婁江濤 魏任雄余亮亮 張曉霞 崔 云

浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬寧波中醫(yī)院男科實(shí)驗(yàn)室（寧波 315012）

miR-34b在男性不育患者精漿中的表達(dá)及其臨床意義*

婁江濤 魏任雄**余亮亮 張曉霞 崔 云

浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬寧波中醫(yī)院男科實(shí)驗(yàn)室（寧波 315012）

目的 研究精漿游離miR-34b在體外不同條件下的穩(wěn)定性及其與男性不育癥患者精液參數(shù)的關(guān)系。方法 選取男性不育癥患者80例和同期因女方因素不孕前來(lái)檢查的生育力評(píng)估正常的健康男性20例為正常對(duì)照組，將8例正常的精液標(biāo)本分別在室溫和-80℃下放置，以不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)精漿miR-34b的穩(wěn)定性。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)精漿游離miR-34b的相對(duì)含量，精子濃度及精子活力用計(jì)算機(jī)輔助精子分析系統(tǒng)，精子存活率采用低鹽膨脹實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，正常精子形態(tài)百分率采用Diff-Quick染色法。分析男性不育癥組和正常對(duì)照組精液參數(shù)及miR-34b表達(dá)量的差異，對(duì)精漿游離miR-34b在男性不育組精漿中的診斷價(jià)值進(jìn)行ROC曲線分析，并采用Pearson直線相關(guān)分析miR-34b與男性不育組精液各參數(shù)的相關(guān)性。結(jié)果 精漿游離miR-34b在室溫和低溫下不同時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量無(wú)明顯變化（F=0.13， P=0.97； F=0.35，P=0.84）。與正常組比較發(fā)現(xiàn)，男性不育組精漿游離miR-34b表達(dá)下調(diào)（P＜0.01）。兩組的精子濃度、精子存活率、前向運(yùn)動(dòng)精子百分率（PR）和正常形態(tài)精子百分率均有差異（P＜0.01）。ROC曲線顯示miR-34b能夠較好的區(qū)分不育組與健康對(duì)照組，曲線下面積分比（AUC）為0.85（0.79-0.95，95%）。Pearson直線相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)男性不育患者精漿miR-34b表達(dá)量與精子密度（r =0.28，P＜0.05）、精子活率（r =0.56，P＜0.01）、前向運(yùn)動(dòng)精子百分率（r =0.41，P＜0.01）正相關(guān)，與精子形態(tài)無(wú)相關(guān)性（r =0.15，P＞0.05）。結(jié)論精漿miR-34b在室溫下穩(wěn)定，并能在-80℃條件下長(zhǎng)期保存，在男性不育患者精漿中表達(dá)下調(diào)，并與精子濃度、精子存活率、前向運(yùn)動(dòng)精子百分率呈正相關(guān)，與精子形態(tài)無(wú)相關(guān)性。

不育， 男性； 微RNAs； ROC曲線

男性不育癥診治困難，相關(guān)致病機(jī)制尚不清楚。microRNA（miRNA）作為新的切入點(diǎn)，為疾病的認(rèn)識(shí)開(kāi)辟了一條新的途徑。研究表明miRNA分子在精子形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用［1］， Bouhallier 和Rokavec等認(rèn)為miR-34基因家族參與細(xì)胞周期、凋亡的調(diào)控，與精子的發(fā)生、凋亡關(guān)系密切［2，3］。本研究通過(guò)觀察miR-34b在男性不育癥中的表達(dá)特征，旨在闡明男性不育發(fā)生的一種可能機(jī)制，為臨床診治提供一種新的分子標(biāo)志物。

資料與方法

一、對(duì)象

選取2012年8月至2014年11月來(lái)我院男科就診的男性不育癥患者80例。年齡24～41歲，平均（31.06±4.66）歲。病程2～10年，平均（3.5±4.1）年?；辇g2.4～11年，平均（4.8±4.7）年。身體健康，夫妻性生活正常，未采取任何避孕措施1年以上未使女方懷孕。查體及彩色多普勒超聲檢查未發(fā)現(xiàn)明顯睪丸、附睪、輸精管異常以及精索靜脈曲張。女方均經(jīng)婦科檢查，輸卵管通暢實(shí)驗(yàn)以及B超、內(nèi)分泌測(cè)定等排除女方不孕因素，同時(shí)排除內(nèi)分泌、遺傳、惡性腫瘤、血液系統(tǒng)疾病、自身免疫性疾病、慢性阻塞性肺疾病，肝腎功能異常以及感染等。另外選擇同期因女方因素不孕前來(lái)檢查的生育力評(píng)估正常的健康男性20例為正常對(duì)照組，年齡25～39歲，平均（29.35±3.36）歲。兩組在年齡結(jié)構(gòu)、婚齡等基線資料方面經(jīng)檢驗(yàn)齊同性良好，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。所有對(duì)象均簽署知情同意書(shū)并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)同意。

二、主要試劑和儀器

WLJY-9000偉力彩色精子檢測(cè)系統(tǒng)（北京偉力公司），Diff-Quick染液購(gòu)自珠海貝索生物技術(shù)有限公司，miR-34b TaqMan miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，TaqMan miRNA qPCR試劑盒，TaqMan small RNA引物（5×），Taq Man small RNA引物（20×）均購(gòu)自美國(guó)ABI有限公司。Trizol購(gòu)自美國(guó)Invirtrogen 公司，高速冷凍離心機(jī)采用美國(guó)Beckman Coulter公司Allegra 64R，普通PCR儀為美國(guó)BIO-RAD公司S1000 Thermal Cycler，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀為美國(guó)BIO-RAD公司CFX96。

三、試驗(yàn)方法

（一）標(biāo)本采集

依WHO要求，采集精液前禁欲3～7d，排小便，洗凈雙手，用手淫法收集全部精液于干燥消毒的精液采集器內(nèi)，置37℃多維混勻恒溫箱，觀察精液液化時(shí)間，待充分液化后行精液常規(guī)檢查，3 000×g，離心15min，取精漿即時(shí)測(cè)定精漿miR-34b，或置-80℃冰箱保存待用，用以批量測(cè)定miR-34b。

（二）精液分析

依照WHO《人類(lèi)精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》（第5版）要求進(jìn)行精液分析［4］，液化時(shí)間通過(guò)肉眼觀察和顯微鏡進(jìn)行識(shí)別判讀，待精液液化后借用北京偉力計(jì)算機(jī)輔助精子分析系統(tǒng)，在帶有加熱37℃載物臺(tái)的顯微鏡下分析精子活力和精子濃度，精子存活率采用低滲膨脹實(shí)驗(yàn)（HOS）。精子形態(tài)采用Diff-Quick染色法。

（三）精液總RNA 的提取

1. 預(yù)處理：取200μL精漿加入2μL濃度為100μg/mL蛋白酶K于37℃水浴箱1h后，再加入140μL醋酸鈉、60μLβ-巰基乙醇、50μL PBS和0.024 PVP充分混勻于室溫下放置15min，然后4℃1 2000×g，離心10min，取上清液用于TRIzol 法提取RNA。

2. TRIzol法提取RNA：取200μL預(yù)處理的精漿加入1mL TRIzol中充分均勻，將勻漿液倒入1.5mL離心管中， 再依次加入氯仿、異丙醇及95%乙醇，獲得總RNA。

3. 提取效率評(píng)估：用20μL DEPC 水溶解RNA 沉淀，取2μL總RNA加入 98μL DEPC 水稀釋后用分光光度計(jì)測(cè)定A260 /A280，比值在1.8～2.0用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

（四）逆轉(zhuǎn)錄和Q-PCR

按照TapMan miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑說(shuō)明書(shū)將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，按比例配制RT混合液，分別加入TaqManhsa-miR-34b引物（5×）或內(nèi)參TaqMan U6 sn RNA引物（5×），使用RT-PCR儀進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。合成cDNA后，按照TaqManmiRNA qPCR試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，混合加入TaqMan Universal PCR混合試劑Ⅱ（不含UNG），分別加入Taq Manhsa-miR-34b引物（20×）或內(nèi)參TaqManU6snRNA引物（20×）。以U6的量為內(nèi)參照，計(jì)算miR-34b的相對(duì)表達(dá)量△Ct為2Ct（U6）-Ct（miR-34b）。

（五）精液中miR-34b穩(wěn)定性檢測(cè)

選取精液參數(shù)正常的男性精液8份，離心后留取精漿2000μL，分成2份，各1 000μL，檢測(cè)在以下2種環(huán)境中的穩(wěn)定性：（1）室溫孵育，將精漿分別放置室溫下0、2、4、8和24h后，各取出200μL檢測(cè)精漿miR-34b的表達(dá)情況。（2）放置-80℃μ冰箱內(nèi)，分別在1、3、7、15和30d 5個(gè)時(shí)間點(diǎn)各取出200μL，檢測(cè)精漿miR-34b的表達(dá)情況。。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)，精液質(zhì)量參數(shù)和精漿miR-34b相對(duì)表達(dá)量符合正態(tài)分布，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示；兩組間比較采用均數(shù)比較的 t 檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，用Pearson 進(jìn)行miR-34b與精液其他參數(shù)的相關(guān)性分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

結(jié) 果

一、精漿miR-34b穩(wěn)定性檢測(cè)

在室溫分別放置0、2、4、8和24h以及在-80℃冰箱內(nèi)放置1、3、7、15和30d后精漿miR-34b相對(duì)表達(dá)量均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），結(jié)果見(jiàn)表1。

二、男性不育癥組及正常對(duì)照組精液常規(guī)主要參數(shù)和精漿miR-34b表達(dá)的比較

男性不育癥組miR-34b表達(dá)量明顯下調(diào)，兩組比較精子濃度、前向運(yùn)動(dòng)精子百分率、精子存活率、正常精子形態(tài)百分率以及miR-34b表達(dá)均有非常顯著性差異（P ＜0.01），見(jiàn)表2。

表 1 不同條件下精漿miR-34b相對(duì)表達(dá)量比較（n=8）

表 1 不同條件下精漿miR-34b相對(duì)表達(dá)量比較（n=8）

室溫放置（h） -80℃冰箱內(nèi)放置（d）時(shí)間點(diǎn) 0 2 4 8 24 1 3 7 15 30 miR-34b（×10-2） 9.43±5.57 9.84±4.79 9.14±5.62 10.06±3.81 9.64±5.02 8.68±4.62 9.09±4.05 8.23±3.36 9.81±5.13 9.14±4.71 F 013 0.35 P 0.97 0.84

表2 男性不育癥組及正常組精液常規(guī)主要參數(shù)和精漿miR-34b表達(dá)的比較（）

表2 男性不育癥組及正常組精液常規(guī)主要參數(shù)和精漿miR-34b表達(dá)的比較（）

分組 n 精子濃度 精子存活率 前向運(yùn)動(dòng)精子 正常精子形態(tài) miR-34b含量（×106/mL） （%） （%） （%） （×10-2）正常組 20 107.40±48.68 69.50±5.92 43.50±5.91 8.01±1.45 9.19±3.11男性不育癥組 80 71.76±54.21 43.40±17.96 20.11±13.25 3.53±1.51 4.83±2.24 t 2.68 10.85 11.77 11.99 5.89 P ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

三、ROC曲線

繪制ROC曲線評(píng)估精漿miR-34b對(duì)男性不育癥的診斷價(jià)值，其曲線下面積為0.85（0.79～0.95，95%），當(dāng)選擇最佳診斷截?cái)嘀?.66×10-2時(shí)，其敏感度為95.00%，特異度為70.00%，見(jiàn)圖1。

四、男性不育癥組精液常規(guī)參數(shù)與精漿miR-34b的相關(guān)性分析

miR-34b與精子濃度、精子存活率、前向運(yùn)動(dòng)精子百分率呈非常顯著正相關(guān)（P＜0.05或P＜0.01），與正常精子形態(tài)百分率無(wú)相關(guān)性，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 男性不育癥組精液常規(guī)參數(shù)與精漿miR-34b的相關(guān)性分析

圖1 miR-34b診斷男性不育癥的ROC曲線

討 論

在我國(guó)，15%生育年齡的夫婦不能生育，其中20%完全是男性的原因， 30%與夫婦雙方有關(guān)，即大約50%的不育因素涉及到男性［5］。由于其致病因素復(fù)雜，往往僅表現(xiàn)為精子常規(guī)質(zhì)量異常甚至正常，臨床診治手段還很有限，評(píng)估男性生殖能力主要應(yīng)用精液常規(guī)質(zhì)量分析，但精液質(zhì)量常規(guī)參數(shù)受睪丸內(nèi)部及外部多種因素的影響，反映的僅是表象數(shù)據(jù)，因此無(wú)任何一項(xiàng)常規(guī)質(zhì)量參數(shù)可作為不育癥的決定性診斷，尋找不育癥的生物學(xué)標(biāo)志一直以來(lái)都是一個(gè)重要的研究方向，由于體液的易于獲得，人們更傾向于在體液中尋找生物學(xué)標(biāo)志。miRNA作為新的切入點(diǎn)是近年來(lái)各學(xué)科關(guān)注的焦點(diǎn)， miRNA是一種非編碼的、大小為22nt左右的單鏈小分子RNA，由于可游離于體液中，被認(rèn)為是一種潛在的很有前途的具有組織特異性的無(wú)創(chuàng)生物標(biāo)記物［6］。已有相當(dāng)多的研究報(bào)道了在產(chǎn)前［7］以及各種腫瘤［8-10］、心血管?。?1］等多種疾病的診斷和預(yù)后中利用血清、唾液、尿液、胸腹水等體液miRNA。同樣，精漿游離miRNA 有望成為男性生殖疾病的非侵入性診斷標(biāo)記分子和生殖遺傳的表觀遺傳篩查的指標(biāo)。

Weber等［12］通過(guò)比較12種體液的游離miRNA發(fā)現(xiàn)，精漿中游離miRNA種類(lèi)數(shù)高居第二位。Huang等［13］發(fā)現(xiàn)精漿中游離RNA含量豐富，明顯高于血漿和唾液。精漿是由前列腺、精囊、尿道球腺和旁腺等附屬腺分泌的物質(zhì)，成分復(fù)雜，內(nèi)含豐富的蛋白質(zhì)、多糖及降解酶，因此本研究通過(guò)先將精漿蛋白質(zhì)、多糖進(jìn)行去除預(yù)處理后再進(jìn)行TRIzol法提取RNA，發(fā)現(xiàn)其提取效率明顯高于直接TRIzol法，經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定A260/A280比值均在1.8～2.0之間，而直接TRIzol法僅在1.1左右。為驗(yàn)證其在體外不同條件下保存的穩(wěn)定性，本研究通過(guò)建立的熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)了精漿在室溫和-80℃條件下放置不同時(shí)間后miR-34b的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各時(shí)間點(diǎn)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示精漿中游離miRNA可能存在某種保護(hù)機(jī)制而不被機(jī)體內(nèi)、外環(huán)境中RNase 降解，在室溫和冰凍條件下均可穩(wěn)定存在，Ikeda等［14］認(rèn)為miRNA能夠在體外穩(wěn)定存在的原因之一可能是由于miRNA與蛋白共結(jié)合存在。

miR-34是一個(gè)保守的miRNA家族，在脊椎動(dòng)物中，由3個(gè)同源miRNA分子組成miR-34a，miR-34b和miR-34c。成熟miR-34a序列位于其主基因原初轉(zhuǎn)錄本的外顯子2內(nèi)，而成熟miR-34b和miR-34c序列分別位于同一主基因原初轉(zhuǎn)錄本的內(nèi)含子1 和外顯子2 內(nèi)［15，16］。目前對(duì)miR-34基因家族的研究發(fā)現(xiàn)，miR-34a在腫瘤方面具有獨(dú)特作用，而miR-34c與雄性生殖關(guān)系密切，如miR-34c能通過(guò)Nanos2提高小鼠精原干細(xì)胞的分化［17］；在分離粗線期的精母細(xì)胞和圓形精子細(xì)胞時(shí)期miR-34c呈高度表達(dá)狀態(tài)［18］；從出生到性成熟期在小鼠的睪丸組織中含量明顯增高［1］。另外miR-34家族成員受p53 直接調(diào)控，同時(shí)其還能夠通過(guò)對(duì)某些p53活性調(diào)節(jié)基因的調(diào)控，進(jìn)而參與p53 通路的反饋調(diào)節(jié)［19-21］，而p53在睪丸組織高度表達(dá)，并與精母細(xì)胞的分裂和生精細(xì)胞的凋亡關(guān)系密切，參與精子質(zhì)量的控制［2］，提示miR-34可能通過(guò)對(duì)p53的調(diào)節(jié)而影響精子的生成、發(fā)育。Bouhallier等［2］通過(guò)研究證實(shí)了miR-34c 可調(diào)節(jié)TGIF2 和NOTCH2 基因表達(dá)，進(jìn)而改變TGFb和NOTCH通路，從而影響精子的發(fā)生和分化。miR-34b和miR-34c的初始轉(zhuǎn)錄本位于同一主基因內(nèi)，而有關(guān)miR-34b與男性生殖系統(tǒng)的研究卻鮮有報(bào)道。本研究結(jié)果表明，男性不育組精漿miR-34b表達(dá)量明顯下調(diào)，與正常對(duì)照組相比有非常顯著性差異（P＜0.01）， 通過(guò)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，男性不育患者精漿miR-34b表達(dá)量與精子密度、精子存活率、前向運(yùn)動(dòng)精子百分率均呈正相關(guān)（P＜0.05或P＜0.01）。提示miR-34b可通過(guò)某種途徑影響精子質(zhì)量，但miR-34b是否與p53、TGIF2 和NOTCH2等基因存在聯(lián)系尚需進(jìn)一步研究。通過(guò)繪制ROC曲線評(píng)估m(xù)iR-34b對(duì)男性不育癥的診斷價(jià)值，發(fā)現(xiàn)其曲線下面積為0.85（0.79～0.95，95%），當(dāng)選擇最佳診斷截?cái)嘀?.66×10-2時(shí)，其敏感度為95.00%，特異度為70.00%，盡管目前的研究結(jié)果在實(shí)際的臨床應(yīng)用中價(jià)值有限，但可提示精漿游離miR-34b有望成為男性生殖能力評(píng)估的生物學(xué)分子，為進(jìn)一步研究其在不同原因引起的男性不育癥的診斷、療效觀察以及預(yù)后評(píng)估中提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

miRNA作為一個(gè)關(guān)鍵因素可以決定生殖細(xì)胞的功能及命運(yùn)，通過(guò)細(xì)胞間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)既可以維持未分化生殖細(xì)胞的數(shù)量，又可以促進(jìn)精子形成過(guò)程中的細(xì)胞分化［22］。本實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)精漿miR-34b在常溫及-80℃冰箱保存條件下能夠穩(wěn)定存在，并且精漿miR-34b差別表達(dá)于男性不育癥患者與正常人，并與精子濃度、前向運(yùn)動(dòng)精子百分率和精子存活率在顯著相關(guān)性，同時(shí)在診斷男性不育癥方面亦顯示出較好的臨床診斷價(jià)值，為精漿miR-34b能夠成為臨床診斷指標(biāo)提供了可能。但本研究?jī)H進(jìn)行了精漿miR-34b與男性不育的表達(dá)關(guān)系，關(guān)于其如何影響男性不育癥的發(fā)生以及疾病發(fā)展過(guò)程中相關(guān)作用機(jī)制和網(wǎng)絡(luò)還有待進(jìn)一步研究。

參 考 論 文

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（2015-04-15收稿）

The expression of free miR-34b in seminal plasma of male infertility and its signifi cance*

Lou Jiangtao， Wei Renxiaong**， Yu Liangliang， Zhang Xiaoxia， Cui Yun
Laboratory of Andrology， Ningbo TCM hospital affi liated to Zhejiang Chinese medicine university， Ningbo 315012，China

Wei Renxiaong， E-mail: nbxiaowei @163.com

Objective To study the stability of seminal plasma free miR-34b under different conditions in vitro and explore the relationship between miR-34b and semen parameters of male infertility. Methods Eight semen samples with normal parameters were collected， and the stability of the miR-34b at room temperature and -800C was analyzed respectively by time-course. Total of 80 semen samples of male infertility and 20 semen samples of healthy male were collected in the study. The relative expression of seminal plasma free miR-34b was detected by real-time PCR. Routine semen parameter analysis was performed by computer-assisted sperm analysis system. Sperm survival rate and sperm morphology were assayed by hypo-osmotic swelling test and Diff-Quick staining respectively. Analysis differences of semen parameters and miR-34b expression was done between male infertility group and normal control group， and the diagnostic value of seminal plasma free miR-34b in diseases of male infertility was evaluated by ROC curve， the correlation betweenmiR-34b and semen parameters was analyzed by Pearson linear correlation. Results There was no obvious change in the relative expression of seminal plasma free miR-34b between room temperature and -800C （F=0.13， P=0.97； F=0.35， P=0.84）. Compared with that of the normal group， seminal plasma miR-34b expression significantly decreased in male infertility group （t=3.77， P＜0.01）， In addition， there were signifi cant differences in sperm density， sperm living rate， progressive and sperm morphology between two groups （P＜ 0.01）. ROC curve indicated that miR-34b can better distinguish male infertility from healthy controls， and the area under the curve were 0.85 （0.79-0.95，95%）. Pearson correlation analysis showed that seminal plasma miR-34b expression was positively correlated to sperm density（r=0.28， P＜0.05）， sperm living rate （r =0.41，P＜0.01）， progressive （r =0.41， P＜0.01）， respectively. but no correlation to sperm morphology（r =0.15， P＞0.05）. Conclusion Seminal plasma miR-34b is stabilitly at room temperature and can be long-term preservated at low temperature， its' expression decreased in male infertility group， and positively correlated to sperm density， living rate， progressive， but no correlation to sperm morphology.

infertility， Male； MicroRNAs； ROC curve

10.3969/j.issn.1008-0848.2015.09.005

R 698.2

資助: 浙江省中醫(yī)藥基金項(xiàng)目（2014ZA100）

**通訊作者， E-mail: nbxiaowei @163.com