（1:1,000稀釋），置于室溫?fù)u床1 h，TBST洗膜3次，每次10 min，加入ECL發(fā)光液曝光顯影，以β-actin為內(nèi)參，用Quantity One軟件分析結(jié)果[9]。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)均用Mean±SD表示，兩組樣本間比較用t檢驗(yàn)，多組樣本間比較用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MiR-373-3p在肺癌組織中的表達(dá)水平 用qRT-PCR法檢測(cè)miR-373-3p在51例NSCLC組織和39例癌旁組織中的表達(dá)，與癌旁組織相比，miR-373-3p在非小細(xì)胞肺癌組織中高表達(dá)（P=0.011,9）（圖1），然而，miR-373-3p在腺癌與鱗癌中的表達(dá)無(wú)明顯差異（P=0.904,9）。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌組織中miR-373-3p的表達(dá)是無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的3.7倍（P=0.008,7）（圖1，表1），這說(shuō)明miR-373-3p可能與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力相關(guān)。

圖1 qRT-PCR檢測(cè)miR-373-3p在肺癌標(biāo)本中的表達(dá)。A：MiR-373-3p在肺癌組織（n=51）中較癌旁組織（n=39）高表達(dá)（P=0.011,9）；B：MiR-373-3p在肺腺癌和鱗癌間的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.904,9）；C：MiR-373-3p在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織中較無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織高表達(dá)（P=0.008,7）。Fig1 qRT-PCR of miR-373-3p expression in lung cancer tissue. A: The expression of miR-373-3p was up-regulated in lung cancer; B: MiR-373-3p was not sinificantly different between adenocarcinoma and squamous carcinoma; C: Higher expression was shown in lung cancer with lymph node metastasis. *: P＜0.05; NS: P＞0.05.

表1 非小細(xì)胞肺癌患者的臨床病理特征與miR-373-3p表達(dá)的關(guān)系Tab1 Clinicopathologic features of non-small cell lung cancer patients and the expression of miR-373-3p

圖2 qRT-PCR檢測(cè)miR-373-3p在肺腺癌細(xì)胞株中的表達(dá)。MiR-373-3p在5種肺腺癌細(xì)胞株中的表達(dá)水平較正常支氣管上皮細(xì)胞明顯增高。相比HBE組，*P＜0.05。Fig2 qRT-PCR of miR-373-3p expression in lung adenocarcinoma cancer cell lines. The expression level of miR-373-3p is sinificantly higher in lung adenocarcinoma cancer cell lines (n=5) than in normal bronchial epithelial cell (HBE). *: P＜0.05, when compared with HBE.

2.2 MiR-373-3p在肺腺癌細(xì)胞株中的表達(dá) 我們進(jìn)一步檢測(cè)miR-373-3p在肺腺癌細(xì)胞株中的表達(dá)情況（圖2），結(jié)果顯示與正常支氣管上皮細(xì)胞（HBE）相比，肺腺癌細(xì)胞株（H1299、A549、H1975、SPC-A1、PC9）中miR-373-3p的表達(dá)均明顯上調(diào)（P=0.005,8）。根據(jù)肺腺癌細(xì)胞中miR-373-3p的表達(dá)情況，我們選擇在miR-373-3p相對(duì)表達(dá)水平最低的H1299細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-373-3p，在miR-373-3p相對(duì)表達(dá)水平最高的A549細(xì)胞中抑制miR-373-3p的表達(dá)。

2.3 轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞中miR-373-3p及MMP-9、MMP-14基因mRNA水平的改變 用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染法將miR-373-3p mimics轉(zhuǎn)染至miR-373-3p表達(dá)量相對(duì)最低的H1299細(xì)胞中，與NC組相比，mimics組miR-373-3p（P=0.006）和MMP-9（P＜0.001）、MMP-14（P＜0.001）的表達(dá)明顯增加；將miR-373-3p inhibitor轉(zhuǎn)染至miR-373-3p表達(dá)量相對(duì)最高的A549細(xì)胞中，與NC組相比，inhibitor組miR-373-3p（P=0.019,2）和MMP-9（P＜0.001）、MMP-14（P＜0.001）的表達(dá)明顯下調(diào)（圖3）。

2.4 miR-373-3p促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞的侵襲與遷移 在Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-373-3p后H1299細(xì)胞的遷移能力增加1.72倍（P＜0.01），然而抑制miR-373-3p的表達(dá)后A549細(xì)胞的遷移能力下降54%（P=0.012）（圖4A）；與遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致的是，在Transwell小室基質(zhì)膠侵襲實(shí)驗(yàn)中，過(guò)表達(dá)miR-373-3p后H1299細(xì)胞的侵襲能力增加1.62倍（P＜0.01），抑制miR-373-3p的表達(dá)后A549細(xì)胞的侵襲能力下降45%（P=0.03）（圖4B）。

2.5 改變miR-373-3p的表達(dá)對(duì)MMP-9、MMP-14蛋白的影響 相比對(duì)照組細(xì)胞，轉(zhuǎn)染miR-373-3p mimics的細(xì)胞中MMP-9、MMP-14蛋白表達(dá)上調(diào)；與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染miR-373-3p inhibitor的細(xì)胞中MMP-9、MMP-14蛋白表達(dá)下調(diào)（圖5）。

圖3 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中miR-373-3p、MMP-9和MMP-14基因的mRNA水平。A：瞬轉(zhuǎn)miR-373-3p mimics后H1299細(xì)胞中miR-373-3p的表達(dá)明顯增加，瞬轉(zhuǎn)miR-373-3p inhibitor后A549細(xì)胞中miR-373-3p的表達(dá)明顯減少。*：P＜0.05；B：過(guò)表達(dá)miR-373-3p后H1299細(xì)胞中MMP-9、MMP-14基因的mRNA明顯上調(diào)；抑制miR-373-3p表達(dá)后A549細(xì)胞的MMP-9、MMP-14基因的mRNA明顯下調(diào)。*：P＜0.05。Fig3 mRNA level of miR-373-3p, MMP-9 and MMP-14 in transfected lung cancer cell lines. A: H1299 cells transfected with miR-373-3p mimics showed an increase in miR-373-3p expression, while A549 cells transfected with miR-373-3p inhibitor resulted in significantly decreased miR-373-3p expression. *: P＜0.05 when compared with corresponding negative control. B: mRNA expression of MMP-9 and MMP-14 was up-regulation in H1299 cells with miR-373-3p overexpression, while these genes were down-regulation in A549 with miR-373-3p knock-down. *: P＜0.05.

圖4 miR-373對(duì)肺腺癌細(xì)胞遷移與侵襲能力的影響。A：遷移實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染miR-373 mimics后促進(jìn)H1299細(xì)胞遷移，轉(zhuǎn)染miR-373 inhibitor后抑制A549細(xì)胞遷移；B：侵襲實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染miR-373 mimics后H1299細(xì)胞的侵襲能力增強(qiáng)，轉(zhuǎn)染miR-373 inhibitor后A549細(xì)胞的侵襲能力下降。*：P＜0.05。Fig4 Effects of miR-373 on the migration and invasion of lung adenocarcinoma cancer cells in vitro. A: Migration assay. H1299 cells transfected with miR-373 mimics showed an increase in migration capability, while A549 cells transfected with miR-373 inhibitor resulted in significantly decreased migration capability. *: P＜0.05 when compared with corresponding negative control. B: Invasion assay. Promotion of invasion ability was shown in H1299 transfected with miR-373 mimics, while A549 cells transfected with miR-373 inhibitor lead to the significantly decrease of invasion ability. *: P＜0.05 when compared with corresponding negative control.

圖5 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中MMP-9、MMP-14蛋白的表達(dá)水平。轉(zhuǎn)染miR-373-3p mimics后H1299細(xì)胞中MMP-9、MMP-14蛋白表達(dá)上調(diào)；轉(zhuǎn)染miR-373-p inhibitor后A549細(xì)胞中MMP-9、MMP-14蛋白表達(dá)下調(diào)。Fig5 Expression of MMP-9 and MMP-14 protein in cells after tranfection. Up-regulation of MMP-9 and MMP-14 protein in H1299 cells transfected with miR-373-3p mimics, while down-regulation of MMP-9 and MMP-14 protein in A549 cells transfected with miR-373-3p inhibitor.

3 討論

MiR-373在多種腫瘤中均出現(xiàn)異常表達(dá)，扮演著癌基因或者抑癌基因的角色，影響腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程。有研究[6]報(bào)道m(xù)iR-373在乳腺癌中表達(dá)上調(diào)，通過(guò)下調(diào)CD44的表達(dá)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。在人纖維肉瘤HT1080細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)的miR-373可直接通過(guò)靶向結(jié)合雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin, mTOR）和去乙?；?（sirtuin 1, SIRT1）mRNA的3'UTR而使mTOR和SIRT1的表達(dá)下調(diào)，進(jìn)一步導(dǎo)致Ras/Raf/MEK/Erk信號(hào)通路和轉(zhuǎn)錄因子（nuclear factor kappa B, NF-κB）的激活，從而提高M(jìn)MP-9的表達(dá)水平，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移能力[7]。Zhang等[8]研究發(fā)現(xiàn)miR-373在胃癌中高表達(dá)，通過(guò)下調(diào)靶基因腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白1（tumor necrosis factor, alpha-induced protein 1, TNFAIP1）的表達(dá)而促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖。然而，miR-373與肺癌的研究甚少，兩者的關(guān)系尚未十分明確。

本研究發(fā)現(xiàn)miR-373-3p在非小細(xì)胞肺癌組織中較癌旁組織高表達(dá)，通過(guò)分析研究非小細(xì)胞肺癌組織標(biāo)本的臨床病理特征與miR-373-3p表達(dá)間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的非小細(xì)胞肺癌組織中miR-373-3p的表達(dá)明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的，另外T3期-T4期的NSCLC組織中miR-373-3p的表達(dá)也高于T1期-T2期的，據(jù)此我們認(rèn)為miR-373-3p可能對(duì)NSCLC的增殖轉(zhuǎn)移有一定調(diào)控作用。而非小細(xì)胞肺癌中又以肺腺癌的發(fā)病率最高，因此本研究主要探討miR-373-3p與肺腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miR-373-3p在5種人肺腺癌細(xì)胞株中的表達(dá)水平也顯著高于人正常支氣管上皮細(xì)胞，其中以H1299細(xì)胞的相對(duì)表達(dá)水平最低，A549細(xì)胞的相對(duì)表達(dá)水平最高。為了探討miR-373-3p對(duì)肺腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響，我們通過(guò)功能獲得以及功能缺失研究發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-373-3p可以促進(jìn)H1299細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力；相反，抑制miR-373-3p的表達(dá)可降低A549細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。以上數(shù)據(jù)表明miR-373-3p可以促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。與此同時(shí)，日本學(xué)者Seol等[9]在研究miR-373與肺癌的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)pre-miR-373可抑制肺癌細(xì)胞的侵襲能力，該研究結(jié)果和我們有所不同，存在差異的可能原因是他們的研究中用的是miR-373的前體，而pre-microRNA進(jìn)入細(xì)胞后會(huì)在Dicer酶的加工下生成microRNA-5p和microRNA-3p而發(fā)揮生物學(xué)作用，事實(shí)上是否存在microRNA-5p和microRNA-3p的作用差異，這是一個(gè)有趣的問(wèn)題，因?yàn)閙iR-373在不同的腫瘤中也扮演不同的角色，在有的腫瘤中促進(jìn)轉(zhuǎn)移，有的則是抑制腫瘤轉(zhuǎn)移，例如miR-373促進(jìn)乳腺癌[6]、人纖維肉瘤[7]及宮頸癌[10]細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力，卻抑制前列腺癌[11]和卵巢癌[12]細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，今后miR-373的亞型在肺癌中的作用仍需進(jìn)一步研究。

腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的形成涉及多種機(jī)制，研究發(fā)現(xiàn)基質(zhì)金屬蛋白酶家族（matrix metalloproteinases, MMPs）對(duì)于腫瘤轉(zhuǎn)移有重要相關(guān)性，他們降解基底膜并在細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix, ECM）中暴露出隱藏的多肽抗原，促進(jìn)侵襲的發(fā)生。MMPs可在原發(fā)腫瘤處將可溶性腫瘤細(xì)胞釋放至循環(huán)系統(tǒng)中，并在遠(yuǎn)處器官形成轉(zhuǎn)移微環(huán)境以助于隨后腫瘤細(xì)胞的克隆形成[13]。MMPs也可以直接修飾整合素和其他腫瘤細(xì)胞粘附分子，激活重要的細(xì)胞因子如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforming growth factor beta,TGF-β），誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）的發(fā)生，EMT是由增強(qiáng)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)而引起的廣泛表型改變，是腫瘤轉(zhuǎn)移的重要過(guò)程[13]。MMP-9是基質(zhì)金屬蛋白酶家族的成員之一，對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和侵襲遷移起著重要作用[14]。Peng等[15]發(fā)現(xiàn)MMP-9高表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者的不良預(yù)后有密切關(guān)系。多項(xiàng)研究[16-18]表明MMP-9與增加患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率、腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率及縮短無(wú)復(fù)發(fā)生存率有關(guān)。MMP-14又稱膜型基質(zhì)金屬蛋白酶-1（membrane-type matrix proteinase-1,MT1-MMP），是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的膜型基質(zhì)金屬蛋白酶。MMP-14在正常組織與腫瘤組織的生物學(xué)行為中均發(fā)揮重要作用，例如侵襲[19]、增殖[20]與細(xì)胞外基質(zhì)的重塑[21]等。研究[22]證實(shí)相比癌旁組織，MMP-14在非小細(xì)胞癌組織中明顯高表達(dá)。Wang等[23]研究發(fā)現(xiàn)MMP-14高表達(dá)的非小細(xì)胞肺癌患者生存時(shí)間比MMP-14低表達(dá)者更短，是一個(gè)不良預(yù)后的指標(biāo)。

為了進(jìn)一步探討miR-373-3p促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的作用機(jī)制，我們對(duì)miR-373-3p與基質(zhì)金屬蛋蛋白酶間的關(guān)系進(jìn)行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-373-3p的細(xì)胞中MMP-9及MMP-14蛋白的表達(dá)水平上調(diào)；抑制miR-373-3p的表達(dá)后細(xì)胞中MMP-9及MMP-14蛋白的表達(dá)水平下調(diào)。該結(jié)果表明，miR-373-3p可能通過(guò)上調(diào)MMP-9及MMP-14蛋白的表達(dá)水平而影響腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。

本研究發(fā)現(xiàn)miR-373-3p在肺腺癌中表達(dá)上調(diào)并扮著癌基因的角色，可能通過(guò)上調(diào)MMP-9及MMP-14蛋白的表達(dá)水平而促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力，闡明了肺腺癌細(xì)胞發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制之一，提示miR-373-3p可能作為抑制肺腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的靶點(diǎn)，有望為臨床上逆轉(zhuǎn)肺腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移提供新的思路。