孫 博 馬 婧 鄧佩佩 陳拽生 王樹松,**

1.河北醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院（石家莊 050017）；2.河北省生殖健康科學(xué)技術(shù)研究院（國家衛(wèi)健委計(jì)劃生育與優(yōu)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/河北省生殖醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）（石家莊 050051）

硒是人體內(nèi)一種必需的微量元素，它以硒代半胱氨酸的形式結(jié)合到蛋白質(zhì)中形成硒蛋白，在維持人體新陳代謝中發(fā)揮必要的作用[1]。雖然在人體內(nèi)硒的含量很少，但它對于各種生物學(xué)功能至關(guān)重要，硒攝入量過多或過少都會不同程度地引起人體生理的異?；虬l(fā)生疾病。硒在男性生殖系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用，硒能促進(jìn)睪酮合成并參與精子的發(fā)生及成熟等過程。硒可通過參與各種抗氧化酶的構(gòu)成和激活，增加體內(nèi)抗氧化能力，保護(hù)精子免受活性氧（ROS）的損傷，提高男性精液質(zhì)量[2]。男性不育癥一般認(rèn)為夫婦未采用任何避孕措施同居生活1年以上，且因男方因素造成女方不孕者。目前男性不育患者精漿硒含量與精漿生化成分、抗氧化能力間關(guān)系的臨床研究未見報(bào)道。本研究分析了不育男性精漿中硒與血清生殖激素、精漿生化成分和氧化應(yīng)激等指標(biāo)間的關(guān)系，以期探究硒在精漿微環(huán)境中的作用，為男性不育癥臨床診療提供參考。

材料與方法

一、病例選擇

選擇2017年在本院門診就診的不育男性患者89例為研究對象。入組條件:年齡23～40歲，夫婦同居超過1年，未避孕，性生活正常，女方無不孕因素。排除條件：①有中度及重度精索靜脈曲張、無精子癥、性功能障礙、外生殖器異常、家族遺傳病史；②高溫或接觸有毒、有害物質(zhì)等有可能影響精子發(fā)生的職業(yè)；③患有感染性疾病及其它全身性疾??；④長期服用微量元素藥物或保健食品者。研究對象兩次（及以上）留取精液檢測相關(guān)指標(biāo)，根據(jù)患者精漿硒濃度三分位法分組：低硒組（＜36.15μg/L）30例，中硒組（36.15-55.62μg/L）30例，高硒組（＞55.62μg/L）29例。

二、精液參數(shù)檢測

所有研究對象禁欲2～7天行手淫法取精，留于無菌取精杯中，按照WHO《人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊》（第5版）。所有精液標(biāo)本經(jīng)離心10min，3000g離心后取精漿，將精漿分裝統(tǒng)一凍存于-80℃冰箱中以待檢測。

三、精漿微量元素測定

精漿硒濃度采用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀（ICAP6000，Thermo公司）測定。

四、血清生殖激素檢測

研究對象空腹8～12h，清晨抽取外周靜脈血3～5mL置于采血管中，在室溫靜置凝固后離心分離血清，分裝統(tǒng)一凍存于-80℃冰箱中備用。用化學(xué)發(fā)光免疫法測定血清促卵泡生成素（FSH）、促黃體生成素（LH）、泌乳素（PRL）、雌二醇（E2）、睪酮（T）濃度。

五、精漿左旋肉堿（LC）、堿性磷酸酶（AKP）、鋅（Zn）、果糖、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（γ-GT）、端粒酶、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GSTs）、ROS含量檢測

采用ELISA試劑盒（上海酶聯(lián)科技有限公司）進(jìn)行測定，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，反應(yīng)終止后，用酶標(biāo)儀以450nm波長測量吸光度（OD值）。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 22.0軟件分析數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)均為正態(tài)分布，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）來表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、精液質(zhì)量比較

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三組在禁欲時間、液化時間、精液量和精子濃度間無明顯差別（P＞0.05），高硒組前向運(yùn)動百分率（PR%）顯著高于中、低硒組（P＜0.05），見表1。

表1 三組研究對象精液參數(shù)比較

二、血清生殖激素分析

與低硒組相比，高硒組血清睪酮濃度明顯升高（P＜0.05）。其它生殖激素間比較沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），見表2。

表2 研究組研究對象血清生殖激素含量比較

三、精漿生化指標(biāo)分析

與低硒、中硒組相比，高硒組精漿中LC、AKP濃度顯著增加（P＜0.05）；高、中硒組精漿中Zn含量明顯高于低硒組（P＜0.05），高硒組精漿果糖明顯高于低硒組（P＜0.05），見表3。

表3 研究組精漿生化指標(biāo)比較

四、精漿抗氧化水平

與低硒、中硒組相比，高硒組精漿中γ-GT、端粒酶和GSTs濃度均顯著增加（P＜0.05）。三組精漿ROS間沒有明顯差異（P＞0.05），見表4。

表4 研究組精漿抗氧化水平比較

五、相關(guān)性分析

精漿中硒含量與血清T、精漿LC、精漿Zn、精漿AKP、精漿果糖、精漿γ-GT、精漿端粒酶和精漿GSTs含量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），見表5。

表5 精漿硒與檢測指標(biāo)的相關(guān)性分析（相關(guān)系數(shù)R）

討 論

硒是維持人體正常生理功能所必需的一種微量元素，對男性生育力的維持起到非常重要的作用[3]。硒是精子正常發(fā)生的必需微量元素，硒主要是通過硒蛋白發(fā)揮生物學(xué)作用，谷胱甘肽過氧化酶4（GPX4）和硒蛋白P（SEPP11）是在精子發(fā)生過程中兩種主要的硒蛋白。GPX4具有很強(qiáng)的抗氧化作用，可清除脂質(zhì)過氧化物和氧自由基，保護(hù)精子免受氧化損傷。GPX4存在于生精細(xì)胞發(fā)育的各個階段，是精子發(fā)生過程中不可缺少的重要成分[3]。SEPP11主要是由肝臟合成的硒運(yùn)輸?shù)鞍祝琒EPP11與睪丸支持細(xì)胞上的相應(yīng)受體結(jié)合后將硒轉(zhuǎn)入，為精子發(fā)生所需的GPX4以及其他硒蛋白提供原料[4]。meta分析顯示，男性不育癥患者精漿硒含量降低，膳食補(bǔ)硒可以提高精漿硒含量[5]。有研究表明，當(dāng)機(jī)體攝入硒減少時，GPX4和SEPP11含量明顯降低，精子濃度和活力降低，精子畸形率升高，膳食中添加硒后可提高精液質(zhì)量，減輕精子損傷[6]。Morbat等[7]發(fā)現(xiàn)不育男性補(bǔ)充硒，可有效提高精子活力和精子濃度。本課題組前期的研究表明，隨著精漿硒濃度升高，精子活力增加，精漿抗氧化作用增強(qiáng)；精漿硒協(xié)同其它微量元素和生化物質(zhì)調(diào)控生殖微環(huán)境[8]。

硒在調(diào)節(jié)男性睪酮合成中發(fā)揮著重要作用。睪酮是男性體內(nèi)最主要的雄激素，它主要由睪丸間質(zhì)細(xì)胞合成。硒在整個生殖系統(tǒng)都有分布，且睪丸硒含量最高。硒能夠有效地清除睪丸組織內(nèi)產(chǎn)生的氧化應(yīng)激性物質(zhì)，保護(hù)睪丸間質(zhì)細(xì)胞免受氧化損傷，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和凋亡相關(guān)基因的表達(dá)[9]。硒能夠激活Extracellular Signal-regulated protein Kinase，ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，提高類固醇合成急性調(diào)節(jié)蛋白、膽固醇側(cè)鏈裂解酶和17-羥基類固醇脫氫酶的表達(dá)，從而增強(qiáng)間質(zhì)細(xì)胞睪酮生成[10,11]。本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)硒含量增加時，血清睪酮濃度升高；相關(guān)性分析表明精漿硒含量和血清睪酮水平呈顯著正相關(guān)。此外，張鳳鳳等[12]研究發(fā)現(xiàn)，少弱精子癥患者血清硒、精漿硒含量均明顯低于精液質(zhì)量正常男性，兩組患者精漿硒與血清硒均呈顯著的正相關(guān)。說明臨床補(bǔ)硒可以促進(jìn)睪酮的分泌，為不育男性患者補(bǔ)硒提供了依據(jù)。

精液是由精子和精漿兩大部分組成，精漿為精子提供營養(yǎng)和能源以及適宜的生存環(huán)境。精漿是由前列腺液、精囊液、附睪液和尿道球腺分泌的少量液體組成，精漿中生化成分的變化能反映男性生殖系統(tǒng)中附屬性腺的功能。精漿左旋肉堿和果糖主要與能量代謝相關(guān)，精漿左旋肉堿主要由附睪分泌，可轉(zhuǎn)運(yùn)脂肪酸進(jìn)入線粒體進(jìn)行氧化分解，為精子代謝提供能量，當(dāng)附睪發(fā)生炎癥時，精漿中左旋肉堿含量會下降，可導(dǎo)致精子存活率和活力下降[13]。精漿果糖是精子的主要供能物質(zhì)，其含量可用于判斷精囊腺功能，當(dāng)精囊發(fā)生炎癥或發(fā)育不全時，精漿果糖含量下降。精漿Zn主要來源于前列腺，是評估前列腺功能的最可靠的指標(biāo)之一，當(dāng)前列腺發(fā)現(xiàn)炎癥或癌變時，精漿鋅中含量明顯降低[14]。精漿AKP主要來自附睪，主要在調(diào)節(jié)精子獲能方面發(fā)揮作用，精漿中AKP可防止精子在射精之前獲能，提高受精能力[15,16]。本研究中發(fā)現(xiàn)，精漿中硒含量升高時，精漿LC、Zn、AKP和果糖的含量也同時升高，精漿中硒含量與精漿中LC、Zn、AKP和果糖含量具有相關(guān)性。結(jié)果表明，隨著精漿中硒含量增加，不育男性生殖系統(tǒng)中附屬性腺功能得到提高。

精液中抗氧化作用與精子功能和受精能力有關(guān)，精漿被認(rèn)為是保護(hù)精子細(xì)胞免受氧化損傷的抗氧化劑的主要來源?？寡趸到y(tǒng)通過酶法和非酶法消除ROS，以維持細(xì)胞中穩(wěn)定的過氧化物含量。本研究所檢測的γ-GT和GSTs均是GSH代謝過程中的關(guān)鍵酶，能反映精漿抗氧化水平。其中γ-GT為谷胱甘肽（GSH）代謝的關(guān)鍵酶，在保護(hù)精子免受氧化應(yīng)激損傷和對抗自由基中發(fā)揮重要作用[17,18]。Burnham等[19]發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)充硒可顯著提高γ-GT的含量，提高抗氧化水平。本研究發(fā)現(xiàn)高硒組患者精漿中γ-GT含量最高，硒與γ-GT含量呈正相關(guān)。GSTs是參與GSH結(jié)合反應(yīng)過程中關(guān)鍵酶[20]，GSTs可通過催化細(xì)胞外的GSH消除親電子化合物，從而防止精子質(zhì)膜過氧化，提高精液質(zhì)量[21,22]。硒可直接增加GSTs的產(chǎn)生，提高機(jī)體抗氧化能力[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，男性不育患者精漿中硒含量與精漿γ-GT和GSTs含量呈正相關(guān)。因此，男性不育患者精漿中硒濃度增加，可提高精漿抗氧化能力，發(fā)揮對精子的保護(hù)作用。

在男性生殖系統(tǒng)內(nèi)，端粒酶主要表達(dá)在增殖分化能力很強(qiáng)的生精細(xì)胞中，端粒酶含量與精子數(shù)量間存在相關(guān)性[24]。硒通過抗氧化作用保護(hù)生精細(xì)胞中端粒免受氧化損傷，維持端粒酶的活性，促進(jìn)生精細(xì)胞不斷分裂，從而促進(jìn)精子發(fā)生[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，男性不育患者精漿中硒含量與精漿端粒酶含量呈正相關(guān)。提示硒可通過其抗氧化作用來促進(jìn)端粒酶的表達(dá)，進(jìn)而提高精液質(zhì)量。

硒是人類的必需元素，人體含量與一些疾病的發(fā)生間存在著U型曲線，硒過高或過低都會造成損傷。Zhou等人[6]研究發(fā)現(xiàn)，飲食中硒含量過高會導(dǎo)致大鼠睪丸中GPX4 mRNA表達(dá)水平降低，精液質(zhì)量下降。硒在人體內(nèi)從有益到有害的閾值較低，僅差1～2個數(shù)量級，因此對體液硒濃度的監(jiān)測尤為重要。根據(jù)現(xiàn)有資料，血液硒的適宜范圍應(yīng)為80～120μg/L，輕度低于上述值（60～80μg/L）和輕度高于上述值（120～140μg/L）為亞適狀態(tài)，血硒含量嚴(yán)重低于上述值（＞60μg/L）的低硒人群或者嚴(yán)重高于上述值（＜140μg/L）的高硒人群都易導(dǎo)致一系列疾病的發(fā)生[26,27]。所以臨床補(bǔ)硒時，需要根據(jù)膳食中硒含量和人體內(nèi)的血硒水平，對補(bǔ)硒量及持續(xù)時間進(jìn)行考慮，及時監(jiān)測血漿硒和精漿硒含量，防止補(bǔ)硒不當(dāng)造成的危害。

綜上所述，男性不育患者精漿中硒含量與血清睪酮水平、精漿生化水平、氧化應(yīng)激水平存在明顯的相關(guān)性，硒含量與精漿微環(huán)境密切相關(guān)，提高精漿硒含量改善不育男性精液質(zhì)量，為男性不育癥臨床補(bǔ)硒提供了依據(jù)。雖然臨床補(bǔ)充營養(yǎng)素有益于男性不育的治療，但男性不育的原因復(fù)雜，臨床補(bǔ)硒需要開展精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)研究，重點(diǎn)研究硒對男性生殖作用的臨床生物標(biāo)志物，特別是臨床補(bǔ)硒的劑量、持續(xù)時間和療效評價(jià)等，需要多中心大樣本量的臨床觀察進(jìn)行驗(yàn)證。